本地毛形线虫49 Ku ES重组蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用纯化的本地毛形线虫49KuES重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株制备腹水。获得两株稳定分泌抗重组蛋白McAb的杂交瘤细胞株D5和C1。试剂盒鉴定两株McAb均属IgM亚类,其轻链均为K链;间接ELISA检测细胞培养液上清和腹水效价,结果显示,两株细胞培养液上清均达到1∶1.28×10~3,腹水效价均达到1∶1.28×10~4;Westetrn blot结果表明,获得的两株McAb均能特异性的识别约49Ku处的ES抗原;间接ELISA结果显示两株McAb与日本血吸虫成虫、猪囊尾蚴囊液、猪蛔虫、猪鞭虫抗原均无交叉反应,表明两株McAb特异性良好。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3～5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM,其轻链均为κ链。ELISA、Western Blot和免疫荧光鉴定结果表明,4株单抗均与N蛋白及PEDV具有良好的结合活性。复苏冻存的4株杂交瘤细胞,连续传代培养30代,4株杂交瘤细胞能够持续稳定分泌抗体,细胞上清的ELISA抗体效价均在1∶800以上。4株细胞诱生的小鼠腹水抗体效价为1∶10~5～1∶10~6。将单克隆抗体(4A7)用于免疫组化试验和IPMA时,其能够特异地识别PEDV人工感染猪小肠组织和Vero细胞内的病毒。上述实验结果表明,制备的单克隆抗体可以用于PEDV抗原检测以及体内病毒的组织定位分析,并可为进一步研发PEDV抗原或抗体检测技术奠定基础。     

O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备和鉴定

利用O型口蹄疫病毒(FMDV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选和7次亚克隆后获得2株能稳定分泌单克隆抗体(MeAb)的杂交瘤细胞株.经间接ELISA检测,2株杂交瘤细胞株(3E1、7E6)的腹水效价分别为1:25 600、1:102 400.间接免疫荧光试验和特异性试验表明2株McAb可与不同株的O型FMDV反应,而不与其他血清型的FMDV反应.Western blot和叠加试验表明2株单抗可识别0型FMDV结构蛋白VP1上的同一个抗原表位.此特异性McAb的获得将为O型FMDV疫苗的研制和诊断方法的建立奠定基础.     

抗氯霉素单克隆抗体的制备及鉴定

用人工合成的氯霉素-人血清白蛋白(CAP-HSA)作抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术建立了1株分泌抗CAP单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞1F9.经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1,杂交瘤染色体数目84～96条,间接ELISA检测细胞培养上清效价为1256,诱生小鼠腹水的抗体效价可达16×105.该细胞连续培养生物学性状稳定,竞争间接酶联免疫吸附试验(ciELISA)显示,其与供试抗生素交叉反应小,表明该单抗具有较大的应用价值.     

抗猪传染性胃肠炎病毒重组S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA方法进行筛选和有限稀释法3次克隆,获得2株稳定分泌抗TGEV重组S蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为C7C882和B5G8G7,其染色体平均计数均为88±10对,制备腹水抗体效价分别为1:2×105和1:104,分泌抗体亚类均为IgM型.2株杂交瘤细胞上清与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪伪狂犬病病毒(PrV)均无交叉反应,与TGEV感染细胞经间接免疫荧光检测均呈黄绿色荧光.     

大豆凝集素单克隆抗体的制备及鉴定

为获得分泌抗大豆凝集素(SBA)单克隆抗体的杂交瘤细胞,以纯化的SBA为抗原,免疫BALB/c小鼠,加强免疫3 d后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,应用有限稀释法和间接ELISA 方法克隆筛选出2株分泌抗SBA单克隆抗体的杂交瘤细胞系A7、F12。细胞上清抗体效价均在1∶2×10³以上,腹水抗体效价均为1∶1×10⁶,单抗亚型鉴定结果均为IgG2b型,分子质量为189.6 ku,亲和常数为7.1×10⁷ mol/L,Western blotting结果表明,2株单抗具有较高的特异性。该McAb的制备为建立SBA定量检测方法奠定了基础。     

醋酸甲孕酮单克隆抗体的制备与鉴定

用人工合成的醋酸甲孕酮-牛血清白蛋白(MPA-BSA)作为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选得到1株稳定分泌醋酸甲孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C11A3B6,该细胞株经体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定。间接ELISA测定培养上清效价为1∶640,诱生腹水效价为1∶2.56×106。经鉴定:杂交瘤细胞分泌的抗体亚型为IgG2а。竞争抑制ELISA(ciELISA)检测显示其IC50为22 ng/mL,与常见抗生素及结构类似物的交叉反应小,表明该单抗具有较好的敏感性和特异性。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

