抗狂犬病毒单克隆抗体的研制及应用

应用杂交瘤技术获得4株分泌抗狂犬病毒(Rabies virus,RV)单克隆抗体细胞株,并对其特性进行分析。经鉴定,它们所分泌的抗体类型为IgG1,腹水效价为1∶105~1∶107,ELISA法和间接免疫荧光检测(indirect immunofluoreseent assay,IFA)结果表明:该4株单抗对RV有良好的特异性,对正常Vero细胞及人白蛋白和其他细胞培养物无非特异性反应。将这些单抗腹水进行Protein G亲和层析纯化后获得的纯化抗体用于制备反相亲和层析柱,并以反相亲和层析法纯化RV以获得高纯度RV抗原。应用纯化的RV建立胶体金免疫层析法(gold-immunochromatography assay,GICA)检测RV抗体血清,结果显示,GICA与标准ELISA法检测比较的总符合率为96.1%。     

马循环免疫复合物检测法的建立及其应用

确定了检测马循环免疫复合物(CIC)的聚乙二醇(PEG)沉淀试验及固相C_(1q)-ELISA的最适条件.PEG沉淀试验/C_(1q)-ELISA对健康马(n=60)、传贫马(n=83)和注射传贫疫苗马(n=79)的检测结果(OD值,x±2S)分别为:O.066±0.042/0.288±0.206,0.124±0.067/0.712±0.344和0.081±0.053/0.425±0.217).经统计检验,这两种方法相关性显著,3类马血清的OD值相互差异非常显著.本实验结果提示,马传染性贫血的发病与循环免疫复合物有关.     

三种方法纯化相思子毒素单抗的比较

采用不同的方法纯化相思子毒素单抗,寻求一种效果好、操作简便的纯化方法。采用硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法和硫酸铵-蛋白A亲和层析法三种方法分离纯化相思子毒素单抗,并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、BCA蛋白检测试剂盒(BCA Protein Assay Kit)和双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)对纯化产物进行相对分子质量、浓度、纯度、回收率及免疫活性的鉴定。结果表明,纯化后单抗的回收率以硫酸铵沉淀法及辛酸-硫酸铵法较高,硫酸铵-蛋白A亲和层析法较低;产物纯度以硫酸铵-蛋白A亲和层析法和辛酸-硫酸铵法较高,硫酸铵沉淀法较差;不同方法纯化后的单抗活性未见降低。     

几种方法纯化小鼠腹水IgG2b类单抗的比较

分别采用硫酸铵-蛋白A亲和层析法、改进后的硫酸铵-蛋白A亲和层析法、辛酸-硫酸铵-蛋白A亲和层析法纯化小鼠腹水IgG2b类抗体。经SDS-PAGE和间接ELISA分析纯化产物的纯度及其活性。结果表明:3种方法纯化后的单抗的免疫活性均未降低;纯化后单抗的亚类为IgG2b;经改进后的硫酸铵-蛋白A亲和层析法纯化制备的IgG2b类抗体纯度可达到87.1%;经辛酸-硫酸铵-蛋白A亲和层析法纯化制备的IgG2b类单克隆抗体纯度可达到100%,是一种制备高纯度小鼠腹水IgG2b类单克隆抗体简便而有效的方法。     

奶牛孕酮免疫胶体金快速检测试纸条的研制

为了及时、准确地诊断母奶牛妊娠状态,研究建立了奶牛孕酮(P4)胶体金免疫层析法的快速检测技术.先制备完全抗原(P4-BSA),用其免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,抗体经亲和纯化后测定其浓度.采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒直径为15 nm的胶体金,以P4-OVA和羊抗鼠二抗分别作为检测带和质控带包被在硝酸纤维素膜上,将...     

PRRSV重组N蛋白的抗原性分析及其特异性抗体制备

利用大肠杆菌表达技术和亲和层析法纯化出重组PRRSV N蛋白 ,用间接ELISA法和Western blot分析 ,证明其具有较好的抗原性。将该纯化蛋白采用大剂量长程免疫法免疫家兔 ,制备了兔抗重组N蛋白抗体 ,用Western blot分析和竞争抑制试验证明其具有很高的特异性 ,ELISA效价达 1∶32 0 0以上。     

牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用

旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B, LC3B)基因，制备牦牛LC3B多克隆抗体，为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。本研究通过基因克隆方法获得牦牛LC3B基因序列，利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛LC3B重组蛋白，使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔，Sepharose4B柱层析法纯化制备牦牛LC3B多克隆抗体，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价，并使用蛋白质免疫印迹(WB)、免疫组织化学法(IHC)和免疫荧光技术(IF)检测牦牛生殖器官中LC3B蛋白的表达。结果显示，本研究成功克隆了牦牛LC3B基因(登录号：OP572227),构建的重组质粒pET-32a-LC3B能够诱导产生重组蛋白，并且在包涵体和上清中均有表达；所纯化的牦牛LC3B重组蛋白大小为34 ku(含Trx和His标签),符合预期结果。通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛LC3B蛋白血清，抗体效价分别为1∶640 000和1∶320 000,特异性良好，表明牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备成功。纯化...     

