生防菌混合接种对葡萄灰霉病菌的防治效果

本研究以葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea为靶标菌，通过抑菌圈试验、分生孢子萌发抑制试验、离体果实接种试验，将枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis GLB191和短小芽胞杆菌Bacillus pumilus GLB197生防菌株单独或混合接种，初步探究了单菌株和两菌株混合对葡萄灰霉病菌的抑制效果。试验结果表明，各处理抑菌圈大小达30 mm以上，灰霉孢子萌发抑制率达94%以上，其中两菌株混合500倍稀释液对孢子萌发抑制率高于单菌株处理；离体果实接种试验表明，两菌株混合处理病斑抑制率高达70.89%，高于单菌株GLB191和GLB197的病斑抑制率55.48%和52.91%。田间防效试验表明，两菌株混合防效与化学药剂无显著差异，防效为70.02%。因此，两菌株混合接种可更有效地防治葡萄灰霉病的发生。     

特基拉芽胞杆菌JN-369抗菌粗蛋白的理化性质和抑菌效果

特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis JN-369是1株对稻瘟病菌Magnaporthe oryzae有较好拮抗作用的植物内生细菌，其发酵液经硫酸铵沉淀后得到抗菌粗蛋白。为明确菌株JN-369抗菌粗蛋白的抑菌机理，首先确定了该抗菌粗蛋白抑菌谱、热稳定性、酸碱稳定性、紫外稳定性以及酶稳定性，并观察研究了抗菌粗蛋白对稻瘟病菌菌丝和分生孢子的抑制作用。并采用针刺离体接种法测定了40%稻瘟灵EC、25%三环唑WP及不同浓度JN-369抗菌粗蛋白对水稻稻瘟病的拮抗效果。结果表明：菌株JN-369抗菌粗蛋白抑菌谱广，对葡萄灰霉病菌、草莓灰霉病菌和水稻稻瘟病菌等13种植物病原真菌及卵菌表现出抑制作用，而对油菜菌核病菌没有抑制作用；该粗蛋白理化性质相对稳定，具有应用于粮食作物生物防治的潜力；对稻瘟病菌的菌丝生长和分生孢子萌发有双重抑制作用，能使病原菌菌丝细胞膨大，并可抑制病菌分生孢子的萌发；离体防效试验显示，供试杀菌剂对水稻稻瘟病均有显著的拮抗效果，菌株JN-369抗菌粗蛋白在浓度为50～100 μg/mL时对稻瘟病的拮抗效果最好，该菌株有望开发为防治稻瘟病的生防菌株。     

微生物以菌克菌在葡萄上的应用

利用枯草芽孢杆菌(依天得)在室内对葡萄蔓枯病菌和葡萄灰霉病的病原菌进行了防效测定。结果表明,枯草芽孢杆菌对葡萄蔓枯病菌和葡萄灰霉病的病原菌均有较好的防效,分别为:93.37%和93.07%。同时还对枯草芽孢杆菌的抑菌机理进行了初步研究,结果表明该拮抗菌可以溶解致病菌菌丝。     

酵母菌0939-5对葡萄灰霉病菌抑制作用研究

采用双皿对扣法和平板隔离对峙法研究了酵母菌0939-5对葡萄灰霉菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用,并根据其产生的挥发性物质,以活性炭处理检验其对葡萄灰霉病菌丝和分生孢子的抑制作用。结果表明,酵母菌0939-5产生的挥发性物质对葡萄灰霉病菌的生长(抑制率为71.59%)及其分生孢子(抑制率为99.33%)的萌发具有显著的抑制作用;添加活性炭吸附后,葡萄灰霉病菌菌丝的生长及分生孢子的萌发恢复了活性,显著降低了抑制作用。同时,酵母菌0939-5产生的挥发性物质对7种病原真菌也具有明显的抑制作用,尤其对棉花立枯丝核菌病菌(Rhizoctonia solani Kühn)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahlia)的抑菌效果较好,其抑菌率达90.93%~94.00%。     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B-912对采后柑桔果实青、绿霉病的抑制效果

 用从土壤中分离到的枯草芽孢杆菌B-912作为生防拮抗菌,主要研究在不同贮藏温度下不同接种时间的B-912活菌液、热处理液和过滤液对柑桔青、绿霉病的抑制效果。B-912活菌液的抑菌效果最佳,热处理液和过滤液次之,但均显著地好于对照。较高的贮藏温度有利于拮抗菌对病菌的抑制作用,活菌液处理的果实在25℃下的发病率及病斑直径均小于15℃下的果实,24h后接种病菌孢子的果实其发病率及病斑直径一般都高于48h后接种的果实。实验证明,枯草芽孢杆菌的抑菌机理主要是产生抗菌素。     

葡萄灰霉病生防芽胞杆菌的筛选与防效评价

本研究从新疆、山东及河北等地区采集的健康葡萄根际土壤中分离生防菌，以葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea为靶标菌，通过平板对峙试验、葡萄叶片和果实上的离体抑菌试验，筛选获得4株生防菌BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1具有较好的拮抗作用，经形态学和分子生物学方法分别鉴定为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis、解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens、枯草芽胞杆菌B.subtilis和蜡样芽胞杆菌B.cereus；4株生防菌所制成的生物菌肥，对葡萄灰霉病的田间防效可达到66.50%～85.68%，具有开发应用潜力。     