选用AEV(VR株 )CEF适应毒制备抗原 ,免疫Balb/c小鼠。应用杂交瘤技术以间接ELISA方法筛选获得一株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞。制备细胞上清及腹水进行单抗特性鉴定 ,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS PAGE电泳 ,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于 90～ 110之间 ,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子量为 142KD ,ELISA测定细胞上清效价为 1∶1× 10 4 ,腹水效价为 1∶1× 10 6,与其它病原无交叉反应 ,抗体分泌稳定。     

抗双氯青霉素单克隆抗体的制备与初步鉴定

采用碳化二亚胺法,将双氯青霉素(dicloxacillin)与牛血清白蛋白偶联制备免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆,获得1株可稳定分泌McAb的杂交瘤细胞5D4-C9-C8;间接ELISA方法测定,其细胞上清抗体效价为1∶300,腹水效价为1∶3.5×105,为IgG1,与其结构类似物邻氯青霉素、苯唑青霉素的交叉反应率分别为17.6%和26.1%,与苄青霉素、羟氨苄青霉素和氨苄青霉素均无交叉反应性。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。为进一步研制检测双氯青霉素的ELISA试剂盒奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌OMP5单克隆抗体的制备与鉴定

用副猪嗜血杆菌（HPS）血清5型灭活菌液免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以HPS外膜蛋白5（OMP5）为抗原,经间接ELISA法筛选阳性融合孔,并用有限稀释法对筛选的阳性孔进行亚克隆,获得2株分泌抗HPS OMP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E2和8D9;间接ELISA法效价检测,1E2和8D9细胞培养上清抗体效价均为1∶2 560,纯化后腹水抗体效价分别为1∶204 800和1∶51 200;抗体型别鉴定,1E2和8D9分别分泌IgG2b、IgG2a型抗体;特异性检测表明,2株单抗均能特异识别OMP5。将2株杂交瘤细胞反复冻融3次复苏后仍能稳定分泌抗体。2株抗HPS OMP5单克隆抗体的成功制备,将为HPS感染快速检测方法的建立以及检测试剂的研制奠定基础。     

猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体制备与鉴定

为获得猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白单克隆抗体,选择原核表达的重组gE蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,将其脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,结果获得了2株能稳定分泌抗PRV gE蛋白的杂交瘤细胞,命名为E3B8和E5C11。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞的培养上清液抗体效价为1∶6.4×10~3,腹水的抗体效价分别达到1∶3.28×10~6和1∶6.55×10~6。2株杂交瘤细胞的染色体数分别为105和108。E3B8亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链;E5C11亚类鉴定重链为IgG2b,轻链为κ链。Western blot检测显示2株单克隆抗体腹水均能与PRV重组gE蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测显示2株单克隆抗体均能与PRV分离毒株感染的BHK-21细胞发生特异性反应,交叉反应性检测显示2株单克隆抗体与常见病毒不发生交叉反应。表明制备的2株gE蛋白单克隆抗体效价高、特异性强,为gE蛋白结构与功能分析以及PRV免疫诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

抗猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及其部分特性鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行融合,间接ELISA方法进行筛选,采用有限稀释法进行细胞克隆,经过3次克隆筛选,最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系(命名为E10F10D5),其染色体平均记数为87±10对,间接ELISA检测制备的腹水效价达1:12 800,以全病毒为抗原对杂交瘤细胞(E10F10D5)产生的腹水进行Westernblot分析,该腹水识别病毒结构蛋白质分子量约43ku,即TGEV天然N蛋白.     

分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

为制备犬细小病毒(CPV)单克隆抗体,用F81细胞繁殖CPV,病毒液经二乙烯亚胺(BEI)灭活、纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经筛选获得2株分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为F1和B6.F1和B6分泌的单克隆抗体Ig亚类均为IgG1;以F1和B6制备的腹水,经检测,间接ELISA效价均为1×105,免疫荧光效价分别为1:3200和1∶6400;F1和B6培养上清的抗体中和效价分别为1∶1024和1∶2048,血凝抑制效价分别为1∶2048和1∶4096;免疫印迹(Western-blotting)和抗原表位分析结果显示,F1和B6分泌的单克隆抗体可能分别针对CPV的空间表位和线性表位.2株分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立可进一步用于开发CPV特异性诊断制剂和治疗制剂.     

