成年犬睾丸支持细胞体外分离培养的研究

为了研究犬睾丸支持细胞体外生长和生物学特征,试验采用组织培养法和酶消化法分离该细胞,并通过H.E.染色、油红O染色和AKP染色对细胞进行鉴定。结果表明:组织培养法和酶消化法均获得了成年犬睾丸支持细胞,细胞增殖活力旺盛;H.E.染色可见睾丸支持细胞呈长梭形或不规则的多边形,有3~4个突起,胞质呈浅红色;油红O染色可见支持细胞的胞质中存在脂滴,被染成桔红色,而细胞核不着色。将支持细胞与生殖细胞共培养,精原干细胞可以贴附于支持细胞表面进行体外增殖,而难以直接贴于皿底生长。AKP染色可见精原干细胞呈AKP阳性,而支持细胞呈阴性。说明成年犬支持细胞可以在体外进行培养,具有其他物种支持细胞共有的一些生物学特征。     

血清和饲养层对水牛精原干细胞体外培养的影响

本研究首先将水牛睾丸经二步酶消化法制成单细胞悬液,依次采用差速贴壁法和Percoll不连续密度梯度离心法分离和纯化精原细胞。在制备好的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,采用含2．5％血清的培养液对精原细胞进行体外培养,观察血清和成纤维细胞对精原细胞生长的影响,并在体外成功培养了2周通过提取体外培养精原干细胞总FZNA,设计引物并对其进行基因鉴定和免疫细胞化学鉴定,证实体外培养所得的细胞仍保持有精原干细胞的特性,并且该克隆是处在未分化状态的精原干细胞形成的。上述研究可为体外建立水牛精原干细胞长期培养体系提供技术支撑。     

以KnockoutTM SR无血清培养基培养小鼠精原干细胞的研究

精原干细胞(SSCs)是睾丸内具有自我复制和分化为精子潜能的干细胞,它的体外培养是精子发生机理研究和制作转基因动物等的新途径[1-2]。近几年的研究表明,SSCs在体外的自我增殖需要胶质细胞源神经营养因子(GDNF)和饲养层细胞等的支持[3-10],并且睾丸支持细胞和血清均可导致培养的     

睾丸支持细胞的功能、分离纯化及鉴定研究进展

支持细胞对维持精子形成过程中的微环境起决定作用,它可以通过分泌功能、细胞间连接形成的血睾屏障功能以及吞噬功能等来促进精子的形成过程,其发育异常会导致不同程度的雄性生殖缺陷。基于支持细胞在雄性动物生殖过程中的作用,体外培养高纯度支持细胞可成为研究睾丸两大核心功能-精子发生和性激素分泌功能相关调节机制重要的细胞模型。此外,体外培养睾丸支持细胞也可作为生殖毒理学等新兴热点领域的细胞模型,为评估和研究环境因素对雄性生殖的影响提供便利。因此,作者系统地归纳、总结了目前关于动物支持细胞生物功能的研究及常用的体外分离纯化、培养及鉴定方法,以期为利用动物支持细胞开展雄性生殖领域的研究提供参考。     

猪雄性生殖干细胞的分离培养及鉴定

本试验旨在探索猪雄性生殖干细胞(mGSCs)体外分离、培养的适宜条件,建立猪雄性生殖干细胞体外培养体系。采用两步酶消化法对新生小猪睾丸生殖干细胞进行了体外分离和初步的培养鉴定,并利用层黏连蛋白和明胶的不同贴壁特性,比较2种差易贴壁分选方法的富集效果,并对传代后的干细胞培养1周后进行碱性磷酸酶染色鉴定,通过免疫荧光技术检测培养细胞是否表达干细胞标志蛋白OCT-4。试验结果表明,层黏连蛋白更适用于猪生殖干细胞的富集、培养,细胞分选效率及增殖生长明显优于采用明胶分选的方法。培养的mGSCs拥有与小鼠mGSCs相同的形态、增殖及表达特征。鉴定结果显示,生长细胞克隆碱性磷酸酶染色呈阳性,支持细胞碱性磷酸酶染色呈阴性;培养的生殖干细胞克隆表达转录蛋白OCT-4,而饲养层支持细胞OCT-4抗体染色则呈阴性。结果表明培养的干细胞克隆仍保持较好的干细胞活性,保持正常的自我复制和分化潜能,初步建立了生殖干细胞培养体系。     

