1株重组类NADC34猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定与基因组特征分析

为分离天津地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)并分析其分子遗传进化关系,对来自该地区某猪场疑似PRRSV感染的样品进行RT-PCR检测,阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs),将出现细胞病变的PAMs进行有限稀释后进行间接免疫荧光鉴定,利用RT-PCR扩增分离纯化株全基因组序列并进行同源性及遗传进化分析,并对分离株进行重组分析和细胞嗜性试验。结果显示,分离获得1株PRRSV毒株(命名为TJbc2021),分离毒株不能感染Marc-145细胞;该毒株全基因组长为15 111 bp,与NADC34的核苷酸同源性最高,为95.2%,属于目前流行于中国的类NADC34 PRRSV,其Nsp2存在100个氨基酸缺失的分子特征;重组分析显示该毒株以谱系1.5毒株(NADC34-like)为主要亲本,以谱系1.8毒株(NADC30-like)为次要亲本,在14 082～14 635 nt(ORF6～ORF7)发生了基因重组。结果表明,分离并鉴定了1株重组类NADC34 PRRSV,可为该地区...     

中国新发L1A PRRSV变异株的出现与流行状况分析

2017年我国首次发现类NADC34 PRRSV，该类病毒属于L1A (Sublineage1.5)亚型。近年来，新发类NADC34 PRRSV在我国不断变异，已经成为危害我国养猪业重要的PRRSV亚型。为了确定新发类NADC34 PRRSV的流行特征，本研究从2021年～2023年37份新发类NADC34 PRRSV阳性病料样品中选择4份样品经PCR分段扩增PRRSV全基因组序列并测序，利用Seq Man软件拼接，获得了4株完整的PRRSV全基因组序列，相应的病毒分别命名为TZJ2165、TZJ2451、TZJ2756、WK621株。下载GenBank中所有中国类NADC34 PRRSV和美国L1C变异株的ORF5基因及NSP2基因序列，利用MEGA7.0构建上述PRRSV ORF5基因序列的遗传进化树，分析其遗传变异情况。利用Megalign软件分析各分支内ORF5基因序列的相似性，以及新发类NADC34 PRRSV NSP2氨基酸序列，分析其是否存在一致的氨基酸缺失特征。根据PRRSV ORF5基因的限制性片段多态性(RFLP)分类方法，对新发类NADC34 PRRSV的ORF5...     

一株重组类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组分析

为分离上海地区猪繁殖与呼吸综征病毒（PRRSV）并分析其分子遗传进化关系,对来自该地区某猪场疑似PRRSV感染病猪的2份肺样进行RT-PCR检测,阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs),将盲传3代后出现细胞病变的PAMs经间接免疫荧光鉴定,通过RT-PCR扩增分离株全基因组序列,测序后与GenBank登录的参考株全基因组序列进行同源性及遗传进化分析,分析了分离株Nsp2、GP5氨基酸序列的遗传进化关系,并对分离株做了重组分析和细胞嗜性试验。结果显示,成功分离出1株PRRSV,命名为SH2019,其全基因组开放阅读框大小为14677 bp,分离株与NADC30的核苷酸同源性最高,属于目前流行于中国的类NADC30 PRRSV,其Nsp2存在131个氨基酸缺失的分子特征;分离株是以谱系1毒株为主要亲本,以谱系3、谱系5或谱系8毒株为次要亲本,在12601~12901 nt(ORF2~ORF4)发生了基因重组的重组毒株,分离株不能感染Marc-145细胞。本研究分离鉴定一株重组类NADC30 PRRSV,可为该地区猪繁殖与呼吸综合征的防控提供参考。     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒云南株的分离鉴定及遗传变异分析

2018年云南省边境地区某猪场猪群出现高热等症状,部分猪只死亡。为确认发病原因,采集死亡猪只肺脏组织样品进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) RT-PCR检测,然后将阳性样品接种Marc-145细胞,连续传代3次后发现产生稳定的细胞病变效应(CPE)。经间接免疫荧光试验(IFA)、毒价测定及病毒全基因组测序,最终确定病原为PRRSV,将其命名为YNML-2018株,毒价测定为10^-4.88 TCID₅₀/0.1 mL。全基因组序列分析显示,YNML-2018毒株基因组全长15 357 bp,包含8个开放阅读框(ORF),其中非结构蛋白2编码基因(NSP2)缺失90个碱基。病毒全基因组遗传进化分析显示,该毒株序列与国内分离的高致病性PRRSV同源性为95.3%～99.3%;其NSP2高变区序列与国内分离的高致病性PRRSV同源性为92.1%～97.8%;结构蛋白GP3、GP5氨基酸序列与国内分离的高致病性PRRSV毒株同源性分别为84.3%～99.6%和83.1%～99.0%。结果表明,YNML-2018株与近年来我国PRRSV流行株相比存...     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

