关于禽流感发生与传播的历史回顾与研究进展——威胁人类生存的元凶：流感病毒（3）

禽流感病毒的毒力主要取决于病毒粒子的复制速度和HA蛋白切割位点附近的氨基酸组成。HA是位于流感病毒表面的一种重要的糖蛋白，在转录后首先表达为无活性的前体HAO，然后，通过蛋白酶水解，强毒株的HA被切割为两个有活性的多肽亚单位HAl和HA2，而弱毒株的HA则不被切割。实验证实，HA1可以介导病毒与感染细胞受体上唾液酸之间的吸附作用；HA2可以引导病毒包膜和核内体膜的融合。因此，流感病毒中主要的功能性HA糖蛋白前体HAO，被水解为HA1和HA2两条多肽链是决定病毒有无感染性（毒力）的先决条件。     

禽流感病毒血凝素糖蛋白(HA)的结构及其生物学功能

高致病性禽流感 (AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一种急性传染病。AIV呈球形 ,有囊膜。其表面主要有两种糖蛋白 ,其中血凝素(hemagglutinin ,HA)具有重要功能 :能凝集红细胞 ,属I型糖蛋白 ;具有株和亚型的特异性 ,是AIV型和亚型内新变种判断的主要依据 ;能结合宿主唾液酸之类的细胞受体 ;HA在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用 ,HA上裂解位点的序列直接影响AI病毒致病性的高低 ;HA的变异性很强 ,它的变异是AI病毒发生抗原变异的主要原因 ,HA是最主要的抗原物质。因此HA对AIV的生物学特征具有十分重要的意义     

利用反向遗传技术构建细胞高适应性的H9N2流感病毒

H9N2亚型禽流感病毒通常在鸡胚上增值性能高,但在细胞上增值能力差。为了获得在细胞上高效表达H9N2亚型禽流感HA和NA抗原的疫苗株,通过反向遗传操作技术将A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2,SH441)的HA和NA基因与A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)的6个内部基因进行人工重组,拯救并获得了1株禽流感重组病毒441-PR8,并对它的生物学特性进行了研究。结果表明,重组病毒441-PR8株在细胞上的增殖能力明显高于野生毒株SH441,该重组病毒有望成为H9N2亚型禽流感疫苗研制的候选毒株。     

浅谈流感病毒的H A突变与受体识别的关系

近年来,经常发生禽流感病毒由禽类传染给人类的事件,但禽流感病毒在人与人之间却未发生传播,其机制可能是由于流感病毒表面的HA糖蛋白与靶细胞表面的唾液酸受体结合具有特异性。本文主要从A型流感病毒与人类受体结合的特异性、HA氨基酸的突变对禽流感感染人类的影响以及HA突变对流感病毒传播能力的影响等方面初步探讨了流感病毒HA突变与受体识别的关系,以期能为将来人们研究流感病毒的感染和传播机制提供思路。     

禽流感血凝素基因的研究进展

高致病性禽流感(AI)是由禽流感病毒（AⅣ)引起的一种急性传染病,AⅣ 呈球形,有囊膜。其表面主要有两种糖蛋白,其中血凝素(hemagglufinin,HA)具有重要功能：能凝集红细胞,属I型糖蛋白;具有株和亚型的特异性,是AⅣ 型和亚型内新变种判断的主要依据;能结合宿主唾液酸之类的细胞受体;HA在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用,HA 上裂解位点的序列直接影响AI病毒致病性的高低;HA的变异性很强,它的变异是AI病毒发生抗原变异的主要原因,HA是最主要的抗原物质。因此HA对AⅣ的生物学特征具有十分重要的意义。     

禽流感病毒分子生物学最新研究进展

禽流感病毒（AIV）粒子一般为球形，直径为80～120nm。病毒粒子表面有10～12nm的密集状物或纤突覆盖，病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。HA的作用是将病毒粒子吸附在细胞表面受体上，并与病毒的血凝活性相关。NA酶的活性则是通过对受体内神经氨酸的作用，可使新生病毒从细胞中释放出来。禽流感病毒（AIV）的基因组由8条单链负股RNA组成，     

人流感病毒和禽流感病毒感染不同的靶细胞

自1997年以来,发现H5 N1、H9N2、H7N7亚型的禽流感病毒都能感染人。通常认为禽流感病毒在人体内复制受细胞受体和呼吸道细胞外抑制物的限制,但其确切机制却还不清楚。最近,科学家通过体外培养不同的人呼吸道上皮细胞,发现人流感病毒和禽流感病毒分别感染不同的靶细胞。在单周期感染(single- cycle infection)过程中,人流感病毒主要感染无纤毛细胞(non-ciliated cells) ,而禽流感病毒和在鸡胚适应的具有禽流感病毒样受体特异性的人流感病毒主要感染有纤毛的细胞,这与无纤毛细胞上主要有人流感病毒受体(2 - 6位交联的唾液酸) ,有纤毛细胞上…     

