血小板衍生生长因子和表皮生长因子对山羊SSCs凋亡相关基因的影响

为了研究表皮生长因子和血小板衍生生长因子-BB对山羊SSCs中凋亡相关基因的影响,本研究将60~75日龄的山羊睾丸(n=6)剪碎后,利用两步酶消化法得到睾丸单细胞悬液,然后通过两次差速贴壁法分离纯化山羊SSCs,并采用免疫荧光染色法对山羊SSCs进行鉴定。随后,单独或联合添加EGF和PDGF-BB,体外培养山羊SSCs 6d,运用real time PCR技术检测不同处理组中BAD、BCL2和BAX基因的相对表达量。结果表明,睾丸单细胞悬液经两次差速贴壁纯化后,能够获得纯度较高的SSCs。染色结果显示,纯化后的细胞大量表达SSCs的标记分子THY1和PLZF。与对照组相比,3个试验组的BCL2基因表达量均上调。其中,联合添加20ng/mL PDGF-BB+25ng/mL EGF处理组的中细胞的抗凋亡能力显著高于其他组(P0.05),25ng/mL EGF组的BCL2表达水平显著高于对照组(P0.05),然而20ng/mL PDGF-BB组中的抗凋亡基因BCL2表达水平与对照组相比差异不显著(P0.05);与其他所有试验组相比,对照组的促凋亡基因BAX和BAD的表达水平显著升高(P0.05),而试验组之间差异均不显著(P0.05)。     

睾丸支持细胞可促进鸡精原干细胞体外增殖

正扬州大学的研究人员比较了层黏连蛋白、纤维连接蛋白、胶原蛋白以及睾丸支持细胞4种不同培养系统对鸡精原干细胞(SSCs)体外增殖的作用效果。采用三酶两步消化法分离SSCs,细胞经明胶差速纯化后培养,将传至3代的SSCs重新接种于层黏连蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白包被的培养皿中以及睾丸支持细胞制备的饲养层上,通过形态学、5-乙基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)细胞增殖、qRT-PCR技术检测不同培养系统对鸡精原干细胞体外增殖的作用效果。结果表明:三组基质蛋白及睾丸支持细胞都能够促进鸡SSCs的体外     

一种简便的机械法分离绵羊睾丸间质细胞的研究

本文旨在探寻一种取代酶消化法分离绵羊睾丸间质细胞的简便新方法。首先将绵羊睾丸被膜剥离,然后将睾丸切块,采用机械震荡的方法使间质细胞自动脱落,然后用差异贴壁法进一步纯化间质细胞。试验结果表明,该方法分离绵羊睾丸间质细胞省时省力,睾丸间质细胞存活率与纯度都较高。     

小鼠输卵管上皮细胞的原代培养及纯化方法研究

建立小鼠输卵管上皮细胞原代培养及纯化方法.小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用组织块培养法和酶消化法.酶消化法于37℃分为4个处理组进行.处理1以2.5 g/L胰酶+0.4 g/L EDTA消化5、10、20 min;处理2以0.5 g/L胰酶+0.08 g/L EDTA消化35、50、75 min;处理3以0.3 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60、90、240 min;处理4以2.5 g/L胰酶+0.4 g/L EDTA和0.3 g/L Ⅰ型胶原酶(1∶2)消化60 min,150 min.原代细胞纯化采用差速贴壁和反复差速贴壁法.传代采用胰酶两步消化法进一步纯化输卵管上皮细胞.组织块法原代培养成纤维细胞生长优势明显,传代纯化细胞效果不佳.用酶消化法原代培养时,处理1效果不理想;处理2采用3个消化时间时均取得比较理想的结果;处理3消化240 min时结果较好;处理4消化150 min效果较好.原代细胞纯化,反复差速贴壁得到的上皮细胞较纯,进一步传代纯化细胞取得了理想的结果.小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用酶消化法结合反复差速贴壁分离纯化细胞,传代采用两步消化法,可以成功地进行小鼠输卵管上皮细胞的分离纯化培养.     

多浪绵羊骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及成肌诱导分化

为了在体外细胞水平模拟多浪绵羊肌肉生长发育过程,本研究以多浪绵羊为试验动物,采用胶原酶和胰酶两步酶消化法分离多浪绵羊骨骼肌卫星细胞（satellite cells,SCs）,并利用差速贴壁的方法纯化分离得到的SCs。利用免疫荧光技术检测SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的表达情况,鉴定分离得到的SCs。采用血清撤离的方法诱导SCs向成肌方向分化。通过显微镜观察和成肌分化标记基因肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）的免疫荧光,检测肌管的形成情况。通过对SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的免疫荧光鉴定,确认本研究成功分离得到多浪绵羊SCs。采用血清撤离的方法诱导SCs成肌分化,显微镜观察和MHC免疫荧光可以明显观察和检测到肌管的形成。本研究对多浪绵羊SCs成功地进行了分离和鉴定,并建立了体外培养条件下多浪绵羊SCs的成肌诱导分化。     

