哈茨木霉菌与啶酰菌胺联用对番茄灰霉病菌的增效机制

为验证哈茨木霉菌与啶酰菌胺联用对番茄灰霉病菌的增效作用,采用显微镜观察法观察了菌药联用后哈茨木霉菌和番茄灰霉病菌的菌丝形态,用菌丝生长速率法和圆盘滤膜法测定了菌药联用后哈茨木霉菌挥发性物质、非挥发性物质和粗酶液对番茄灰霉病菌的抑菌活性.结果显示:啶酰菌胺对哈茨木霉菌的菌丝基本无影响,但能使灰霉病菌的菌丝发生间断性溶解;菌药联用后哈茨木霉菌挥发性物质对灰霉病菌的最高抑菌活性为61.17％,而哈茨木霉菌和啶酰菌胺单独对灰霉病菌的抑菌活性分别为48.79％、0.97％,表现增效作用;菌药联用后哈茨木霉菌非挥发性物质和粗酶液对番茄灰霉病菌的抑菌活性未明显增强.研究表明,啶酰菌胺与哈茨木霉菌联用的增效机制是啶酰菌胺导致灰霉病菌的菌丝部分溶解,同时增强了哈茨木霉菌挥发性物质对灰霉病菌的抑菌活性.     

解淀粉芽胞杆菌HRH317抗菌蛋白的分离纯化及其抗菌作用

为探究解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens HRH317菌株所产抗菌蛋白物质对禾谷镰孢菌Fusarium graminearum的抑制机理,采用硫酸铵分级沉淀菌株发酵液,DEAE Sepharose Fast Flow柱和Sephadex G-200柱层析分离纯化抗菌蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗菌蛋白分子量;并采用平板计数法和扫描电子显微镜观察病原菌孢子萌发和菌丝生长情况。结果表明,硫酸铵饱和度为50%时HRH317菌株发酵液的抑菌活性最大,抑菌圈直径可达2.02 cm,显著大于其它饱和度处理;2次柱层析可纯化出抗菌蛋白,分子量约为36.0 k D。禾谷镰孢菌经该抗菌蛋白处理后12h,病原菌孢子萌发率为55.8%,显著低于对照,且2~12 h间其孢子萌发率平均下降了57.3%;该抗菌蛋白还可造成病原菌菌丝变细、畸形与扭曲,且末端膨大等现象。表明解淀粉芽胞杆菌HRH317菌株产生的抗菌蛋白对禾谷镰孢菌孢子萌发和菌丝发育具有较强的抑制作用。     

生防枯草芽孢杆菌L1特性的初步研究

通过对峙培养,测定出枯草芽孢杆菌L1的抑菌谱较宽,特别是对水稻纹枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷镰孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果明显;枯草芽孢杆菌L1不同发酵时间经湿热灭菌处理后,5 d发酵液中抑菌活性物质含量最高,对水稻纹枯病菌菌丝生长抑制率达83.23%,发酵液随时间延长抑菌效果不再增加;枯草芽孢杆菌L1抑菌活性物质对温度不敏感;枯草芽孢杆菌L1发酵液用硫酸铵梯度沉淀法提取粗蛋白在硫酸铵饱和度达60%～70%(不含60%)沉淀的活性物质抑菌效果最好,对水稻纹枯病菌平均抑菌半径达1.15;枯草芽孢杆菌L1对玉米、大豆、小麦、番茄、菜豆、黄瓜、水稻无致病性,而且还有保鲜和促生作用。     