云南高致病性PRRSV Nsp2和ORF5基因变异分析

为研究云南省高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异特征,采用RT-PCR对云南省2007年-2008年采集的56份猪组织样品中PRRSV Nsp2、ORF5基因进行检测,获得阳性样品12份,选择6份代表性样品将其PCR产物纯化后,克隆至pMD18-T载体后测序,并与已知代表毒株进行序列比对及系统发育分析。分离株Nsp2基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为94.9%～97.2%和91.4%～95.7%,其中1份样品(07YNMG)在486位～489位氨基酸发生了缺失。在系统进化树上可将其划分为4个亚组群,分离株分别与广东、贵州、浙江、山东等地分离毒株遗传关系密切。ORF5基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为97.8%～99.5%和97.0%～99.5%。氨基酸序列未发现缺失,仅个别位点发生点突变。系统进化树分析表明,分离株与浙江、贵州、广东、云南株亲缘关系较近,而与国内疫苗株以及PRRSV经典代表毒株CH-1a距离较远。     

2010年-2011年我国五省PRRSV分离株ORF5基因遗传变异分析

为了解2010年-2011年间我国5省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子生物学特性及变异规律,应用Mcar-145细胞分离得到15株PRRSV,通过RT-PCR方法对15株PRRSV的ORF5基因进行扩增和序列分析.依据NCBI所下载的标准序列设计一对引物,对ORF5全长进行扩增(603 bp),分离株之间的核苷酸同源性为98.8％～99.9％,核苷酸推导的氨基酸同源性为95.5％～99.5％.15株PRRSV分离株与美洲型的PRRSV同源性较高,可推断均属美洲型.其中9株ORF5(151)氨基酸位点发生与HB-1相同的变异,即R151-K151,其余6株ORF5 (151)氨基酸位点与JAX1相同,即ORF5(151)为R.系统进化树表明,BFLN3-2010、BFSD1-2011和BFAH2-2011 3株与CH-1a在同一分支,属于第2亚群,BFLN2-2010等12株与JAX1在同一分支,属于第4亚群.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒华南株GDjm全基因组测序与遗传进化分析

为监测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)基因变异情况,对广东地区某猪场患有猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)仔猪的肺脏样品进行检测及病毒分离,在猪肺泡巨噬细胞(PAM)上成功分离1株病毒并命名为GDjm株,然而分离的毒株不能感染Marc-145细胞。全基因组进化分析、同源性比对及重组分析结果显示,GDjm属于重组毒株,与GDZS2016的同源性为96.2%,与中国高致病性毒株HUN4同源性为96.0%,与美洲型经典毒株VR-2332的同源性为87.4%,与NADC30同源性为82%,与欧洲型毒株Lelystad-virus同源性为57.9%。NSP2序列比对和同源性分析结果显示,GDjm与高致病性毒株HUN4、JXA1、JXwn06相似,在511、534～562位存在氨基酸缺失。GP5序列比对以及同源性分析结果显示,GDjm毒株在GP5抗原表位存在氨基酸突变。经重组分析得出GDjm株为高致病性毒株HUN4与华南地区流行毒株GDZS2016的重组毒株,重组区域为6 723～9 521 bp、11 998～15 019 bp。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株的分离鉴定

对河南漯河地区某养殖场检出的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性病料进行处理,接种到原代猪肺泡巨噬细胞中,经细胞盲传成功分离出1株PRRSV毒株,命名为HeNLH2017株,并测定了该分离株在原代猪肺泡巨噬细胞上的生长曲线。为进一步分析该分离株的遗传进化特点,扩增测定了ORF5基因和部分Nsp2基因的核酸序列。核酸同源性分析显示,该分离毒株ORF5基因和Nsp2序列与NADC30毒株同源性最高,分别为93.4%和93.8%。遗传进化树分析显示,该分离株与我国2013年以来流行的NADC30-like(Lineage1)毒株处于同一进化分支。氨基酸序列比对分析显示,ORF5基因和Nsp2序列与NADC30-like毒株具有相似的遗传变异特点,且Nsp2序列存在特征性的131个不连续的氨基酸缺失。成功分离到1株NADC30-like毒株,有助于进一步认识NADC30-like毒株在河南地区的流行情况和临床致病特点。     