精原干细胞体外培养研究进展

精原干细胞（SSCs）是指位于睾丸生精小管基膜上既能自我更新维持自身群体数量恒定,又能定向分化形成精母细胞,最终形成精子的一类原始干细胞。其体外培养以及近年来兴起的移植、基因转染的深入研究,为探讨精子的发生机制、重建不育个体的精子发生、生产转基因动物提供了新的途径。文章综述了精原干细胞体外培养的研究现状,并对其体外的纯化、鉴定,以及未来的应用进行了介绍,旨在为精原干细胞的研究提供借鉴。     

精原干细胞的体外培养及其潜在治疗应用价值

精原干细胞(SSCs)能够自我更新,产生大量分化的生殖细胞并在出生以后形成精子,将遗传信息传递给下一代。因为所有雌性生殖干细胞在出生前已停止增殖,所以SSCs是成年哺乳动物唯一的生殖干细胞。将有生育能力的雄性供体睾丸细胞移植到不育症雄性睾丸细胞中,不育症的雄性可以重新进行精子发生和恢复生育能力。这项移植技术已经用来研究SSCs的生物学特性。研究发现,精原干细胞可以在小鼠的曲细精管进行复制,然后迁移,精原干细胞所需自我更新的生长因子保存在哺乳动物中。因此相信该培养技术很快会被应用于人类的精原干细胞中。本文讨论了现有的和潜在的运用移植技术和体外培养精原干细胞的方法。由于辅助的生殖技术能使精子细胞进入卵母细胞使之受精,所以在体外培养分化精原干细胞使之成为成熟生殖细胞的技术,将会促使人的临床精原干细胞的应用得到长足发展。     

新生牛睾丸生殖细胞体外培养

实验探讨牛雄性生殖干细胞的培养体系,以期为牛精原干细胞多能性的维持和诱导分化成精子的深入研究奠定基础。为此,从新生犊牛睾丸组织中分离纯化牛雄性生殖干细胞,并在LIF和EGF等不同条件下培养,观察新生牛睾丸生殖细胞在体外的生长行为。结果表明:体外培养新生牛睾丸生殖细胞能得到包括EG细胞集落在内的多种细胞集落,LIF,EGF促进EG细胞集落形成。EG细胞集落接种于无分化抑制剂的环境下培养,3 d后细胞开始分化,1周后分化为多种细胞。     

新生牛生精上皮细胞体外培养的研究

两步酶消化法制备新生牛生精上皮细胞悬液,分离纯化、鉴定精原干细胞和支持细胞,冷冻保存支持细胞。以支持细胞为饲养层探索不同培养条件下精原干细胞的增殖情况,免疫组化鉴定。结果表明:10%DMSO与0.1mol/L的海藻糖组合作为冷冻保护剂,冷冻效果较好;血清浓度为2.5%、支持细胞密度为5×105个/mL时,新生牛精原干细胞较易形成集落;精原干细胞及其集落的AKP染色和C-kit免疫组化均呈阳性。     

红景天多糖对幼鼠精原干细胞体外增殖的影响

为研究如何在体外获得更好的精原干细胞培养效果,以出生后6～8 d的小鼠为对象,应用两步酶消化法和差速贴壁法分离纯化精原干细胞.分别将浓度为100、200、300和400 ng/mL的红景天多糖加入以Sertoli细胞为饲养层的精原干细胞培养液中,以不添加红景天多糖组为对照,通过RT-PCR法和碱性磷酸酶（AP）染色鉴定细胞,MTT法研究红景天多糖对精原干细胞增殖的影响.RT-PCR和染色结果显示,分离得到的细胞为精原干细胞;MTT结果显示试验组比对照组细胞数量有显著增多（P＜0.05）,增殖率可达152％,且红景天多糖的最适添加量300 ng/mL.说明红景天多糖能显著促进小鼠精原干细胞的体外增殖.     

长链非编码RNA NEAT1对小鼠精子发生的影响

为研究长链非编码RNA NEAT1对小鼠精子发生的影响,构建针对NEAT1的干扰载体并包装慢病毒,通过将干扰慢病毒注射到成年小鼠睾丸曲细精管和定量PCR,H.＆E.染色等方法观测NEAT1对小鼠精子发生的影响。研究结果表明,NEAT1在睾丸组织和GC-1生殖细胞系中表达;成功构建CD513B-U6-NEAT1干扰载体,利用第三代慢病毒包装系统包装获得干扰慢病毒且干扰效果明显（NEAT1转录本水平下调69%）;慢病毒注射试验结果显示干扰病毒注射组睾丸指数轻微增加,有精子发生的曲细精管比例由97%减少为86%（P〈0.05）,表明小鼠精子发生受到影响,NEAT1具有维持雄性小鼠精子发生的作用。     