禾谷镰孢菌对苯醚甲环唑的敏感性基线及与其他杀菌剂敏感性的相关性分析

由禾谷镰孢菌引起的赤霉病是小麦上的重要病害，可严重影响小麦的产量并降低小麦的品质。苯醚甲环唑属于三唑类杀菌剂，是甾醇脱甲基化抑制剂，具有较高的抑菌活性。采用菌丝生长速率法测定了于2016—2017采集自河南省的107株禾谷镰孢菌对苯醚甲环唑的敏感性。结果表明:苯醚甲环唑对禾谷镰孢菌菌丝的生长具有较强的抑制效果，其有效抑制中浓度(EC₅₀)值范围为0.0128~0.6079 mg/L，符合正态分布，平均EC₅₀值为(0.2239 ± 0.1192) mg/L。因此，这些敏感性数据可以作为河南省禾谷镰孢菌对苯醚甲环唑的敏感性基线。通过对苯醚甲环唑与其他7种杀菌剂氟环唑、多菌灵、氰烯菌酯、氟唑菌酰羟胺、戊唑醇、丙硫菌唑及叶菌唑对20株禾谷镰孢菌的log₁₀ EC₅₀值之间的Spearman’s rho (ρ) 相关性分析发现:苯醚甲环唑与叶菌唑之间具有较低水平的相关性，与其他供试杀菌剂之间无相关性。本研究可为监测河南省禾谷镰孢菌对苯醚甲环唑的抗药性发展和防控小麦赤霉病合理用药提供依据。     

禾谷镰孢菌对苯醚甲环唑的敏感性基线及与其他杀菌剂敏感性的相关性分析（英文）

由禾谷镰孢菌引起的赤霉病是小麦上的重要病害,可严重影响小麦的产量并降低小麦的品质。苯醚甲环唑属于三唑类杀菌剂,是甾醇脱甲基化抑制剂,具有较高的抑菌活性。采用菌丝生长速率法测定了于2016—2017采集自河南省的107株禾谷镰孢菌对苯醚甲环唑的敏感性。结果表明:苯醚甲环唑对禾谷镰孢菌菌丝的生长具有较强的抑制效果,其有效抑制中浓度(EC_(50))值范围为0.012 8～0.607 9 mg/L,符合正态分布,平均EC_(50)值为(0.223 9±0.119 2)mg/L。因此,这些敏感性数据可以作为河南省禾谷镰孢菌对苯醚甲环唑的敏感性基线。通过对苯醚甲环唑与其他7种杀菌剂氟环唑、多菌灵、氰烯菌酯、氟唑菌酰羟胺、戊唑醇、丙硫菌唑及叶菌唑对20株禾谷镰孢菌的log10 EC_(50)值之间的Spearman’s rho (ρ)相关性分析发现:苯醚甲环唑与叶菌唑之间具有较低水平的相关性,与其他供试杀菌剂之间无相关性。本研究可为监测河南省禾谷镰孢菌对苯醚甲环唑的抗药性发展和防控小麦赤霉病合理用药提供依据。     

枯草芽孢杆菌G3菌株的抗菌物质及其特性

 产几丁质酶枯草芽孢杆菌G3菌株的固体培养物在黄瓜灰霉病菌和番茄叶霉病菌抑菌试验中证实,抑菌活性物质存在于过滤上清液中,它们是从酸沉淀物中提取出的伊枯草菌素、生物表面活性素和存在于盐析粗蛋白中的几丁质酶。在叶霉孢子萌发试验中,伊枯草菌素微弱地抑制孢子萌发但强烈破坏芽管和新生菌丝;生物表面活性素和几丁质酶则强烈抑制孢子萌发并长久性地抑制芽管伸长。在PDA平板上的灰霉菌丝抑菌试验中,伊枯草菌素抑制菌丝生长,引发菌丝顶端膨大,形成泡囊,泡囊破裂后原生质外泄;几丁质酶抑制菌丝生长,引发产生不规则的菌丝团;生物表面活性素在平皿上对菌丝则不显示出抑菌活性。     