植物内生放线菌Fq24和Lj20对番茄早疫病菌的抑制作用

本文测定了2株植物内生放线菌在离体条件下对番茄早疫病菌的作用效果。结果表明,植物内生放线菌Fq24和Lj20的3种不同处理液对番茄早疫病痛原菌分生孢子萌发都有抑制作用,Lj20无菌发酵滤液的抑制效果最好;Lj20皿内和发酵液对番茄早疫病病原菌的抑制作用要好于Fq24;诱发接种后2株植物内生放线菌对采收后番茄果实上的番茄早疫病菌均有不同程度的控制作用,在30℃条件下的防治效果优于20℃的效果。     

石榴皮萃取物对番茄灰霉病菌抑制作用及防病效果

试验测定了石榴皮萃取物对番茄灰霉病菌室内抑菌作用和对番茄灰霉病的温室盆栽防治作用。室内抑菌试验分别采用生长速率法和孢子萌发法测定对番茄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用,结果表明：正丁醇萃取物对病原菌菌丝的抑制活性最高,EC50为50.28 g/L;浓度为200 g/L对番茄灰霉病菌分生孢子的产生具有显著的抑制作用,抑制作用与浓度呈正相关关系。在温室盆栽试验中, 正丁醇萃取物稀释100倍的处理对番茄灰霉病的保护防治效果达到46.41%,治疗防治效果达到48.00%。     

生防枯草芽孢杆菌L1特性的初步研究

通过对峙培养,测定出枯草芽孢杆菌L1的抑菌谱较宽,特别是对水稻纹枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷镰孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果明显;枯草芽孢杆菌L1不同发酵时间经湿热灭菌处理后,5 d发酵液中抑菌活性物质含量最高,对水稻纹枯病菌菌丝生长抑制率达83.23%,发酵液随时间延长抑菌效果不再增加;枯草芽孢杆菌L1抑菌活性物质对温度不敏感;枯草芽孢杆菌L1发酵液用硫酸铵梯度沉淀法提取粗蛋白在硫酸铵饱和度达60%～70%(不含60%)沉淀的活性物质抑菌效果最好,对水稻纹枯病菌平均抑菌半径达1.15;枯草芽孢杆菌L1对玉米、大豆、小麦、番茄、菜豆、黄瓜、水稻无致病性,而且还有保鲜和促生作用。     

七株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治作用

通过分生孢子萌发试验、菌丝抑制试验、接种离体枝条试验及田间病斑涂抹药剂防治试验,研究了7株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治效果。结果表明,7株植物内生放线菌无菌发酵滤液对病原菌分生孢子萌发及菌丝生长均有明显的抑制作用,2倍稀释液对孢子萌发抑制率均达85%以上,20倍稀释液对菌丝生长抑制率均达80%以上。显微观察发现,Hhs.015 (BAR1-5)菌株无菌发酵滤液可导致病菌芽管、菌丝畸形。在人工接种条件下,无菌发酵滤液原液对离体枝条病斑扩展具有明显的抑制作用,其中AR1-14、Hhs.015 (BAR1-5)和TGYXCSA-7处理5天后防治效果分别达83.2%、69.7%和85.6%。田间刮除病斑后涂抹放线菌发酵原液也可明显抑制病斑复发,防效均达80%以上。     

海洋生境贝莱斯芽孢杆菌TCS001的鉴定及抑真菌活性

为研究海洋生境芽孢杆菌TCS001的分类地位和抑菌活性,通过形态和生理生化特征观察,并结合gyrA序列同源性分析对菌株进行了鉴定;通过平板对峙培养法测定了菌株TCS001对多种植物病原真菌的抑菌谱;采用菌丝生长速率法和凹玻片法,测定了不同浓度TCS001菌株发酵滤液对靶标菌黄瓜灰霉病菌Botrytis cinerea菌丝生长和孢子萌发的影响。结果显示:该菌株为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis,其对6种供试病原菌均有一定的抑制效果,其中对黄瓜灰霉病菌的抑制率最高,达87.66%。不同稀释倍数下,TCS001发酵滤液对黄瓜灰霉病菌均有一定的抑制作用,其中,稀释5倍时对菌丝生长和孢子萌发的抑制率最高,分别为96.24%和98.05%,稀释20倍时抑制率也均达90%以上。形态学观察发现,TCS001发酵滤液可导致黄瓜灰霉病菌孢子萌发芽管中间或顶端膨大畸形。研究表明,海洋生境贝莱斯芽孢杆菌TCS001极具开发为微生物农药的潜能。     

