大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原提纯及抗血清制备

采用加热法和盐析法对大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原进行了提取、纯化,并通过SDS—PAGE凝胶电泳对提纯效果进行了检验。将纯化的纤毛抗原免疫家兔,制备了K88、K99、987P纤毛抗原抗血清,用琼脂扩散试验检测了抗血清的效价。结果表明,纯化的K88、K99、987P纤毛为高纯度的纤毛抗原,其分子量分别约为26、18、20kD。K88、K99、987P抗血清的琼扩效价依次为1：32、1：32、1：128,且特异性高。本研究为K88、K99、987P纤毛抗原定量检测及产纤毛大肠杆菌菌株的鉴定奠定了基础。     

大肠杆菌K99纤毛抗原的提纯和抗血清制备

在引起初生犊牛、羔羊和仔猪腹泻的肠毒素大肠杆菌中,K99是常见的粘附素,这些细菌表面纤毛能与小肠黏膜上皮细胞表面的特异性受体位点结合,使细菌吸附于肠黏膜表面并产生肠毒素,导致急性腹泻、脱水,最后衰竭死亡.     

大肠杆菌K88纤毛抗原的提纯和抗血清的制备

以5％绵羊血改良Minca琼脂筛选和克隆表达良好的K88^＋菌株，改良Minca琼脂培养获得K88菌液。用加热法及高速匀浆法使K88纤毛从菌体上脱下。饱和硫酸铵沉淀粗提，用Sepharose CL-4B凝胶过滤纯化K88抗原。提纯的抗原经SDS—PAGE电泳测定其分子量约为25000，且仅此一条蛋白带；与K88抗血清进行琼脂扩散试验只出现一条沉淀线。用提纯的抗原经多次免疫家兔制备了K88抗血清。抗血清在玻板凝集试验中只凝集K88菌株，不凝集K99，987P或F41菌株；在琼扩试验中，只与K88粗提抗原出现一条沉淀线，且效价为1：64，而不与K99，987P抗原出现沉淀线；在免疫电泳试验中，与无细胞K88纤毛液只出现一条沉淀线。鉴定结果表明，所制备的K88血清特异性强、效价高，可作为单因子血清用于凝集试验、琼扩试验等血清学试验，对K88菌株进行鉴定，对K88纤毛抗原进行定性和定量检测。     

表达K_88K_99双纤毛抗原及K_99纤毛抗原的产肠毒素大肠杆菌的构建

应用转化法:将带有K_99纤毛抗原的重组质粒PHK_99分别转化到具有K_88纤毛抗原的产肠毒素菌株B_6(O_149K_91K_(68)ac)“和不具K_88抗原的产肠毒素菌株(O_14K_85),获得了35株抗氨苄青霉素的转化子。在这35个转化子中,有32个能同时表达K_(88)、K_(99)两种纤毛抗原,有3株能表达K_(99)纤毛抗原。这些转化子仍具有产肠毒素的特性。     

双价工程菌K88K99表达蛋白提取方法的探讨及抗原性分析

本研究酸脱毛法,将供试工程菌物进行脱毛,提取制备表达蛋白,并对酸脱毛法的最适ＰＨ值、最佳温度、最佳时间进行探讨,ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分析结果证明,酸脱毛法脱牧场来２、脱毛温度为６０℃、脱毛时间为３０分钟时,表达蛋白分离提取的效果最佳。对提取蛋白进行琼扩,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析,结果表明所提取蛋白具有较高的抗原活性,并能被Ｋ８８Ｋ９９单克隆抗体所识别。     

K88和K99双价基因工程菌C株与E株表达效果的比较

应用ＬＢ培养基３７℃,１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１７小时,室温４００ｒ／ｍｉｎ,离心３０分钟,收集沉淀菌体,用ＰＢＳ离心洗涤一次,沉淀物重悬于适量的ＰＢＳ中,三等分离体悬浮液分别用超声波,冻融,热休克等方面处理后,室温８０００ｒ／ｍｉｎ离心３０分钟,取上清液加入饱和硫酸铵４℃过夜,沉淀蛋白经透析,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０过柱纯化,应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,凝胶扫描测定Ｋ８８、Ｋ９９蛋白的分子量及浓度,     

