脂肽类抗生素fengycin在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑制番茄灰霉病菌中的功能分析

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株及其无细胞发酵液对多种植物病原真菌具有较强的拮抗活性。为了明确NCD-2菌株抑菌作用机理,本研究利用快速蛋白液相色谱技术(FPLC)结合抑菌活性测定,对NCD-2菌株的脂肽类抑菌物质进行分离、纯化,经质谱鉴定,该抑菌物质为芬荠素(fengycin)。从NCD-2菌株中克隆出fengycin合成酶基因fenC及其上游启动子序列,通过同源重组技术对fenC基因进行了内缺失突变,同NCD-2野生型菌株相比,fenC基因缺失突变子丧失了fengycin的合成能力,同时该突变子显著降低了对番茄灰霉病菌的拮抗活性。进一步在离体叶片上比较了NCD-2野生型菌株和突变子之间脂肽提取物和菌体细胞对番茄灰霉病的保护作用,结果发现,突变子不论是脂肽提取物还是菌体细胞显著降低了对番茄灰霉病的防治作用。     

枯草芽胞杆菌NCD-2中调控因子PhoP对fengycin合成的调控作用

 PhoR/PhoP双因子调控系统是枯草芽胞杆菌中一个重要的全局性调控系统, 在低磷环境下, 感应激酶PhoR自磷酸化, 并且将获得的磷酸基团转移到调控因子PhoP上, 从而激活PhoP的调控活性。为了明确调控因子PhoP对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中主要抑菌活性物质-fengycin合成能力的调控作用, 本研究通过同源重组技术缺失突变NCD-2菌株中的phoP基因, 拮抗活性测定结果表明, phoP基因缺失菌株显著降低了对立枯丝核菌的抑菌活性。通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)技术比较了NCD-2菌株野生型及其phoP基因突变子fengycin的合成能力, 结果证明, phoP基因突变菌株降低了fengycin的合成能力。对突变子进行phoP基因互补发现, 互补phoP基因可使突变子的相关性状恢复到野生型菌株水平。以上结果证明, phoP基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中fengycin的合成具有正调控功能。     

PhoR/PhoP双组分系统对枯草芽胞杆菌NCD-2菌落形态和芽胞形成的影响

 双组分PhoR/PhoP是枯草芽胞杆菌中普遍存在的以低磷为信号的调控系统。前期研究发现,PhoR/PhoP双组分系统正调控枯草芽胞杆菌NCD-2菌株脂肽类抗生素fengycin的合成,本研究分析了PhoR/PhoP双组分系统对NCD-2菌株菌落形态和芽胞形成的影响。在有机磷培养基上,NCD-2野生型菌株可以降解有机磷并且形成表面褶皱、立体结构较强的菌落形态,而phoR或phoP基因突变子丧失了降解有机磷的能力,菌落表面光滑、平坦。phoR和phoP基因突变子的互补菌株恢复到了与野生型相似的解磷能力和菌落形态。在低磷和高磷培养基中比较了NCD-2野生型及其衍生菌株的生长及芽胞形成情况,结果表明,在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株的生长速率没有差异,但在低磷培养基中,phoR和phoP基因突变子的菌体生长速率显著降低。芽胞形成能力测定结果表明,在低磷培养基中,NCD-2野生型菌株的芽胞形成率较高,而phoR和phoP基因突变子的芽胞形成率显著降低;在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株芽胞形成率普遍较低并且无显著差异。RT-PCR分析显示, phoR和phoP的突变均显著降低了芽胞形成相关基因spo II GA的表达,相比感应激酶PhoR,调控因子PhoP对spo II GA基因的影响更显著。     