死亡谷芽胞杆菌NBIF-001防治番茄棒孢叶斑病研究

为明确死亡谷芽胞杆菌NBIF-001菌株对棒孢叶斑病的防治效果,采用平板对峙结合显微观察确定其对多主棒孢的抑菌活性,并采用活体盆栽试验研究该菌株对番茄棒孢叶斑病防治效果。结果表明,在平板对峙条件下NBIF-001对多主棒孢具有良好的抑菌活性,显微镜下观察到菌丝发生扭曲、肿胀和变形;盆栽试验结果表明NBIF-001对棒孢叶斑病的防治效果达到71.46%。NBIF-001和50%啶酰菌胺WG联用防治番茄棒孢叶斑病的效果明显好于单独施用50%啶酰菌胺WG,具有较明显的增效作用,化学杀菌剂50%啶酰菌胺WG对NBIF-001菌株生长无明显影响,两者具有较好的相容性。     

吖啶橙诱变提高枯草芽孢杆菌G3抗真菌活性

 枯草芽孢杆菌G3菌株正在登记为防治番茄叶霉病的生物杀菌剂。为改进该菌的抗真菌活性,用诱变剂吖啶橙诱变得到20个突变株,其中5个突变株Ga1、Ga8、Ga12、Ga1和Ga19在肉汤和PDA平板上形成粘液状菌落,完全不同于出发菌株。PDA平板抑菌圈试验,突变株对番茄叶霉菌和黄瓜灰霉菌产生比野生株G3更大的透明抑菌圈。其中Ga1菌株对番茄叶霉菌和黄瓜灰霉菌的抑菌带宽分别是G3的1.71和1.69倍。用番茄叶霉菌为指示菌的生物测定结果表明,突变株固体培养物或摇瓶培养物以最小抑菌浓度(M IC)和有效抑菌中浓度(EC₅₀)表示的抗真菌活性皆高于G3菌株。抗真菌活性以Ga1 > Ga8 > Ga19 > Ga12 > Ga13 > G3为序。参试菌株培养物的抗真菌活性与菌量(CFU)不相关,而与甲醇抽提代谢物的干重,尤其是伊枯草菌素A含量呈一定的正相关。突变株Ga1抗真菌活性最强,固体培养物或摇瓶培养物均是G3的3倍左右。摇瓶培养时,伊枯草菌素A动态分泌曲线表明,Ga1菌株产生比G3更多的伊枯草菌素A。Ga1菌株增强了合成伊枯草菌素A的能力。     

芽胞杆菌与嘧菌酯协同应用对葡萄叶部微生物群落及霜霉菌线粒体功能的影响

为明确生防菌剂枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis HMB20428与化学杀菌剂嘧菌酯协同应用对葡萄霜霉菌Plasmopara viticola的抑制机制,结合生物学测定与显微表型观察方法分析其对葡萄霜霉病菌及活孢子囊的抑制作用,采用高通量测序技术分析其对葡萄叶部微生物种群多样性的影响,通过测定生理生化指标研究其对葡萄霜霉菌线粒体功能的作用。结果显示,枯草芽胞杆菌HMB20428与嘧菌酯协同应用对葡萄霜霉病菌的抑制作用显著,对活孢子囊的抑制率为99.05%;两者协同应用对微生物细菌种群有显著影响,枯草芽胞杆菌的优势占位作用明显;但对微生物真菌种群无显著影响;两者协同应用造成葡萄霜霉菌线粒体膜通透性转运孔开放度增加至90.59%,对跨膜电位的抑制率为94.29%,呼吸链酶复合物Ⅰ～Ⅴ的活性分别显著下降56.39%、22.47%、47.90%、60.52%和90.91%,说明葡萄霜霉菌线粒体膜在受到明显损伤和出现代谢功能障碍的同时,呼吸链酶活性明显被抑制,从而导致葡萄霜霉菌的能量代谢和生长受阻。表明枯草芽胞杆菌HMB20428与嘧菌酯协同应用时主要通过促进枯草芽胞杆菌竞争占位和增...     

枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑菌蛋白的分离及鉴定

枯草芽胞杆菌NCD-2菌株对灰葡萄孢菌具有较强的抑菌活性,抑菌蛋白是其产生的抑菌物质之一。本研究为明确NCD-2菌株所产抑菌蛋白的作用方式和特性,采用牛津杯法测定抑菌蛋白的抑菌活性及其对病原菌菌丝生长的影响,采用混合培养法测定其对病原菌分生孢子萌发的影响,同时采用阴离子交换层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其进行分离纯化,并利用MALDI-TOF-MS进行鉴定。结果表明,NCD-2菌株产生的粗蛋白能够显著抑制灰葡萄孢菌分生孢子的萌发和菌丝生长,并导致病原菌菌丝分枝增多、局部膨大肿胀。通过分离纯化获得具抑菌活性的蛋白组分D1-3,经鉴定该蛋白的肽指纹图谱与leucyl aminopeptidase[Bacillus subtilis](WP_041057629.1)的氨基酸序列匹配率最高,达到65%,相对分子质量为53.936 k Da,功能分析表明组分D1-3可能是一种新的抑菌蛋白。     

绿僵菌与FKBP52联合使用对西花蓟马的毒力

为阐明绿僵菌与昆虫免疫抑制蛋白的增效机理,采用浸渍法测定昆虫免疫抑制蛋白FKBP52与金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae对西花蓟马Frankliniella occidentalis的毒力和其体内羧酸酯酶（carboxylesterase,CarE）、谷胱甘肽-S转移酶（glutathione-S transferase,GST）、酚氧化酶（phenoloxidase,PO）及几丁质酶活性的变化。结果显示,金龟子绿僵菌和FKBP52蛋白联合使用对西花蓟马的致死中时LT₅₀为7.32 d,优于绿僵菌单用（10.87 d）或FKBP52蛋白单用的（14.15 d）。金龟子绿僵菌和FKBP52蛋白联合使用9 d时,西花蓟马的累计死亡率达81.11%,显著高于绿僵菌单用（45.56%）或FKBP52蛋白单用的（36.67%）;金龟子绿僵菌和FKBP52蛋白联合使用的协同毒力指数为24.10,表现为增效作用。金龟子绿僵菌与FKBP52蛋白联合使用1 d后,西花蓟马体内CarE和PO活性小于金龟子绿僵菌单用后的活性;联合使用2 d后,西花蓟马体内几丁质酶活性小于绿僵菌单用后的活性,而CarE和GST活性均大于金龟子绿僵菌单用后的活性;联合使用3 d后,西花蓟马体内几丁质酶、CarE和PO活性均大于绿僵菌单用后的活性。表明与金龟子绿僵菌单用相比,金龟子绿僵菌和FKBP52蛋白联合使用后西花蓟马体内CarE、GST、PO和几丁质酶活性抑制或诱导效应与时间有关,这可能是两者具有增效作用的重要机制。     

群体感应调控因子ComA对枯草芽胞杆菌NCD-2抑菌物质产生和生物膜形成的影响

为明确群体感应系统在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑菌活性和生物膜形成中的作用,通过同源重组技术对群体感应系统中的comA基因进行定位缺失突变,分别比较了NCD-2菌株和comA基因突变子在胞外酶合成、抑菌活性、脂肽抗生素(丰产素)产生以及生物膜形成上的差异,并进一步利用实时荧光定量RT-PCR技术比较了二者生物膜基质编码基因epsA和tasA的表达情况。结果表明,通过同源重组技术获得了comA基因突变子MA-4,同菌株NCD-2相比,其在胞外蛋白酶和纤维素酶的合成能力、对番茄灰霉菌Botrytis cinerea的抑菌活性、丰产素的合成量和生物膜的形成能力上均明显下降;生物膜基质编码基因tasA的表达量下降了70%,而epsA的表达量变化不明显。表明ComA是NCD-2菌株脂肽抗生素和生物膜形成中的重要调控因子。     

