绵羊精原干细胞的分离纯化与鉴定

旨在探究一种简便高效的绵羊精原干细胞(SSCs)分离纯化方法,为后续研究SSCs奠定基础。本实验采用两步酶消化法对4月龄的绵羊睾丸进行消化处理,获得单细胞悬液。将睾丸细胞接种于0.2%的明胶预处理培养皿中,根据各细胞贴壁能力和速度的不同将SSCs纯化,并在纯化后用SSCs特异标记分子PLZF进行免疫荧光鉴定。结果表明,经免疫荧光染色得出存在PLZF阳性信号。这说明采用两步酶消化和差异贴壁法可以得到纯度较高的SSCs。     

血小板衍生生长因子和表皮生长因子对山羊SSCs凋亡相关基因的影响

为了研究表皮生长因子和血小板衍生生长因子-BB对山羊SSCs中凋亡相关基因的影响,本研究将60~75日龄的山羊睾丸(n=6)剪碎后,利用两步酶消化法得到睾丸单细胞悬液,然后通过两次差速贴壁法分离纯化山羊SSCs,并采用免疫荧光染色法对山羊SSCs进行鉴定。随后,单独或联合添加EGF和PDGF-BB,体外培养山羊SSCs 6d,运用real time PCR技术检测不同处理组中BAD、BCL2和BAX基因的相对表达量。结果表明,睾丸单细胞悬液经两次差速贴壁纯化后,能够获得纯度较高的SSCs。染色结果显示,纯化后的细胞大量表达SSCs的标记分子THY1和PLZF。与对照组相比,3个试验组的BCL2基因表达量均上调。其中,联合添加20ng/mL PDGF-BB+25ng/mL EGF处理组的中细胞的抗凋亡能力显著高于其他组(P0.05),25ng/mL EGF组的BCL2表达水平显著高于对照组(P0.05),然而20ng/mL PDGF-BB组中的抗凋亡基因BCL2表达水平与对照组相比差异不显著(P0.05);与其他所有试验组相比,对照组的促凋亡基因BAX和BAD的表达水平显著升高(P0.05),而试验组之间差异均不显著(P0.05)。     

生精胶囊促进小鼠精原干细胞增殖的研究

为了探讨体外促进小鼠精原干细胞(SSCs)增殖的可行性,试验取7～8日龄雄性乳鼠睾丸,分离、纯化SSCs并分别接种于普通培养液、神经营养因子(GDNF)培养液和生精胶囊提取液的培养液内进行增殖培养,观察小鼠SSCs的生长状况.结果表明:将SSCs接种于普通培养液3 d后,出现了增殖现象,可见增殖培养产生SSCs克隆,并...     

精原干细胞的体外培养及其潜在治疗应用价值

精原干细胞(SSCs)能够自我更新,产生大量分化的生殖细胞并在出生以后形成精子,将遗传信息传递给下一代。因为所有雌性生殖干细胞在出生前已停止增殖,所以SSCs是成年哺乳动物唯一的生殖干细胞。将有生育能力的雄性供体睾丸细胞移植到不育症雄性睾丸细胞中,不育症的雄性可以重新进行精子发生和恢复生育能力。这项移植技术已经用来研究SSCs的生物学特性。研究发现,精原干细胞可以在小鼠的曲细精管进行复制,然后迁移,精原干细胞所需自我更新的生长因子保存在哺乳动物中。因此相信该培养技术很快会被应用于人类的精原干细胞中。本文讨论了现有的和潜在的运用移植技术和体外培养精原干细胞的方法。由于辅助的生殖技术能使精子细胞进入卵母细胞使之受精,所以在体外培养分化精原干细胞使之成为成熟生殖细胞的技术,将会促使人的临床精原干细胞的应用得到长足发展。     

以KnockoutTM SR无血清培养基培养小鼠精原干细胞的研究

精原干细胞(SSCs)是睾丸内具有自我复制和分化为精子潜能的干细胞,它的体外培养是精子发生机理研究和制作转基因动物等的新途径[1-2]。近几年的研究表明,SSCs在体外的自我增殖需要胶质细胞源神经营养因子(GDNF)和饲养层细胞等的支持[3-10],并且睾丸支持细胞和血清均可导致培养的     