PhoR/PhoP双组分系统对枯草芽胞杆菌NCD-2菌落形态和芽胞形成的影响

 双组分PhoR/PhoP是枯草芽胞杆菌中普遍存在的以低磷为信号的调控系统。前期研究发现,PhoR/PhoP双组分系统正调控枯草芽胞杆菌NCD-2菌株脂肽类抗生素fengycin的合成,本研究分析了PhoR/PhoP双组分系统对NCD-2菌株菌落形态和芽胞形成的影响。在有机磷培养基上,NCD-2野生型菌株可以降解有机磷并且形成表面褶皱、立体结构较强的菌落形态,而phoR或phoP基因突变子丧失了降解有机磷的能力,菌落表面光滑、平坦。phoR和phoP基因突变子的互补菌株恢复到了与野生型相似的解磷能力和菌落形态。在低磷和高磷培养基中比较了NCD-2野生型及其衍生菌株的生长及芽胞形成情况,结果表明,在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株的生长速率没有差异,但在低磷培养基中,phoR和phoP基因突变子的菌体生长速率显著降低。芽胞形成能力测定结果表明,在低磷培养基中,NCD-2野生型菌株的芽胞形成率较高,而phoR和phoP基因突变子的芽胞形成率显著降低;在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株芽胞形成率普遍较低并且无显著差异。RT-PCR分析显示, phoR和phoP的突变均显著降低了芽胞形成相关基因spo II GA的表达,相比感应激酶PhoR,调控因子PhoP对spo II GA基因的影响更显著。     

ywbB基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成和根际定殖能力的影响

为明确枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis NCD-2菌株生物膜形成相关基因及其在生物膜形成、根际定殖中的作用,采用转座子插入技术,从4000余株NCD-2突变子中获得6株生物膜形成能力降低的突变子。在生物膜形成能力丧失的突变子M3中,转座子以单拷贝的形式插入到ywbB基因内部。通过基因同源重组技术对ywbB基因进行缺失突变,获得ywbB基因缺失突变菌株NCD-2(ΔywbB),与野生菌株相比,突变子丧失了生物膜形成能力。进一步比较发现,突变菌株NCD-2(ΔywbB)显著降低了在棉花根际的群体数量,同时也降低了对棉花立枯病的防治效果。研究证明,ywbB是NCD-2菌株生物膜形成途径中的重要基因,且生物膜形成与NCD-2菌株根际定殖和生防效果呈正相关。     

PhoR/PhoP双组份对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中surfactin合成的影响

 Surfactin是由芽胞杆菌类细菌产生的一种脂肽类物质,具有溶血活性和排油能力,并且与细菌生物膜形成和根际定殖能力相关。本研究分析了PhoR/PhoP双组份对生防枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中surfactin合成的影响。在低磷环境下,同NCD-2野生型菌株相比,PhoR和PhoP突变子显著降低了NCD-2菌株的溶血活性;NCD-2菌株的排油能力很强,而PhoR和PhoP突变子均丧失排油能力;NCD-2野生型菌株的生物膜形成能力分别是PhoR和PhoP突变子的2.0和2.2倍。通过FPLC色谱分析技术证明NCD-2菌株可以产生surfactin,并发现在低磷条件中,野生型菌株NCD-2所产生的surfactin分别是PhoR和PhoP突变子的2.3和6.4倍。通过RT-qPCR技术分析了surfactin合成酶基因srfAA在不同菌株中的表达情况,结果表明在低磷环境下,PhoR和PhoP突变子中srfAA基因的表达量比NCD-2野生型菌株均降低了2.1倍。构建PhoR和PhoP突变子的互补菌株,证明互补菌株均能使突变子的性状恢复到野生型水平。以上结果证明,PhoR/PhoP双组份影响surfactin的合成。     

脂肽类抗生素fengycin对大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成的影响

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能够产生脂肽类抗生素fengycin和surfactin。本研究分别比较了NCD-2野生型菌株、丧失fengycin合成的突变子MF和丧失surfactin合成的突变子MS对大丽轮枝菌的抑菌活性。结果表明,NCD-2菌株和突变子MS周围能形成清晰的透明圈,而突变子MF周围透明圈模糊,说明fengycin对大丽轮枝菌具有抑菌活性。不同浓度的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制试验表明,NCD-2野生型菌株的脂肽提取物能抑制大丽轮枝菌孢子萌发,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率为46.30%,且随着脂肽浓度的提高抑制效果更加明显;同野生型菌株相比,突变子MF脂肽提取物显著降低了对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制效果,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率仅为18.48%,而突变子MS的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发抑制效果与野生型菌株没有显著差异。通过测试脂肽提取物对微菌核形成的影响,发现野生型菌株和突变子MS脂肽提取物均能够显著抑制微菌核的形成,而突变子MF几乎丧失了对微菌核形成的抑制作用。RT-qPCR结果证明,野生型菌株和突变子MS脂肽提取物能抑制微菌核形成相关基因的表达,而突变子MF丧失了对微菌核形成相关基因表达的抑制作用。以上结果证明,fengycin在NCD-2菌株抑制大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成中发挥主要作用。     