植物内生枯草芽孢杆菌Em7菌株对葡萄灰霉病菌的抑菌活性

通过室内皿内对峙抑菌试验、分生孢子萌发抑制试验、离体果实接种试验以及电镜技术,研究测定了分离自小麦根部的植物内生枯草芽孢杆菌Em7菌液对葡萄灰霉病菌Botrytiscinerea Pers.的抑制作用及抑菌机理。结果表明:用Em7菌液处理葡萄灰霉病菌后,在PDA培养基上形成了明显的抑菌圈,直径达2.81 cm;菌液对分生孢子萌发的抑制率达到88.65%;经Em7菌液处理后,离体果实病情指数明显低于空白对照,相对防治效果达到78.92%。电镜观察发现,处理组菌丝生长异常,体表凹凸不平,局部膨大成结或缢缩,分枝变多,菌丝体内液泡增多,细胞壁增厚,细胞膜透性发生变化。表明植物内生枯草芽孢杆菌Em7菌株对葡萄灰霉病菌有良好的抑制作用,并且可以有效控制葡萄灰霉病的发生。     

玉米内生菌L10的分离、鉴定及拮抗活性

为获得对玉米茎腐病主要病原菌禾谷镰孢Fusarium graminearum有明显拮抗作用的玉米内生菌,采用平板对峙法从成熟健康玉米茎秆中筛选禾谷镰孢拮抗菌株,并分析其抗菌谱;通过形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析进行菌种鉴定;利用盆栽生防试验检测其对玉米茎腐病的防治效果。结果表明,共分离获得了164株玉米内生细菌菌株,其中L10菌株对禾谷镰孢具有较好的抑制效果,抑菌圈半径达1.68 cm;该菌对玉米大斑病菌Setosphaeria turcica、层出镰孢F. proliferatum、禾谷镰孢F. graminearum、拟轮枝镰孢F. verticilliodes、玉米弯孢叶斑病菌Curvularia lunata、玉米小斑病菌Bipolaris maydis、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、茄链格孢Alternaria solani共8种植物病原菌均有拮抗作用,尤其对禾谷镰孢抑制效果最佳;结合形态特征、生理生化性质及16S rDNA序列分析,将L10菌株鉴定为多粘类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa。L10菌株脂肽类物质对禾谷镰孢菌具有较好的抑制活性,且盆栽生防试验结果显示该菌株对玉米茎腐病具有一定的防治效果。表明菌株L10对玉米镰孢茎腐病的防治具有一定潜力。     

Phenotypic characterization of Pseudomonas fluorescens PfG32R and its spontaneous gacS mutants and biocontrol activity against bacterial wilt disease of tomato

Pseudomonas fluorescens strain PfG32R actively suppresses the occurrence of bacterial wilt disease of tomato caused by Ralstonia solanacearum. To determine the characteristics affected by spontaneous mutations in the gacS gene, three spontaneous mutants NR1, NR9, and ASW6 were tested for production of several enzymes, antimicrobial activity, and biocontrol activity against bacterial wilt disease of tomato in a greenhouse. Production of biosurfactant and of enzymes such as Tween-80 lipase, gelatin protease, and lecithinase; swarming activity; and antifungal activities against Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and F. graminearum were inactivated by mutations in the gacS gene, indicating that they are under the regulation of the GacS/GacA two-component regulatory system. Levan production, swimming, antifungal activity against Magnaporthe grisea, and antibacterial activity against R. solanacearum and Erwinia carotovora ssp. carotovora were not controlled by the GacS/GacA system. Biocontrol activities of the three spontaneous mutants varied from strain to strain, indicating that the biocontrol activities of PfG32R are influenced not only by the GacS/GacA system but also by other complex factors, which may not be regulated by the system.     