1株H9N2亚型禽流感变异株HA基因遗传演化分析及反向遗传操作系统的建立

为了解2018年江苏养殖场分离的1株H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Jiangsu/76/2018 (JS/76)的遗传变异情况,对其HA基因进行了测序和遗传演化分析,并且成功构建JS/76的反向遗传操作系统。HA基因演化分析结果显示,JS/76毒株的HA基因裂解位点为PSRSSR↓GLF,是典型低致病性禽流感病毒(LPAIV)的特征序列。其216位氨基酸为亮氨酸(L),具有哺乳动物α-2, 6唾液酸受体结合特征,并且在127位氨基酸额外增加了一个潜在糖基化NGT。随后,基于流感病毒的"12质粒系统"成功拯救该病毒,命名为r-JS/76,测定其血凝价为1∶1 024。结果显示,r-JS/76在EID_(50)和TCID_(50)等方面保持了与亲本毒株相似的滴度。体外试验证明,拯救毒株与野生毒株在SPF鸡胚和MDCK细胞上的复制能力保持一致,受体结合试验表明拯救病毒与亲本病毒均具有人源受体结合特征,可能已获得感染哺乳动物和人的能力。本研究对H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传演化进行分析并成功建立其反向遗传操作技术平台,为今后探索H9N2流感病毒致病机理、传播机制与基因功能等研究奠定了基础。     

适应H_9亚型禽流感病毒增殖的重组R-MDCK细胞系的建立

克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒p IRES中,构建重组质粒p IRES-ST3GalⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染MDCK细胞,用G418抗性筛选稳定表达的重组细胞R-MDCK。PCR及RT-PCR鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将不同H_9亚型禽流感病毒毒株按相同滴度接种R-MDCK细胞和空白MDCK细胞,通过HA试验和TCID_(50)试验,检测不同H_9亚型禽流感病毒毒株在R-MDCK细胞上的增殖效果。结果发现,所有H_9亚型禽流感病毒毒株在RMDCK细胞HA和TCID_(50)结果均显著高于空白MDCK细胞。ST3GalⅠ基因在第12代R-MDCK细胞中仍能稳定表达,R-MDCK细胞可显著提升H_9亚型低致病性禽流感病毒培养的滴度,可以替代鸡胚用于H_9亚型低致病性禽流感病毒的生产。     

关注禽流感 护佑动物健康

1 禽流感的病原学分类和流行特征 禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属有囊膜的单股RNA病毒，具有神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)．可凝集某些动物的红细胞；对呼吸道系统都有致病性等，特别是这两种病毒对粘多糖和糖蛋白具有特殊的亲合力，尤其是对细胞表面的含唾液酸的受体具有更强的亲合力。流感病毒属共分A、B、C三个血清型，禽流感是属于流感病毒属中的A型流感病毒     

H5亚型禽流感病毒HA基因杆状病毒载体的构建

经过PCR反应,以特异性引物扩增了禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)去除信号肽的HA基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTA中,阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染sf 9昆虫细胞,获得含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒H5HA-Bac HTA。利用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒DNA,PCR反应证实HA基因片段已重组到杆状病毒基因组中。以适宜剂量的重组杆状病毒接种sf 9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞。细胞裂解产物经间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western-Blot试验检测,结果表明:H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒H5HA-Bac-HTA感染sf 9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

流感病毒(H9N2)地方株NA基因的克隆及序列分析

禽流感 (Avian Influenza,AI)是由 A型流感病毒引起各种家禽及野生禽类感染或发生疫病综合征的传染性疾病 [1] 。该病自 1878年首次报道以来已有10 0多年的历史 ,目前已流行于世界上许多国家和地区 ,给养禽业造成了巨大的经济损失 [2～ 3 ]。禽流感病毒 (AIV)囊膜镶嵌的两种纤突—血凝素 (HA)和神经氨酸酶 (NA) ,与病毒的毒力、传播关系密切 [4] 。 NA是 AIV表面仅次于 HA的一种重要抗原 ,具有唾液酸酶的活性 ,可以在病毒感染靶细胞时 ,识别细胞表面流感病毒受体末端的唾液酸残基 ,使病毒能够进入细胞 ;NA的另一个功能是为要出芽的…     

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒(AIV)在广西中越边境地区的流行情况,本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒,命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016(H1N6),对其HA和NA基因进行序列测定,并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示,分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2)的核苷酸同源性最高(96.9%),NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016(H5N6)的核苷酸同源性最高(98.2%)。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒分子特征;与部分N6亚型禽流感病毒一样,分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外,本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定,结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2,3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016(H1N6)是一株重组低致病性禽流感病毒。     