脂肽类抗生素fengycin对大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成的影响

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能够产生脂肽类抗生素fengycin和surfactin。本研究分别比较了NCD-2野生型菌株、丧失fengycin合成的突变子MF和丧失surfactin合成的突变子MS对大丽轮枝菌的抑菌活性。结果表明,NCD-2菌株和突变子MS周围能形成清晰的透明圈,而突变子MF周围透明圈模糊,说明fengycin对大丽轮枝菌具有抑菌活性。不同浓度的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制试验表明,NCD-2野生型菌株的脂肽提取物能抑制大丽轮枝菌孢子萌发,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率为46.30%,且随着脂肽浓度的提高抑制效果更加明显;同野生型菌株相比,突变子MF脂肽提取物显著降低了对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制效果,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率仅为18.48%,而突变子MS的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发抑制效果与野生型菌株没有显著差异。通过测试脂肽提取物对微菌核形成的影响,发现野生型菌株和突变子MS脂肽提取物均能够显著抑制微菌核的形成,而突变子MF几乎丧失了对微菌核形成的抑制作用。RT-qPCR结果证明,野生型菌株和突变子MS脂肽提取物能抑制微菌核形成相关基因的表达,而突变子MF丧失了对微菌核形成相关基因表达的抑制作用。以上结果证明,fengycin在NCD-2菌株抑制大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成中发挥主要作用。     

ywbB基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株菌落形态和芽胞形成的调控

枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能有效防治作物土传病害,前期研究证实,ywbB基因正调控NCD-2菌株生物膜形成和根际定殖能力。本研究进一步分析了ywbB基因对NCD-2菌株的生长、菌落形态和芽胞产生等性状的影响。结果表明,同NCD-2野生型菌株相比,突变子ΔywbB降低了在LB和2×SG培养基中的生长速率;在LB或2×SG培养基上,NCD-2菌株可以形成褶皱的菌落形态,而ΔywbB突变子菌落形态平坦,没有褶皱。在2×SG培养基中培养60 h后,NCD-2菌株的芽胞形成率达到68.6%,而ΔywbB突变子的芽胞形成率仅为18.5%。通过RT-qPCR技术分析了ywbB突变后对其上游基因ywbA、下游基因ywbC、芽胞形成相关基因spoIIAA表达量的影响,结果表明,突变ywbB后对ywbA、ywbC基因的表达量没有明显的影响,而ΔywbB突变子中spoIIAA的表达量较NCD-2野生型菌株相比显著降低。     

L-脯氨酸对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成的影响

 枯草芽胞杆菌 NCD-2菌株在棉花品种‘冀棉11'根际的定殖能力与其根系分泌物中的L-脯氨酸相关。本研究通过外源添加L-脯氨酸评价其对NCD-2菌株生长量和生物膜形成的影响。结果表明,在MSgg培养基中添加L-脯氨酸培养48 h后对菌株生长不存在显著影响。采用称重法测定生物膜的湿重和干重,结果表明在MSgg培养基添加L-脯氨酸显著增加了生物膜产量,且生物膜的褶皱程度和立体结构变得更为明显。采用结晶紫染色法进行生物膜的定量测定发现,浓度为1.250～10.000 mg·mL^-1的L-脯氨酸可以显著提高菌株生物膜形成能力,而低浓度0.625 mg·mL^-1 的L-脯氨酸对生物膜形成无影响。通过RT-qPCR检测了NCD-2菌株生物膜形成相关基因tasA和epsA表达量的变化,结果表明,添加上述不同浓度L-脯氨酸能够显著提高tasA基因表达量,提高了2.53~9.98倍。除了浓度为0.625 mg·mL^-1 L-脯氨酸可提高epsA基因表达外,其他浓度没有显著改变epsA基因的表达,而且epsA基因表达量低于tasA基因。综合分析表明,L-脯氨酸促进NCD-2菌株生物膜形成不是通过改变菌株生长量,而是诱导tasA基因的表达产生更多的胞外蛋白TasA。     