Development of PCR assays to Tri7 and Tri13 trichothecene biosynthetic genes, and characterisation of chemotypes of Fusarium graminearum, Fusarium culmorum and Fusarium cerealis

Fusarium graminearum, Fusarium culmorum and Fusarium cerealis are major causal agents of Fusarium Head Blight (scab) which is a disease of global significance in all cereal growing areas. These fungi produce trichothecene mycotoxins, principally nivalenol (NIV) and deoxynivalenol (DON). Genes Tri13 and Tri7 from the trichothecene biosynthetic gene cluster convert DON to NIV (Tri13) and NIV to 4-acetyl-NIV (Tri7). We have developed positive–negative PCR assays based on these two genes, which accurately indicate a DON or NIV chemotype in F. graminearum, F. culmorum and F. cerealis. These assays are useful in assessing the risk of trichothecene contamination, and can be informative in epidemiological studies. All NIV chemotype isolates studied have functional copies of both Tri13 and Tri7, and all DON-producing isolates have both genes disrupted or deleted. We have identified several mutations in these genes, which are conserved across F. graminearum lineage, RAPD and SCAR groupings and between the three species. There appears to be evidence of inter-species hybridisation within the trichothecene biosynthetic gene cluster.     

海洋生境贝莱斯芽孢杆菌TCS001的鉴定及抑真菌活性

为研究海洋生境芽孢杆菌TCS001的分类地位和抑菌活性,通过形态和生理生化特征观察,并结合gyrA序列同源性分析对菌株进行了鉴定;通过平板对峙培养法测定了菌株TCS001对多种植物病原真菌的抑菌谱;采用菌丝生长速率法和凹玻片法,测定了不同浓度TCS001菌株发酵滤液对靶标菌黄瓜灰霉病菌Botrytis cinerea菌丝生长和孢子萌发的影响。结果显示:该菌株为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis,其对6种供试病原菌均有一定的抑制效果,其中对黄瓜灰霉病菌的抑制率最高,达87.66%。不同稀释倍数下,TCS001发酵滤液对黄瓜灰霉病菌均有一定的抑制作用,其中,稀释5倍时对菌丝生长和孢子萌发的抑制率最高,分别为96.24%和98.05%,稀释20倍时抑制率也均达90%以上。形态学观察发现,TCS001发酵滤液可导致黄瓜灰霉病菌孢子萌发芽管中间或顶端膨大畸形。研究表明,海洋生境贝莱斯芽孢杆菌TCS001极具开发为微生物农药的潜能。     

解淀粉芽胞杆菌HRH317对串珠镰孢菌菌丝形态和超微结构的影响

为明确新型生防菌解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens HRH317菌株对病原菌串珠镰孢菌Fusarium moniliforme的抑制作用,采用牛津杯法对HRH317菌株抑菌活性进行测定,并采用扫描电子显微镜、透射电子显微镜和荧光显微镜对经HRH317菌株发酵上清液处理后的串珠镰孢菌菌丝形态及超微结构进行观察。结果显示,HRH317菌株发酵上清液对串珠镰孢菌有很好的抑菌活性,抑菌圈平均直径可达33.31 mm。扫描电镜结果显示,HRH317菌株发酵上清液处理24 h时,串珠镰孢菌菌丝体出现断裂现象;处理72 h时,串珠镰孢菌菌丝体断裂较严重,多处裂解;处理96 h时,串珠镰孢菌菌丝体彻底瓦解,且无完整菌丝体。透射电镜结果显示,HRH317菌株发酵上清液处理72 h时,串珠镰孢菌菌丝体细胞形态扭曲变形,细胞内结构紊乱,遭破坏。荧光显微镜结果显示,经PI染料染色处理12 h时,串珠镰孢菌细胞有少数细胞被染成红色,细胞膜通透性受一定程度破坏;处理16 h时,串珠镰孢菌细胞大面积被染红;处理20 h时,串珠镰孢菌细胞被染色面积增大;处理24 h时,串珠镰孢菌细胞膜受破坏程度增加,细胞内大面积被染色。表明解淀粉芽胞杆菌HRH317菌株对串珠镰孢菌菌丝形态和超微结构有破坏作用,能抑制病原菌串珠镰孢菌菌丝体生长。