小鼠精原干细胞的分离纯化及初步鉴定

用两步酶消化法对昆明白小鼠睾丸精原细胞及精原干细胞进行了体外分离、纯化和初步鉴定。经两步酶消化所获细胞悬液内活细胞、死细胞及细胞团的百分比分别为97.03%、2.97%和2.95%;平均每个睾丸可获得4.53×105个细胞。Percoll不连续密度梯度离心初步纯化后得到4个细胞带,精原细胞主要分布在40%~50%Percoll梯度间,得到的精原细胞密度为3.20×106个/mL。因此,采用两步酶消化,结合Percoll不连续密度梯度离心法分离的昆明白小鼠精原细胞能满足体外培养的需要,还可以作为精原干细胞移植的研究材料。     

绵羊骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定与成肌诱导分化

试验旨在分离绵羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells，SMSCs），建立绵羊SMSCs体外分离、培养及鉴定体系，为后续研究提供种子细胞。以新生健康绵羊为试验动物，采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步酶消化法和差速贴壁法分离并纯化SMSCs。用RT-PCR和免疫荧光法鉴定SMSCs标记基因配对盒基因7（paired box 7，Pax7）、结蛋白（Desmin）和生肌调节因子1（myogenic regulatory factors 1，MyoD1）的表达情况；用血清撤离法诱导SMSCs向成肌细胞方向分化，成肌诱导后观察肌管的形成，免疫荧光法检测成肌分化特异性标志肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）的表达。RT-PCR结果显示，扩增条带与预期相符，所分离细胞表达SMSCs标记基因Pax7、Desmin和MyoD1；免疫荧光鉴定结果显示，所分离细胞表达SMSCs标记蛋白Pax7、Desmin和MyoD1；成肌诱导后镜下可见细胞相互融合形成多核的肌管，并表达成肌特异性标志MHC。本试验分离了绵羊SMSCs，建立了适用于绵羊SMSCs的体外培养体系，并成功进行了成肌诱导分化，为今后研究绵羊骨骼肌生长发育机制提供了试验材料和技术支撑。     

冷冻保存新生牛睾丸组织中支持细胞的分离纯化

睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)是生精上皮中的多功能体细胞,其分离培养对体外探讨精子发生机理至关重要。因牛新鲜睾丸组织取材不便,本试验在前期基础上探讨了从冷冻保存的新生牛睾丸组织中分离纯化SCs的可行性。将冻存的1日龄牛睾丸组织复苏,进行形态学检查和SCs分离培养。石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色显示,曲细精索及睾丸间质保存完好。二步酶消化结果显示,生精上皮解离良好。利用差异贴壁法将原代细胞纯化后扩大培养,绝大多数细胞呈不规则多边形,3d即可生长至汇合。RT-PCR分析显示,贴壁细胞表达SCs阳性分子标记胶质细胞源神经营养因子(GDNF)和雄性激素结合蛋白(ABP)而不表达精原细胞分子标记PLZF。流式细胞术检测显示,所获细胞中ABP和GDNF阳性细胞数分别为99.7%和99.8%。以上结果表明,从冻存的新生牛睾丸组织中可获高纯度的SCs。本试验结果为后续相关试验奠定了基础。     

蒙古马睾丸支持细胞的体外分离培养与鉴定

为研究一种简单快速分离蒙古马睾丸支持细胞并保证其活性的基本方法,本试验采集2岁蒙古马睾丸组织于低温环境下进行机械分离,将1~3 g睾丸组织剪碎,采用重力沉淀法去除游离的红细胞和间质细胞;使用0.1%胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶+EDTA逐步进行组织消化,并用含有10%胎牛血清的培养基进行细胞培养;在接种后采用差异贴壁法分离纯化支持细胞,使用Tris-HCl低渗法去除杂质细胞,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、HE染色、实时荧光定量PCR方法进行鉴定。结果显示,支持细胞贴壁性能较强,培养24 h后大多数细胞开始贴壁,细胞形状呈椭圆形;培养48 h后胞质增多,折光性变强;培养3~4 d细胞胞质展开紧密连接,此时细胞呈三角形,有明显的核仁,培养6~7 d细胞生长状态进入稳定期。实时荧光定量PCR结果显示,GATA4和GDNF基因在培养细胞中极显著表达（P<0.01）,AKP染色支持细胞呈阴性表达,表明分离培养的细胞确为支持细胞。本试验使用机械分离法与两步酶消化法处理组织,可快速高效地获得睾丸支持细胞,成功构建了蒙古马睾丸支持细胞体外培养方法。