内生真菌HND5菌株抗香蕉枯萎病菌相关非核糖体多肽合成酶基因簇的鉴定

为明确帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariae HND5菌株具体的抑菌活性物质,在全基因组测序数据的基础上,利用生物信息学对抑菌活性物质合成基因簇进行定位,通过聚类分析和系统发育树分析对基因簇合成产物进行鉴定,并通过基因缺失突变构建及代谢组分析确定具体的抑菌活性物质。结果显示,HND5菌株共含有7个非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)基因簇,聚类分析结果表明基因簇29合成产物为噬铁素,基因簇30合成产物为类环孢霉素类抗菌多肽;系统发育树结合生物信息学结果显示基因簇30合成产物与已知环孢霉素结构差异大,为一个新型非核糖体多肽;将基因簇30 NRPS基因缺失突变后,HND5菌株丧失抑菌活性;同野生型菌株相比,基因簇30 NRPS基因缺失突变体缺失一个分子量为887.54 Da的多肽类物质。表明HND5菌株的抑菌活性物质为一个分子量为887.54 Da的新型类环孢霉素非核糖体多肽,基因簇30负责该多肽的生物合成。     

Biological control of peach brown rot (<Emphasis Type="Italic">Monilinia</Emphasis> spp.) by <Emphasis Type="Italic">Bacillus subtilis</Emphasis> CPA-8 is based on production of fengycin-like lipopeptides

Bacillus subtilis CPA-8, a strain with demonstrated ability to control Monilinia spp. in peaches, was studied to elucidate its mechanisms of antifungal activity. Growth inhibition assays using cell-free supernatants and butanolic extracts showed strong antifungal activities against Monilinia laxa and Monilinia fructicola. By comparison with the reference B. subtilis strains UMAF6614 and UMAF6639, fengycin, iturin and surfactin lipopeptides were identified by thin layer chromatography in butanolic extracts from cell-free supernatants, indicating that antibiosis could be a major factor involved in the biological control ability of CPA-8. TLC-bioautography analysis confirmed the presence of fengycin, iturin and surfactin lipopeptides but strong antifungal activity could be associated only with fengycin lipopeptides. These results were definitively supported by mutagenesis analysis targeted to suppress fengycin biosynthesis by disruption of the B. subtilis fenB gene. By TLC-bioautography analysis it was possible to identify transformants from CPA-8 with reduced or suppressed antifungal activity, and this phenotype was associated with the lack of fengycin bands. Fruit trials confirmed that fengycin-defective mutants and their cell-free supernatants lost their ability to control peach brown rot disease in comparison with CPA-8 wild type strain or Serenade Max®, a commercial formulation based on B. subtilis. Furthermore, population dynamics studies determined that CPA-8 fengycin-deficient mutants survived in wounds in peach fruit equally well as the CPA-8 wild type. Taken together our data indicate that fengycin-like lipopeptides play a major role in the biological control potential of B. subtilis CPA-8 against peach brown rot.     

FgLEU1在禾谷镰刀菌亮氨酸生物合成及产毒致病中起关键作用

为挖掘新型药剂的潜在靶标,利用靶向基因敲除和互补技术研究赤霉病病原菌禾谷镰刀菌Fusarium graminearum中必需氨基酸亮氨酸合成酶编码基因FgLEU1的功能,并测定禾谷镰刀菌的生物学表型。结果表明,FgLEU1编码亮氨酸合成途径中的3-异丙基苹果酸脱水酶,其敲除突变体表现亮氨酸营养缺陷。生物学表型测定结果显示,与野生型菌株相比,FgLEU1敲除突变体的产孢量和孢子萌发率显著下降,产孢量仅为野生型菌株的20.96%,培养4 h后孢子萌发率下降了49.45%,且合成脱氧雪腐镰刀烯醇（呕吐毒素）能力丧失,在麦穗上的致病力下降,仅能侵染接种小穗,赤霉病症状不能扩展。外源添加一定量的亮氨酸、FgLeu1催化产物或导入含启动子的全长FgLEU1基因可以恢复敲除突变体表型缺陷。表明FgLEU1基因在禾谷镰刀菌亮氨酸合成、菌丝孢子形成及产毒致病过程中发挥着重要作用,可作为新型安全杀菌剂的潜在研发靶标,用于持续有效控制麦类赤霉病和镰刀菌毒素。