热应激下公兔睾丸组织形态和精液转录组分析

旨在深入了解公兔在热应激环境中睾丸组织形态改变及相应基因谱，对揭示热应激下公兔精液质量下降的机理具有重要意义。本研究选取了6只具有相同饲养水平，体况和体重相近的8月龄新西兰种公兔，通过建立热应激模型得到热应激组(8月份，HS)和未热应激组(5月份，NHS)各3只，分别采集2组公兔的睾丸和精液。通过HE染色，比较不同条件下睾丸组织结构的差异，并利用Illumina Hiseq高通量测序技术对精子进行转录组测序分析，通过生物信息学方法对2组样本间的差异表达基因进行GO、KEGG富集分析，并通过RT-qPCR方法验证转录组测序数据。公兔睾丸组织切片结果显示，与NHS组相比，HS组的睾丸中央出现明显的空泡化和撕裂，生精上皮较薄，受损情况显著，精子细胞数量下降。进一步以■和P<0.05为阈值，共筛选出与精子热应激响应相关的差异表达基因1 676个，包括ATP5MC1、MDH2、ALDH7A1、GAPDHS、PRPS1等，其中上调基因894个，下调基因782个。GO分析结果显示，差异表达基因富集在应激反应、蛋白质代谢过程、催化活性等相关条目上，KEGG结果显示，差异表达基因富集到MAPK、P...     

不同月龄阶段陕北白绒山羊生精细胞发育规律研究

为研究陕北白绒山羊生精细胞发育规律,取1月龄、3月龄、6月龄及成年陕北白绒山羊睾丸组织,HE染色观察睾丸发育情况。结果表明:(1)随着年龄的增长,曲细精管直径显著增大(P0.05),6月龄达到150.72μm,略低于成年羊(161.94μm)(P0.05)。(2)细胞层数随年龄的增长而增长,6月龄达到7.70层,显著高于1月龄和3月龄(P0.05)。曲细精管横截面细胞总数随年龄增长而增长,6月龄和成年绒山羊曲细精管横截面细胞总数显著高于1月龄和3月龄绒山羊(P0.05)。(3)3月龄陕北白绒山羊曲细精管中精原细胞最为丰富,占总细胞数的46.40%,明显高于1月龄(33.10%)、6月龄(9.10%)和成年羊(7.60%)(P0.05)。(4)精原干细胞标记基因(CD49f、PLZF、Thy1、ETV5、VASA、Oct4、Nanog、Nanos2)均在3月龄睾丸中高表达,其中Oct4、PLZF、Thy1、ETV5、VASA、Nanog及Nanos2显著高于1月龄、6月龄及成年羊(P0.05)。研究结果表明,6月龄陕北白绒山羊已经达到性成熟;与1月龄、6月龄和成年羊相比,3月龄陕北白绒山羊睾丸组织含有更加丰富的精原细胞。     

动物精原干细胞体外培养研究进展北大核心

精原干细胞(SSCs)作为成体干细胞之一,可将遗传信息向子代传递,在雄性动物的精子发生过程中起到至关重要的作用。根据SSCs的生物学特征并通过有效的细胞分离手段将睾丸中的SSCs进行分离,进一步纯化并体外培养,才能更加深入地研究其相关机制。随着测序技术及基因编辑技术的发展和成熟,对于SSCs的研究手段和应用范围也在不断扩展。因此,文章主要对SSCs的生物学特征、鉴定、分离、纯化、体外培养以及与SSCs研究中联合使用的新技术进行了总结,以期为SSCs体外培养方法选择及其相关研究提供参考。     

GDNF对体外培养小鼠精原干细胞增殖的影响

为了研究胶质细胞原性神经营养因子(GDNF)对体外培养小鼠精原干细胞增殖与分化的影响,试验采用差速贴壁法分离小鼠精原干细胞(SSCs)和支持细胞(sertoli),以sertoli为饲养层接种精原干细胞,用免疫荧光染色法对精原干细胞进行鉴定,并将精原干细胞分为2组,试验组培养基中加入GDNF,对照组不加,测定精原干细胞的生长增殖情况,检测精原干细胞生长周期。结果表明:共培养6,9,12,15天时,试验组精原干细胞吸光度值明显高于对照组(P<0.05或0.01)。随着共培养时间的延长,试验组精原干细胞S期染色质含量逐渐增多,然后又逐渐下降,开始另一个分裂周期;与试验组比较,对照组精原干细胞S期染色质含量增长缓慢(P<0.05)。说明GDNF能促进体外分离培养的小鼠精原干细胞的更新增殖。     