口蹄疫146S病毒粒子IgG的纯化及其免疫活性的鉴定

用口蹄疫146S病毒粒子(FMDV 146S)免疫家兔产生抗体，待血清效价达到1：64以上分离血清；通过饱和硫酸铵盐析沉淀、Sephadex G-25除盐和DEAE-cellul08e层析等方法纯化血清IgG；用间接ELISA方法检测纯化后的血清IgG免疫活性。证明用离子交换层析法纯化兔抗口蹄疫146S病毒粒子血清IgG效果良好。     

藏羊红细胞免疫功能的初步研究

采用酵母菌花环试验检测了78只藏羊红细胞膜上C_(3b)受体和免疫复合物。试验结果表明:藏羊红细胞膜上具有C_(3b)受体,其红细胞膜上C_(3b)受体花环率为2.10±1.09％。且藏羊红细胞还可粘附免疫复合物,其红细胞膜上免疫复合物花环率为2.79±1.78％。说明藏羊红细胞不仅具有携氧、调节酸碱平衡等作用,而且具有免疫功能。     

猫血清IgG的纯化及酶标兔抗猫二抗的制备

采用辛酸-硫酸铵法和Sephadex G-150分子筛层析法纯化猫血清IgG,SDS-PAGE电泳检测;用纯化的IgG免疫新西兰兔,制备兔抗猫IgG抗血清,并用上述方法提纯兔抗猫IgG,改良过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶,即获得兔抗猫IgG的酶标抗体。     

胶体金方法检测H3和H7亚型禽流感病毒

用微波法制备金溶胶,对禽流感病毒(AIV)H3和H7亚型单克隆抗体(H3-1D6和H7-1F7)用亲和层析法进行纯化,优化单抗与金溶胶的最佳结合条件后,喷涂于玻璃纤维上制成金标垫.将纯化的马抗H3和H7亚型AIV多克隆抗体和山羊抗鼠二抗分别包被于硝酸纤维素(NC)膜上作为检测线和质控线,制备胶体金检测试纸条.用制备的试纸条对H3和H7亚型AIV标准抗原、毕赤酵母真核表达蛋白和已知样品进行检测,结果与血凝试验、血凝抑制试验、AC-ELISA和RT-PCR方法相符.同时用该方法对H5和H9亚型AIV标准抗原、病料以及传染性支气管炎、新城疫等抗原进行检测,结果均为阴性.该方法操作简单,肉眼于10 min内可判定结果,且达到了血凝试验和血凝抑制试验的敏感性.     

兔抗O型口蹄疫VLPs酶标抗体的制备及初步应用

为制备兔抗O型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)的酶标抗体,进一步建立O型口蹄疫病毒的ELISA检测方法,通过原核表达、体外纯化和组装O型口蹄疫VLPs,免疫家兔制备兔抗O型口蹄疫VLPs高免血清,并采用亲和层析法纯化IgG,改良过碘酸钠法制备兔抗O型口蹄疫VLPs的酶标抗体(rabbit anti-type O foot-and-mouth disease IgG-HRP)。结果显示,兔抗O型口蹄疫VLPs高免血清效价达1∶4 096,纯化后的IgG纯度达90%,效价达1∶512 000。表明获得了高纯度的兔抗O型口蹄疫VLP的酶标抗体,可用于O型口蹄疫的ELISA检测。     

犬细小病毒病免疫胶体金诊断技术的研究

建立一种简便、快速、准确检测犬细小病毒(CPV)的胶体金免疫层析法(GICA).采用柠檬酸三钠法制备胶体金颗粒,标记纯化的CPV单克隆抗体,在玻璃纤维素膜上喷加纯化的CPV多克隆抗体,制成诊断CPV抗原的快速诊断试纸条.用本试验研制的CPV试纸条检测收集到的120份犬粪便样品,其结果与HA结果相比对,HA效价在1:40以上,试纸条均能检测到为阳性.CPV试纸条与犬瘟热病毒及犬传染性肝炎病毒无交叉反应.且试纸条保存6个月后,其检测结果重复性为100%.试验证明,本研究建立的GICA是一种快速、灵敏、特异的抗原检测方法,可在临床上广泛应用,也可用于CPV的流行病学调查.     