精原干细胞移植在家畜生产中的应用

本文阐述了精原干细胞的分离纯化、冷冻保存、移植等一系列相关研究技术 ,同时围绕国内外最新研究进展展望了精原干细胞在家畜生产上的潜在应用     

Characteristics of testicular cell development of 5‐day‐old mice in culture in vitro

The crude testicular cells (CTCs) contain many cell types, such as Sertoli cells, leydig cells, spermatogonial stem cells (SSCs), spermatocytes, and other somatic testicular cells, that secrete various growth factors needed in spermatogenesis. The objective of this study was to characterize development of 5‐day‐old mice testicular cells cultured. Crude testicular cells prepared from the testes of 5‐day‐old male mice were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium and incubated at 37°C in a 5% CO₂ atmosphere for 6 days. The results demonstrated that the testicular cells developed rapidly with a population doubling time (PDT) of 0.63 days and more than 90% of cells were viable after being cultured for 3 days. The number of Sertoli‐like cells increased significantly over days 1, 3, and 6 to 22.1%, 34.6%, and 50.1%, respectively. A significant increase was also observed in fibroblast‐like cells (15.5% on day 1 to 28.8% on day 3 and to 26.6% on day 6). In contrast, the number of spermatogonia‐like cells decreased significantly (54.3%, 30.4%, and 18.7%, on days 1, 3, and 6, respectively). These data indicated that the developmental pattern of the testicular cell in this study might be affected by the niche provided by the cultured testicular cells.     

牛精原干细胞研究进展

精原干细胞（SSCs）是雄性生殖系干细胞,位于睾丸曲细精管基底膜上,具有自我更新和定向分化的潜能,是自然状态下出生后动物体内在整个生命过程中进行自我更新并能将基因传递至子代的惟一成体干细胞.本文在阐述精原干细胞发生的基础上,通过分析犊牛精原干细胞分离纯化、培养鉴定、冷冻保存和诱导分化的现状,分析了牛精原干细胞研究领域目前存在的主要问题,展望了牛精原干细胞的应用前景,以期为精原干细胞的研究提供参考.     

犊牛睾丸支持细胞的分离与冷冻保存

以新生犊牛睾丸为实验对象,应用组合酶法进行支持细胞分离培养,并研究了冷冻保存后支持细胞的生长特性。结果表明:在细胞分离时,消化睾丸组织,分离曲细精管法所获得的细胞悬液中的有效细胞数高于组织剪碎法。支持细胞体外培养,4 h后开始贴壁,3~4 d铺满培养皿底壁,传代后细胞生长较快,2 d即可增殖一代。HE染色,胞质染色较淡,而细胞核染色较深,呈圆形或椭圆形位于细胞质中央或偏位,核仁明显。采用10%FBS+10%DMSO的DMEM液做冷冻液,对细胞进行冷冻保存时,支持细胞的复苏率在65%以上。解冻后的支持细胞体外培养,4h开始有细胞贴壁,24h后大部分细胞贴壁,3~4d铺满培养皿底壁。     

白消安对睾丸的毒害作用及机制探讨

白消安（busulfan）对精子发生具有较强毒害作用,可导致雄性不育,是制备精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）移植受体的理想药剂。睾丸炎对生精机能也有重要影响,甚至能导致雄性不育。然而,白消安损害血睾屏障（blood-testis barrier,BTB）,影响精子发生的机制尚不清楚,尚不知其是否会导致非传染性睾丸炎症,并影响细胞因子分泌,损害生育能力。因此,本文综述了白消安对BTB的破坏作用、对睾丸细胞相关功能蛋白的影响,以及白消安损伤睾丸的缓解方法,以深入揭示白消安对睾丸细胞和BTB功能与结构的毒害作用,为研发高效安全的SSCs移植受体制备技术,以及化疗药物治疗和环境毒素作用下生精机能科学防护与恢复提供科学参考。     

精原干细胞研究进展

精原干细胞是雄性哺乳动物精子发生过程的起始细胞,是一群具有自我更新和分化潜能的细胞。自大鼠精原干细胞异体移植获得成功以来,精原干细胞一直是干细胞研究的热点。本文根据国内外相关研究进展,对精原干细胞的生物学特性、功能调控因子、体外培养和移植等作一综述。