褪黑素的添加减轻猪精原干细胞的氧化损伤

旨在研究褪黑素（melatonin,MT）对体外培养猪精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）的作用机制。本研究采集3头7日龄健康大白公猪睾丸,利用差速贴壁法获得SSCs。后经形态学观察、碱性磷酸酶染色、标记基因检测及免疫荧光染色鉴定后以SSCs作为试验材料,设置MT浓度梯度（0、50、250、500、1 000 μmol·mL^-1）组处理SSCs,每组设3个重复（n=3）,空白对照组加入0.1% DMSO处理,分别检测添加MT后猪SSCs的细胞活力、活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平、谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量及凋亡基因表达变化。结果显示：1）分离的克隆团细胞具有SSCs的生长特性,可被碱性磷酸酶染色并表达干细胞标志基因OCT4、SOX2和SSCs标志基因NANOG、PLZF、UCHL1;2）50 μmol·mL^-1以上的MT在处理48 h后可显著提高SSCs的细胞活力（P<0.05）;3） MT可显著降低猪SSCs内ROS水平（P<0.05）,极显著增加细胞内GSH含量（P<0.01）;4） MT可显著抑制猪SSCs内凋亡蛋白Bax和Caspase3的表达（P<0.05）。MT具有清除猪SSCs中的ROS,提高总GSH含量,抑制凋亡基因表达进而提高细胞活力的作用,可为养殖过程中提高公猪繁殖性能提供参考。     

奶山羊睾丸组织冷冻保存及复苏后精原干细胞的分离培养

以关中奶山羊为材料,比较了2种玻璃化冷冻法和1种慢速冷冻法对睾丸组织保存的效率,复苏后发现3种冻存方法均有较高的成活率(超过50%),其中玻璃化Ⅱ组达65%以上,培养及检测后均有精原干细胞存活,在体外培养可以形成胚胎干细胞样克隆,其表达精原干细胞和多能性干细胞的相关特异性标记:碱性磷酸酶(AP)、CD49f、CD133、C-Myc、Oct4和Klf4阳性,证明睾丸组织冷冻可以提供一种有效的奶山羊精原干细胞的保存方法。试验中所使用的低温保存方法简便易行,效果良好,表明这些方法可为癌症治疗等造成的无精症及少精症等不育症患者的医治以及一些珍稀濒危物种和优良畜禽的生殖细胞保存提供一种简捷有效的途径。     

睾丸支持细胞可促进鸡精原干细胞体外增殖

正扬州大学的研究人员比较了层黏连蛋白、纤维连接蛋白、胶原蛋白以及睾丸支持细胞4种不同培养系统对鸡精原干细胞(SSCs)体外增殖的作用效果。采用三酶两步消化法分离SSCs,细胞经明胶差速纯化后培养,将传至3代的SSCs重新接种于层黏连蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白包被的培养皿中以及睾丸支持细胞制备的饲养层上,通过形态学、5-乙基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)细胞增殖、qRT-PCR技术检测不同培养系统对鸡精原干细胞体外增殖的作用效果。结果表明:三组基质蛋白及睾丸支持细胞都能够促进鸡SSCs的体外     

睾酮诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

试验旨在探讨睾酮对鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的诱导作用效果。首先对睾酮的适宜诱导浓度进行筛选,再联合支持细胞和维甲酸(RA)对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测。结果表明:单独使用睾酮诱导,未出现精原干细胞(SSCs)样细胞;睾酮与支持细胞联合诱导时,在第6天有少许类胚体出现,至第12天,有少量SSCs样细胞;睾酮联合支持细胞和RA诱导过程中,诱导第2天出现类胚体,诱导第12天后出现类SSCs样细胞。实时荧光定量PCR结果显示,睾酮+支持细胞组中,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势,Dazl、integrinβ1、Stra8表达量持续上调;睾酮+支持细胞+RA共同诱导组中,各标记基因与ESCs向生殖细胞分化过程中各基因表达的趋势一致,并且Dazl的表达量明显高于对照组。睾酮单独诱导不能使ESCs向雄性生殖细胞分化,但有促进支持细胞和RA诱导效果的作用,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础。     

小鼠生精上皮发育中支持细胞和精原干细胞的数量变化

睾丸支持细胞(Sertoli cells, SCs)和精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)发生相应变化才能维持正常精子发生。因此,探讨生精上皮发育中两者的关系对深入了解精子发生有重要意义。基于前期基础,分别取青春期前(出生后5,10 d)、青春期(15,20 d)、近性成熟(25,30 d)及性成熟后(35,40,50,70 d)的昆明雄性小鼠,采用本室已建立的曲细精管漂浮免疫荧光染色全铺片法,测量了小鼠各阶段曲细精索/管的直径;以GATA4为SCs标记、胶质细胞源神经营养因子家族受体α-1(GFRα-1)为SSCs分子标记,显示生精上皮中的SCs和SSCs并分析其数量变化。结果显示,随日龄增加其曲细精索/管直径显著增大,特别是在性成熟前;5 d小鼠的GATA4⁺ SCs数量最少,随后快速上升,15 d时达到最高且显著高于其他各阶段(P<0.05),之后呈波动下降趋势且趋于相对稳定;GFRα-1⁺ SSCs数量也随日龄增大而增多,15 d时达到最高且显著高于其他各阶段(P<0.01),随后在...     