PRRSV HEB-2013株的分离与全基因序列分析

2013年9月从河北某发病猪场分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将该毒株命名为HEB-2013株,在进行全基因组测序后发现,HEB-2013株基因组全长为15336 nt,包含9个开放阅读框,其中5’UTR长189 nt,3’URT长165 nt;随后将该毒株的全基因序列与NCBI上可查的历年华北地区PRRSV基因组序列进行了比对分析,发现其与2006年分离的TJ株同源性最高,为99.80%,而与2000年分离的BJ-4株同源性最低,仅为88.39%,进一步综合NSP2、GP3和GP5的氨基酸序列比对结果,系统分析了潜在毒力位点与病毒致病性的关系,并且提出了5个新的有可能与病毒致病性相关的潜在毒力位点。     

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒辽宁分离株全基因测序与遗传演化分析

为了研究欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)辽宁分离株的遗传变异情况及分子生物学特征,根据欧洲型PRRSV标准毒株LV设计15对引物,对LNEU12毒株全基因分段进行扩增并测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因,然后进行序列的比对分析。结果表明:LNEU12毒株基因全长为15 398 nt(不含3'尾端序列),与LV毒株同源性为90.1%,其中NSP2和ORF3/4重叠区域缺失21 nt,ORF6、ORF7较为保守。根据基因变异特点和遗传进化亲缘关系推测LNEU12辽宁分离株为欧洲型PRRSV变异毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒传统毒株与变异毒株的鉴别诊断

从山东各地猪场采集了50份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)感染的病料,采用RT-PCR技术扩增出PRRS病毒(PRRSV)的ORF7基因和Nsp2基因,并对Nsp2基因进行了序列同源性比较和遗传进化树分析,从RT-PCR阳性病料中进行病毒分离,然后应用Nsp2单克隆抗体对分离毒株进行鉴别诊断.结果表明,从8份病料中同时扩增出病毒的ORF7基因和Nsp2基因,序列分析显示其中6株病毒的Nsp2缺失30个氨基酸,与Nsp2单克隆抗体不发生反应,属于变异毒株;另外两株病毒的Nsp2未见氨基酸缺失,与Nsp2单克隆抗体发生特异性反应,属于传统毒株.序列同源性和系统进化分析表明,6株变异毒株与其他高致病性毒株亲缘关系很近,而与经典毒株的遗传距离较远.     

2016-2017年我国华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株分子遗传演化分析

为了解我国华北地区类NADC30流行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及遗传变异情况,本研究自2016~2017年采集华北四省市(北京、天津、山东及河北)部分猪场疑似PRRSV样品239份进行RT-PCR检测,对所有阳性样品的ORF5基因测序分析及部分阳性样品病毒分离,并选择1株基因缺失病毒TJjh1602株进行全基因的序列扩增及分析.结果显示:PRRSV检测总阳性率44.35%(106/239),遗传进化显示52.83%(56/106)的流行毒株与类NADC30相近且位于系谱1(lineage 1),其中32.14%(18/56)的类NADC30流行毒株具有相同特征性的氨基酸位点缺失;TJjh1602株全基因长度为15018 nt,与NADC30同源性为95.2%,除具有上述特征性氨基酸位点缺失外,无其他插入或缺失.研究结果推测PRRSV类NADC30毒株在我国华北地区广泛流行,同时已遗传演化成一类具有ORF5缺失分子标签的新型类NADC30毒株,提示需进一步加强对PRRSV新型缺失毒株的流行病学调查及相关致病力研究.     

山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征

为揭示2009～2010年山东地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子特征,通过RT-PCR扩增采自山东地区不同猪场病猪组织样本中PRRSV的Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7序列,用DNAStar软件分析所测序列,并与北美洲型VR-2332株、欧洲型LV株及国内分离株进行核苷酸和推导的氨基酸同源性比较...     