赤羽病毒单克隆抗体的研制及鉴定

用纯化的赤羽病毒（akabane virus,AKAV）免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌抗赤羽病毒单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株,分别命名为AKAV McAb 3A株和2C株。ELISA试验和中和试验结果表明,本研究制备的2株McAb均具有良好的特异性,为AKAV阳性,杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价分别为1∶640和1∶320,腹水的效价分别为1∶256000和1∶128000,亲和常数（Ka）分别为1.16×10^-9和6.31×10^-8 mol/L,3A株的相对亲和力大于2 C株,具有病毒中和活性,中和效价分别为1∶64和1∶32,其IgG亚类为IgG1,轻链的亚型均为kappa型,2株细胞冻存3次复苏后仍能稳定分泌抗体,表明AKAV McAb制备成功,为赤羽病快速诊断方法的研究奠定了基础。     

牛γ-干扰素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

建立牛结核病的γ-干扰素(BovIFN-γ)免疫学检测方法。本研究利用rBovIFN-γ抗原免疫Balb/c小鼠,经5次免疫后,通过淋巴细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备抗BovIFN-γ的单克隆抗体,在McAb及多克隆抗体的基础上建立双抗体夹心ELISA,并进一步优化ELISA反应条件。结果表明,获得一株能稳定分泌抗BovIFN-γ McAb的杂交瘤细胞株A12E9,分泌单克隆抗体腹水效价为1∶107,属于IgG1亚类,具有良好的特异性;所建立的双抗体夹心ELISA方法,BovIFN-γ最低检测限为40 ng/mL,与其他蛋白不发生交叉反应,表现出良好的特异性。该方法为建立牛结核病的γ-干扰素诊断方法奠定了基础。     

绵羊肺腺瘤病毒衣壳蛋白杂交瘤细胞系的建立

为了制备特异性的抗绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV) 内蒙株衣壳蛋白(CA)的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞系,以原核表达CA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经杂交瘤技术进行融合,同时以表达蛋白作为包被抗原进行特异性ELISA检测,共筛选到6株阳性杂交瘤细胞株。经过3次亚克隆后,最终得到了5株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株;再利用CA真核表达蛋白以间接免疫荧光法,对此5株杂交瘤细胞进行进一步的特异性鉴定。结果显示,有3株具有特异性强荧光反应,也能检测到目的基因的表达产物。本试验获得了3株稳定分泌抗JSRV-NM株CA蛋白McAb的杂交瘤细胞系,为建立检测病原的特异性诊断方法、分析JSRV-NM株CA蛋白的功能及鉴定B细胞抗原表位等奠定基础。     

猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)作为抗原免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,通过聚乙二醇方法进行融合,利用有限稀释法在HAT培养基上筛选杂交瘤细胞,共获得12株既能稳定生长并可以分泌特异性抗TGEV的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为8D2、4H4、5D6、7H10、4C3、9G1、3A2、8G1、5G6、2D7、4D6、6B10。间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光结果表明,获得的12株单抗能特异性识别TGEV,通过间接ELISA做病原检测,显示12株单抗与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PrV)不发生交叉反应。经抗体亚类鉴定,该12株单克隆抗体均为IgG2b。12株抗TGEV的单抗制备成功,为猪传染性胃肠炎病原特性研究和病原快速检测提供了物质基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性分析

分别用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb)。用纯化的PRRSV免疫小鼠,经细胞融合获得2株可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4B8、4D8。用重组N蛋白免疫的小鼠,经细胞融合获得3株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞2F3、4D5、5D11。间接ELISA检测4D8、4B8、4D5和5D11杂交瘤上清效价为1∶32~1∶512,而2F3的腹水效价为1∶12 800。单抗2F3、4B8和4D8与纯化病毒的Western blotting反应都为阳性,而4D5和5D11为阴性。IFA检测结果5株单抗都有明显的荧光,与PRRSV呈阳性反应。2F3的Ig亚型为IgM。5株单抗杂交瘤细胞连续传代至20代,分泌相应McAb的效价基本一致。本研究为PRRSV生物学诊断和方法研究提供有用工具。     

抗水牛伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原单克隆抗体的研制

用纯化的伊氏锥虫变异表面糖蛋白（variant surface glucoprotein, VSG）免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过3次克隆和间接ELISA方法筛选,获得3D7、5B9 2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养液上清效价和小鼠腹水效价,其中细胞培养上清效价分别为1∶6400和1∶12800,腹水效价分别为1∶105和1∶106。单抗的亚型鉴定结果表明,3D7、5B9分泌的抗体都为IgG1亚类κ链。     

鹿流行性出血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了更好的研究鹿流行性出血病病毒(EHDV)的生物学特性和建立EHDV免疫学检测方法,本研究用纯化的EHDV免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,获得了2株(1A5和8H6)能够稳定分泌抗EHDV单抗的杂交瘤细胞株.其细胞培养上清效价分别为1∶256和1∶512,腹水效价分别为1∶1 024 000和1∶2 048 000;McAb 1A5和8H6 的相对亲和力分别为0.9 mg/L和0.7 mg/L.间接ELISA结果显示,2株单抗仅与EHDV反应,不与蓝舌病病毒、赤羽病病毒、水疱性口炎病毒、小反刍兽疫病毒和BHK细胞反应,表明2株单抗特异性良好.这2株单抗的获得为研究EHDV生物学特性和建立EHDV检测方法奠定了基础.