BMAL1对小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响

实验旨在研究 BMAL1基因对睾丸间质细胞凋亡的影响。实验以小鼠睾丸间质细胞系为研究对象,使用小干扰 RNA(siRNA)抑制 BMAL1的表达,使用流式细胞术、实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹(Western Blot)检测细胞凋亡水平。结果表明:干扰组睾丸间质细胞凋亡水平显著上升(P<0.05),且伴随着促凋亡蛋白 BAX 显著上调和抑凋亡蛋白 BCL-2 表达下调(P<0.05)。结果显示,BMAL1作为核心的生物钟基因,可抑制小鼠睾丸间质细胞的凋亡。     

基于CRISPR/Cas9敲除技术研究Gata4基因在雄性小鼠睾丸发育中的功能

旨在通过CRISPR/Cas9技术研究Gata4基因在雄性小鼠睾丸中的作用机制。试验以C57BL/6小鼠为模型,通过CRISPR/Cas9技术在雄性小鼠体内敲除Gata4基因,组织学观察睾丸形态学变化,ELISA法测定雄激素相关合成酶,实时定量PCR检测相关标记基因。利用CRISPR/Cas9技术成功在小鼠体内敲除Gata4基因,通过PCR扩增、酶切计算得到基因敲除率93%;在2月龄小鼠性成熟时,通过定量PCR、HE染色和ELISA检测发现,与对照组相比,敲除组小鼠睾丸发育迟缓,明显变小,精原细胞和精子生成减少,睾丸中雄性信号通路相关基因(Stra8,Vasa,Dazl,Tnp1,Spo11,Sox9,17HSDb3,Dmrt1)表达量降低,雄激素水平显著降低。研究表明,Gata4在雄性小鼠生殖器官发育与精子生成过程中具有重要功能。     

诱导鸡胚精原干细胞向成骨细胞分化的研究

为了探讨体外培养的鸡胚精原干细胞(SSCs)的多向分化潜能,取孵化18~20 d的鸡胚睾丸,无菌获取SSCs,体外培养传代,通过地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C诱导鸡胚SSCs向成骨细胞分化,钙结节Von Kossa s法、改良的钙钴法及免疫组化法进行成骨细胞鉴定。结果显示SSCs被诱导15~21 d后分化为成骨细胞,诱导形成率为75%~80%;诱导后的细胞Von Kossa s染色可见细胞间布满黑色颗粒,提示有矿化基质沉积;改良钙钴法碱性磷酸酶染色胞浆呈深棕色或深黑色,免疫组化法染色细胞呈阳性。因此可以得出在不同的诱导条件下,SSCs体外可被定向诱导分化为成骨细胞,证明其具有多向分化潜能。     

绵羊Oct4基因启动子的表达活性分析

Oct4(POU5f1)是诱导重编程的关键性因子,为检测克隆获得的绵羊Oct4基因启动子的表达活性,本研究将前期工作中克隆获得的绵羊Oct4基因启动子与携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的p Ac GFP1-N1载体相连接,构建由Oct4启动子驱动的真核表达载体(SPOct4-p Ac GFP1-N1),并采用脂质体转染法,分别转染小鼠和绵羊成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎,以检测其表达活性。结果表明:Oct4启动子序列含有Sp1结合位点和CAAT框等功能区;转染后,小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎中检测到绿色荧光,并且在转染72 h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中未能观察到GFP的表达。说明由克隆获得的Oct4基因启动子驱动的真核表达载体具有在多能干细胞中特异的表达活性。     

精原干细胞体外培养研究进展

精原干细胞（SSCs）是指位于睾丸生精小管基膜上既能自我更新维持自身群体数量恒定,又能定向分化形成精母细胞,最终形成精子的一类原始干细胞。其体外培养以及近年来兴起的移植、基因转染的深入研究,为探讨精子的发生机制、重建不育个体的精子发生、生产转基因动物提供了新的途径。文章综述了精原干细胞体外培养的研究现状,并对其体外的纯化、鉴定,以及未来的应用进行了介绍,旨在为精原干细胞的研究提供借鉴。