不同MDCK单克隆细胞株对H5亚型禽流感病毒增殖条件和放大工艺的研究

为了解H5亚型禽流感病毒rFJ56株在MDCK全悬浮细胞上的增殖规律,确定100 L生物反应器工艺的最适接毒量和收获时间,对H5亚型禽流感病毒rFJ56株敏感的MDCK全悬浮细胞进行单克隆筛选和全悬浮驯化,筛选出对该毒株最敏感的MDCK单克隆细胞株;在摇瓶工艺的基础上,将该细胞在100 L生物反应器中接种H5亚型禽流感病毒rFJ56株,检测接种后不同时间病毒HA效价和病毒滴度(EID_(50)),确定最适接毒量和收获时间。共筛选出22株MDCK全悬浮细胞单克隆细胞株,其中5株对H5亚型禽流感病毒rFJ56株最敏感,接种后病毒HA效价均可达到9 log2;对MDCK单克隆细胞株按0.01%体积比接种H5亚型禽流感病毒rFJ56株,在100 L生物反应器中培养60 h,HA效价可达10 log2,病毒含量可达10~(8.17)EID_(50)/0.1 mL,可为H5亚型禽流感病毒无血清全悬浮培养放大工艺提供参考。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的遗传稳定性分析及滴度测定

研究表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒pAd-H5的遗传稳定性及重组病毒的滴度。将重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15和20代的重组病毒采用PCR方法扩增禽流感病毒HA基因,并进行基因序列分析;用标记为GFP的快速测定法计算出20代次时重组病毒的滴度。从各代重组病毒DNA中均扩增出了约1700bp的目的条带,与HA基因片段长度一致。基因序列分析表明:第5、10、15代重组病毒中的HA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有1处发生了点突变(即HA基因417位A→G),但其编码的氨基酸未发生变化(即同义突变),表明表达的目的蛋白抗原表位未发生变化;计算出的重组病毒滴度为108.875pfu/0.1mL。重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,具有良好的遗传稳定性,重组腺病毒的病毒滴度相对较高。     

鄱阳湖与青海湖地区野鸟H9N2亚型禽流感病毒的生物学特性

为了解我国野鸟中H9N2亚型禽流感病毒的分布与特征,2015—2016年对鄱阳湖与青海湖地区野鸟中的H9N2病毒进行监测,结果共分离到12株H9N2亚型禽流感病毒。对分离的病毒进行HA和NA基因序列测定、受体分析和SPF鸡、Balb/c小鼠的感染性试验,结果显示:12个分离株的HA裂解位点基序均为PSRSSR/GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;HA蛋白受体结合位点处第226位氨基酸残基为亮氨酸(L),具有结合人样流感病毒受体的分子特征;受体结合试验表明,分离毒株既能结合禽样受体,也能结合人样受体;SPF鸡攻毒试验表明,分离株为低致病性毒株;Balb/c小鼠的感染性试验表明,分离株只在小鼠的上呼吸道鼻甲和肺中有限复制,未见明显临床症状。     

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒（AIV）在广西中越边境地区的流行情况，本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒，命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6），对其HA和NA基因进行序列测定，并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示，分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012（H1N2）的核苷酸同源性最高（96.9%），NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016（H5N6）的核苷酸同源性最高（98.2%）。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF，符合低致病性禽流感病毒分子特征；与部分N6亚型禽流感病毒一样，分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外，本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定，结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2，3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6）是一株重组低致病性禽流感病毒。     

禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的制备和鉴定

以常规方法纯化H9亚型禽流感病毒，制备了两株分泌抗禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞11A5和1182，其上清ELISA效价均为1：10^4，腹水效价为1：10^7和1：10^6，HI效价上清分别为8、7log2，腹水效价均为15log2。采用HI方法证明其对禽流感病毒H9亚型的特异性，通过Western blot方法证明两株单抗都针对H9亚型禽流感病毒HA1蛋白。     

HA蛋白位点变异影响H7N9亚型流感病毒特性的研究进展

2013年春，我国首次出现人感染H7N9亚型禽流感疫情，对家禽养殖和公众健康均产生了严重危害，并且在第5波流行期又演变出血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白裂解位点处存在插入突变的高致病性禽流感病毒株。HA作为A型流感病毒表面表达丰度最高的糖蛋白，在介导病毒与宿主细胞表面受体的结合、促进病毒囊膜与细胞膜的融合、刺激机体产生中和抗体等方面具有至关重要的作用。本文围绕H7N9病毒，简要综述了HA蛋白的结构与功能，及其关键功能氨基酸位点变异影响病毒生物学特性的研究进展，以期为深入解析HA蛋白在H7N9病毒感染致病中的作用提供重要参考。     

1株天鹅源H3N2亚型禽流感病毒的全基因序列分析

为了调查动物园动物禽流感病毒的携带情况，从扬州市动物园采集了106份野禽类新鲜粪便棉拭子样品，进行SPF鸡胚接种、HA/AI试验鉴定、空斑纯化以及HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、M、NS共8个片段扩增及测序分析。结果表明，分离到1株H3N2亚型禽流感病毒，分离率为0.94%,命名为A/Swan/Yangzhou/YZS1084/2019(H3N2)。HA基因裂解位点只有1个碱性氨基酸，符合低致病性禽流感的特征；携带242Q和244G的HA受体结合位点具有优先结合唾液酸α-2,3受体的能力，具有典型禽源特征。在扬州首次分离到的该病毒的8个基因片段均属于欧亚分支，与猪源和人源的毒株差异较大；8个基因片段来源均不相同，具有明显的遗传多样性。