牛重组型生长激素抗独特型抗体的产生与鉴定

利用纯化的兔抗牛生长激素抗体ＩｇＧ来免疫３只绵羊以制备抗独特型血清。间接ＥＬＩＳＡ法和琼脂糖双扩散法测定抗血清滴度分别达到或超过１：１２８０００和１：６４以上。之后用硫酸铵沉淀法和亲和层析法纯化抗独特型抗体。采用间接ＥＬＩＳＡ法来研究抗独特型抗体与第一抗体ＩｇＧ成分特异性结合及生长激素与第一抗体中ＩｇＧ结合的影响,结果显示出它不但能ＩｇＧ成分特异性结合。而且能与生长激素竞争性结合第一抗体ＩｇＧ成分     

应用荧光免疫层析法检测布鲁氏菌病抗体

为了验证荧光免疫层析法检测布鲁氏菌病抗体的可行性,采用荧光免疫层析法分别对阳性血清和临床采集的样品进行检测。结果为荧光免疫层析法能够检出布鲁氏菌阳性血清阳性,而对O型口蹄疫、亚洲Ⅰ型口蹄疫、猪瘟阳性血清检测结果为阴性;能检出布鲁氏菌阳性血清(试管凝集效价1:800)320倍的稀释度;检测1:40稀释倍数的布鲁氏菌阳性血清的变异系数(C.V)为4.66%;检测临床样品60份,结果均为阴性。结果表明,应用荧光免疫层析法检测布鲁氏菌病抗体,特异性强,结果稳定,灵敏度较高,操作简便、试验时间短、不受人为因素干扰,该方法适合布病抗体检测的初筛。     

浅谈畜产品中莱克多巴胺的检测方法

介绍了莱克多巴胺的组成与危害,酶联免疫法(ELISA)、胶体金免疫层析法(GICA)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱联用法(MS)、毛细管电泳法(CE)、免疫传感器法和化学发光免疫分析法(CLIA)等莱克多巴胺的检测方法。     

氯霉素全抗原合成及多克隆抗体的制备

用重氮化方法将氯霉素与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联，制备免疫抗原和包被抗原，用ELISA方法进行鉴定。将偶联抗原用弗氏佐剂乳化后免疫德国大白兔。制备多克隆抗体，并用硫酸铵沉淀法初步纯化。用亲和层析法进一步纯化。用所得抗体建立竞争酶联免疫吸附分析法（ELISA）用于氯霉素检测，最低检查限为0.3ng/mL。     

氨苯磺胺免疫荧光分析方法的建立

通过重氮化法将SN与人血清白蛋白(HSA)偶联制备全抗原SN-HSA,用全抗原免疫新西兰大白兔,制备了抗SN的多克隆抗体(AbSN),AbSN与温度敏感水凝胶偶联形成水凝胶复合物(pNIPA-AbSN),全抗原(AgSN)与异硫氰基荧光素偶联形成荧光复合物(FITC-AgSN).FITC-AgSN和游离半抗原SN竞争性地与有限量的水凝胶复合物pNIPA-AbSN反应.根据水凝胶相变温度以上免疫复合物沉淀的特性进行分离,结果表明,该法对SN测定的线性范围在1 ng/mL～100 μg/mL,50%抑制率时检出限为60.45 ng/mL.     

水貂循环免疫复合物检测方法的建立及应用

本试验建立了检测水貂循环免疫复合物(CIC)的微量PEG沉淀比浊法和固相C_(1q)—SPA—ELISA.用这两种方法检测了38例健康水貂血清、126例阿留申病(AD)病貂血清.微量PEG沉淀比浊法的结果(OD值,(?)±S)为:健康水貂0.081±0.042,AD病貂0.198±0.066;固相C_(1q)—SPA—ELISA的结果(OD值,(?)±S)为:健康水貂0.245±0.057,AD病貂0.503±0.167,敏感性为0.25μg/mL.经统计学处理,健康水貂与AD病貂血清OD值之间呈极显著差异(P<0.01),表明水貂阿留申病的病理过程与CTC有关.建立的两种方法均具有快速、简便、重复性好和敏感性高等特点,两种方法的相关性显著.     

鲤鱼IgM的分离纯化及其抗血清的制备

为了分离纯化鲤鱼血清免疫球蛋白M(IgM),并制备该蛋白的多克隆抗体,试验用rProtein A FF亲和层析和Superdex200 Increase 10/300GL分子筛的方法分离纯化鲤鱼血清免疫球蛋白M(IgM),并通过SDS-PAGE对纯化蛋白的部分特性进行分析;以纯化后的蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔制备该蛋白的多抗血清,用ELISA法检测抗血清效价。结果表明:从鲤鱼血清中分离纯化出鲤鱼IgM蛋白,纯化后纯度可达99.53%;重链和轻链的分子质量分别为81.3 ku、26.4 ku;兔抗鲤鱼多抗效价高达1∶640 000以上。说明试验所采用的rProtein A FF亲和层析法可提取到高纯度的鲤鱼IgM,适合在实验室纯化鱼类IgM。