K99和ST1双价保护性抗原基因重组苗条表达及其免疫原性研究

大肠杆菌耐热性肠毒素（ＳＴ１）是引起幼畜腹泻的重要毒力因子之一，其结构基因编码１９个氨基酸，无免疫原性。作者以ｐＳＬＭ００４工程菌株为始发菌株，亚克隆ＳＴ１基因，并将ＳＴ１基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因（ｐＳＫ２１９）和ｐＵＣ１８多克隆位点中（ｐＸＳＴ系列）。从而成功构建了能表达ＳＴ１－Ｋ９９两种抗原的工程菌苗候选株ｐＳＫ２１９以及能表达ＳＴ１抗原的工程菌株ｐＸＳＴ     

K88和K99双价基因工程菌C株与E株表达效果的比较

应用ＬＢ培养基３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１７小时,室温４０００ｒ／ｍｉｎ,离心３０分钟,收集沉淀菌体,用ＰＢＳ离心洗涤一次,沉淀物重悬于适量的ＰＢＳ中。三等分菌体悬浮液分别用超声波、冻融、热休克等方法处理后,室温８０００ｒ／ｍｉｎ离心３０分钟,取上清液加入饱和硫酸铵４℃过夜,沉淀蛋白经透析,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０过柱纯化。应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、凝胶扫描测定Ｋ８８、Ｋ９９蛋白的分子量及浓度,双向免疫扩散、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ试验测定其抗原性。结果表明,热休克法分离纤毛抗原是最好的方法,从Ｃ株Ｅ株分离得到的纤毛抗原,在分子量大小及对单抗亲和反应能力方面没有明显的差异。     

支气管败血波氏杆菌纤毛的电镜观察和提纯

同染色电镜技术检查了10株支气管败血波氏杆菌形成纤毛的能力。除1个兔源I相菌株形成纤毛较稀疏外，5个猪源I相菌株均产生丰富的周在尾纤抟，但以两极端较密集，纤毛直径2－3nm、长40-100nm。由I相菌株传代获得的4个Ⅲ相变异菌株不形成纤毛。经过超声处理结合Tritonx-100溶解法由I相菌株制备的纤毛粗提物中也风到折断的大量纤毛段。往往有聚堆现象，应用两种方法已将纤毛分离提纯，SDS－PAGE证明纯化的纤毛由4种蛋白亚单位组成，分子量分别为123K、112K，02K和91K。     

优良牧草新品种—81—01纤毛鹅观草

选育适应亚热带红壤低丘栽培的多年生冬性牧草优良新品种是世界瞩目的难题。我们吸取国内外解决这个问题的经验和教训,采用生态型选择和混合选择等系统工作,历时8年,从江西省弋阳县的野生纤毛鹅观草中选育了一种优良牧草新品种——81—01纤毛鹅观草。该品种最近通过了专家鉴定。现将它的特征特性简介如下:     

K88抗原纯化中硫酸铵沉淀法的改进

硫酸铵沉淀法是一种用于蛋白质提纯的盐析方法，具有成本低、操作简单、对被分离物可保存其生物活性等优点而被广泛使用。我们在大菌菌毛蛋白Ｋ８８纯化中采用硫酸铵沉淀法进行蛋白质粗提。     

E.coli纤毛抗原K_(99)菌株电子显微镜观察试验

肠致病性埃希氏大肠杆菌(E.co1i)的粘附因子K_(99)抗原,是一种易热蛋白质,从形态上看是一种纤毛结构,这种纤毛可以粘附于小肠上皮细胞,使细菌在小肠中聚集产生肠毒素而致病。这种纤毛的致病作用越来越引起人们的重视,在兽医研究方面,现已发现猪的肠致病性大肠杆菌带有K_(88)、K_(99)和987P三种纤毛抗原,在引起新生仔猪腹泻     

大肠杆菌K99菌毛抗原的制备及其免疫抗体效价的测定

肠毒素型大肠杆菌 (Enterotoxigenic E.coli,ETEC)是幼龄动物 (仔猪、犊牛、羔羊等 )腹泻中常见而且重要的致病菌之一 ,此类大肠杆菌能借助于其所产生的菌毛抗原粘附于动物的小肠黏膜上 ,定居并产生肠毒素 ,从而呈现出致病作用。当大肠杆菌 K99菌毛粘附于绵羊红细胞上时 ,能使红细胞发生凝集 ,且不被 D-甘露糖抑制 ,系一种甘露糖低抗血凝反应 (MRHA) ,菌毛的MRHA可被相应的抗体抑制 ,故又可用甘露糖抵抗血凝抑制反应 (MRHI)来对其作出确诊[1] 。目前在各种动物中已发现并展开研究的大肠杆菌菌毛抗原主要有 :K88(F4)、K99(F5)、987…