陕西省部分地区猪圆环病毒2型全基因组的遗传变异分析

为了解陕西省猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,根据GenBank登录的PCV2全基因组序列,设计1对引物,从陕西省部分地区规模化猪场疑似PCV2感染的病猪采集病料9份,应用PCR扩增PCV2的全基因,其中6份为阳性,并对扩增的6个PCV2全基因组序列进行测序和序列分析。基因测序表明,PCV2基因组全长为1 767bp;对6株病毒序列进行同源性比较,6个毒株全基因之间核苷酸同源性为98.3%~100%,与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组比较,同源性为96.3%~97.8%;与近几年陕西株比较发现基因变异程度不稳定,与2013年分离株(KX352154.1)同源性最高,2015年分离株(KX352159.1)次之,反而与2014年分离株(KX068219.1)最低;对6个毒株的ORF1和ORF2基因进行同源性比较,6个毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.1%~100%和98.2%~100%,与GenBank上已发表的国内外参考株ORF1和ORF2基因进行同源性比较,同源性分别为97.6%~99.8%和91.5~96.0%。陕西省流行的PCV2基因组较为保守,变异不大,同源性很高。     

广东地区致雏鹅痛风鹅星状病毒的鉴定及遗传演化分析

为了解广东地区鹅星状病毒(GoAstV)的流行和变异情况，本研究于2019年～2021年从广东清远、广州、江门和汕尾4个地区采集83份疑似患痛风雏鹅的肝脏和肾脏病料样品。制备的组织病理切片结果显示，痛风雏鹅肝脏和肾脏组织出现大量的炎性细胞浸润和细胞坏死，经RT-PCR检测鉴定到其中72份样品为Go AstV阳性。从4个地区各选1份阳性样品对鉴定到的Go Ast V进行全基因组的PCR扩增，结果显示获得4株长度均为7 033 bp的Go AstV全基因组序列。采用Meg Align分析的核苷酸同源性结果显示，4株Go Ast V全基因组序列的同源性为98.4%～99.4%，与报道的Go AstV-2参考株全基因组序列的同源性为97.1%～99.7%，而与Go AstV-1全基因组序列的同源性仅为57.3%～57.7%。与其他禽星状病毒相比，Go AstV与火鸡星状病毒2型(TAstV-2)的同源性最高，其全基因组序列同源性约为65.0%～65.3%。Cap蛋白的氨基酸序列分子特征分析结果显示，4个鉴定株Cap蛋白的氨基酸序列均发生了Y36H突变，其中Go Ast V/Guangdong/...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从广东地区发病猪场的病料中,分离到1株致Marc-145细胞病变的病毒ShB6。扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白基因ORF2-ORF7并进行序列分析,结果表明,该分离株与国内PRRSV分离株HB-1(sh)/2002的同源性为96.9%;与ATCC VR-2332株的同源性为91%;而与Lelystad株的同源性仅为59.8%;用美洲型PRRSV单抗进行免疫组化染色,结果显示在细胞病变处呈现明显的阳性着色(为棕黄色)。综合可见,所分离的病毒为美洲型PRRSV。     

猪圆环病毒2型湖南株的分离及全基因组序列分析

为了解湖南省猪圆环病毒2型(PCV2)的来源及与其他地区毒株的关系,从湖南省疑患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMW S)猪群中分离PCV2毒株1株(PCVHunan),提取病毒DNA,进行PCR扩增,扩增产物经克隆与酶切鉴定,获得1.7 kb片段的阳性重组质粒,对其进行全基因组测序分析,与Genbank中已知全基因组序列进行同源性比较。结果,该序列与国内外毒株核苷酸同源性为93.0%~97.7%,其中与美国株(AR145609)及澳大利亚株(AY424405)同源性最高,为97.7%。2个主要阅读框(ORF1与ORF2)氨基酸序列与国内外毒株同源性分别为98.4%~99.4%和88.0%~95.7%。     

多重RT-PCR检测PRRSV和CSFV及PRRSV ORF5基因遗传变异分析

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的基因组序列设计了2对特异性引物,建立了同时检测PRRSV和CSFV的多重RT-PCR方法.2008年1月至2009年12月期间,采集山东各地71个不同规模猪场及农村散养户212份病料,采用建立的多重RT-PCR技术同时检测PRRSV和CSFV的感染状况.检测结果显示,病料中高致病性PRRSV占57.1%(121/212),CSFV占29.2%(62/212).应用RT-PCR方法扩增山东不同地区16株PRRSV的ORF5基因,并进行了序列分析.结果表明,16株PRRSV的ORF5基因核苷酸同源性为97.0%～100.0%;与参考变异毒株JXA1、传统毒株VR2332核苷酸同源性分别为98.0%～99.5%和86.4%～87.7%.推导的氨基酸序列分析表明,16株毒株GP5蛋白氨基酸不存在缺失,但存在位点突变.12株在非中和表位29位点与准种进化34位点发生了突变,分别由V→A和N→S;1株在非中和表位185位点发生突变,由A→V;这与2007年流行的PRRSV毒株JXA1、HUN等不同.