Taq Man实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用

根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成引物和探针,优化反应条件,建立实时定量荧光PCR方法.实验结果表明,当50 pmol/L的引物O.3μL和5 pmol/L的探针0.5μL时,反应体系获得的CT值较小,而荧光强度增加值最大;制作的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系;可检测到相当于20拷贝/μL的病毒DNA;与猪细小病毒、圆环病毒和猪瘟病毒等不发生交叉反应;敏感性比常规PCR电泳检测高约100倍.该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点.     

猪细小病毒Eva Green荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪细小病毒(PPV)的快速检测方法,本研究设计了一对针对PPV VP2基因的特异性引物,建立了检测PPV的Eva Green荧光定量PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果表明该方法在104拷贝/μL~108拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系;病毒最低检出量为50拷贝/μL,敏感性比常规PCR电泳检测高约100倍;与猪伪狂犬、猪圆环和猪瘟病毒等不发生交叉反应;批内及批间变异系数均小于5%。该方法可以用于PPV的定量检测或临床样品的快速检测。     

鸡传染性喉气管炎病毒TaqMan real-time PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)TaqMan Real-time PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的ILTV gB基因序列设计了2对引物与一条特异性TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件的优化,特异性、敏感性以及重复性试验,证明该方法在核酸含量108拷贝/μL～101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;能够检测初始模板中10-3EID50的病毒核酸及16拷贝的标准品;与其它相关的鸡源病毒均无交叉反应,并且批内、批间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。该检测方法的建立为ILTV的临床检测和定量分析提供了一种快速、准确的技术手段。     

猪流行性乙型脑炎病毒纳米PCR检测方法的建立

根据猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)E基因的保守区域设计1对扩增270bp片段的特异性检测引物,将纳米金颗粒添加到PCR反应体系中,同时优化反应条件,建立了高效、灵敏的纳米PCR检测方法。采用该方法灵敏度可达3.26×10~2拷贝/μL,普通PCR方法仅为3.26×10~4拷贝/μL,且与其他病毒没有交叉感染。试验结果表明,该纳米PCR检测方法不仅特异性好,而且其敏感性是普通PCR检测方法的100倍。采用纳米PCR方法和普通PCR方法对临床送检的32份样品进行检测,检测结果纳米PCR检出2份阳性样品,普通PCR检测均为阴性。     

基于QIAxcel毛细管凝胶电泳分析系统的7种猪病毒检测方法的建立与初步应用

为建立同时检测7种常见猪病毒的毛细管凝胶电泳方法,本研究针对猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及非洲猪瘟病毒保守基因,设计7对特异引物,并在引物的5'端加入一段非同源性标签序列,再设计一对可识别标签序列的通用引物。经反应条件优化,建立了一种基于QIAxcel毛细管凝胶电泳分析系统的7种猪常见病毒多重PCR检测方法。该方法与O型猪口蹄疫病毒(FMDV-O)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等均无交叉反应,特异性强;所建立方法对7种病毒质粒标准品的检测下限分别为4.56×103拷贝/μL、6.35×103拷贝/μL、1.98×103拷贝/μL、1.32×104拷贝/μL、3.21×103拷贝/μL、4.51×103拷贝/μL、3.37×103拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示各靶条带数值间的变异系数均小于1%,该方法稳定,重复性高。该方法对65份临床样本检测结果与国标或行标单一PCR检测方法相比,二者对单一病原和混合病原检测的一致性分别为94.3%(33/35)、77.7%(14/18)。本研究建立的方法为毛细管凝胶电泳技术在动物疾病病原检测中的应用提供一定的参考。     

鸡贫血病毒Taq Man探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡贫血病毒(CAV)基因序列,选取一段高度保守的基因序列作为目的片段设计引物与探针,将该目的片段克隆到pMD18-T载体中,作为阳性标准品.通过优化荧光定量PCR反应条件,建立了CAV的荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到10个病毒拷贝/μL,与其他禽病病毒无交叉反应,批间与批内重复试验相关系数都小于5%.实验数据证明该检测方法敏感性高,特异性好,重复性佳.     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×10²拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是10²～10⁹拷贝/μL,且具有良好的重复性。     

猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×10⁸至2.0×10²拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。     

犬细环病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬细环病毒(TTCV)的快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的TTCV ORF7基因设计合成一对特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了检测TTCV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法 Ct值与标准品模板在5.82×10~9拷贝/μL~5.82×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该检测方法仅对TTCV检测为阳性,而对狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬副流感病毒均无特异扩增;该检测方法灵敏度可达5.82×103拷贝/μL。对27份犬血清样品检测结果显示,建立的荧光定量PCR阳性检测率为11.11%,而普通PCR方法检测阳性率为3.7%。本实验建立了TTCV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,对TTCV诊断及致病机制的研究提供了高通量的定量检测方法。     

塞尼卡谷病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏的塞尼卡谷病毒(SVV)检测方法,本研究针对病毒基因保守区域设计了一对引物和探针,并优化反应条件,建立了检测SVV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在2.8×107拷贝/μL~2.8×10~1拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该方法与口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒均无交叉反应;检测灵敏度可达2.8拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR;批内和批间的变异系数为1.73%~4.00%,具有良好的稳定性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法可以用于SVV的检测,还可以作为诊断技术储备,应对我国未来可能出现流行的猪原发性疱疹病。