球孢白僵菌定殖提高番茄对灰霉病抗性及其作用机理

为明确球孢白僵菌Beauveria bassiana定殖对番茄植株抗病性的影响及作用机理,采用灌根法将球孢白僵菌芽生孢子悬浮液接种于番茄植株内,并通过人工接种灰霉菌Botrytis cinerea评价球孢白僵菌定殖后番茄对灰霉病的抗性水平;检测灰霉菌胁迫下番茄植株不同位置叶片内球孢白僵菌的相对含量;测定番茄叶片内草酸氧化酶（oxalate oxidase,OXO）、几丁质酶（chitinase,CHI）和ATP合成酶（ATP synthase,atpA）3种抗病相关基因的表达量。结果表明,球孢白僵菌定殖能够提高番茄植株对灰霉病的抗性,接种灰霉菌第5天,番茄植株发病率、病斑直径和病情指数分别下降了61.6%、41.4%和26.4%;在灰霉菌胁迫下番茄植株内球孢白僵菌偏好于在病原菌感染位置定向聚集,并且引起植物抗病基因OXO、CHI和atpA的表达量上调。表明球孢白僵菌能通过内生定殖与植物互作提高植物抗病性,在植物病害生物防治领域有较大应用潜力。     

番茄灰霉病菌对咯菌腈的抗性诱变及抗药突变体的生物学特性

为评估番茄灰霉病菌Botrytis cinerea对咯菌腈的抗性风险,就室内经紫外照射获得抗药突变体的方法及抗性突变体的生物学性状进行了研究。结果表明:番茄灰霉病菌分生孢子的紫外照射亚致死时间为90~120 s;经亚致死时间紫外照射后,4个亲本菌株中有2个菌株共产生了6个抗咯菌腈的突变体,其EC50值是亲本菌株的310倍以上,抗性突变频率为3.13×10-7;经紫外照射诱变获得的所有抗性突变体在菌丝生长速率、产孢量、产菌核能力及其在番茄果实上的致病性方面均比其亲本菌株明显降低。相关分析显示,所得抗咯菌腈突变体对氟啶胺、啶菌唑、啶酰菌胺和嘧霉胺无交互抗性。表明番茄灰霉病菌对咯菌腈的抗药性风险较低。     

Development ofClonostachys rosea and interactions withBotrytis cinerea in rose leaves and residues

The effect of microclimate variables on development ofClonostachys rosea and biocontrol ofBotrytis cinerea was investigated on rose leaves and crop residues. C.rosea established and sporulated abundantly on inoculated leaflets incubated for 7–35 days at 10°, 20° and 30°C and then placed on paraquat—chloramphenical agar (PCA) for 15 days at 20°C. On leaflets kept at 10°C, the sporulation after incubation on PCA increased from 60% to 93% on samples taken 7 to 21 days after inoculation, but decreased to 45% on material sampled after 35 days. A similar pattern was observed on leaves incubated at either 20° or 30°C. The sporulation ofC. rosea on leaf disks on PCA was not affected when the onset of high humidity occurred 0, 4, 8, 12 or 16 h after inoculation. However, sporulation was reduced to 54–58% on leaflets kept for 20–24 h under dry conditions after inoculation and before being placed on PCA. The fungus sporulated on 68–74% of the surface of leaf disks kept for up to 24 h at high humidity after inoculation, but decreased to 40–51% if the high humidity period before transferral to PCA was prolonged to 36–48 h. The growth ofC. rosea on leaflets was reduced at low inoculum concentrations (10³ and 10⁴ conidia/ml) because of competition with indigenous microorganisms, but at higher concentrations (10⁵ and 10⁶ conidia/ml) the indigenous fungi were inhibited. Regardless of the time of application ofC. rosea in relation toB. cinerea, the pathogen’s sporulation was reduced by more than 99%. The antagonist was able to parasitize hyphae and conidiophores ofB. cinerea in the leaf residues. AsC. rosea exhibited flexibility in association with rose leaves under a wide range of microclimatic conditions, and in reducingB. cinerea sporulation on rose leaves and residues, it can be expected to suppress the pathogen effectively in rose production systems.     

球孢白僵菌对松墨天牛的致病力及其与花绒寄甲的相容性

为探明昆虫病原真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana与天敌昆虫花绒寄甲Dastarcus helophoroides的相容性,观察4株球孢白僵菌菌株的生长性状、产孢量以及孢子萌发率,并选用Bb3275和Bb202菌株测定其对松墨天牛Monochamus alternatus的致病力以及对花绒寄甲的毒力;同时在模拟环境条件下,分别用Bb3275和Bb202菌株的孢子悬浮液先侵染松墨天牛幼虫,再按1∶1比例将花绒寄甲与受侵染的松墨天牛置于同一环境下饲养,观察花绒寄甲的死亡率。结果显示,孢子悬浮液浓度为1×10⁶孢子/mL至1×10⁸孢子/mL时,Bb3275菌株和Bb202菌株对松墨天牛幼虫和成虫的致病力与对照组相比均有显著差异;经4种浓度Bb3275和Bb202菌株侵染花绒寄甲幼虫和成虫15 d后,仅在高浓度1×10⁸孢子/mL时表现出轻微致死作用,但花绒寄甲的存活率均高于85.00%;模拟条件下,松墨天牛幼虫校正死亡率均在80.00%以上,而同环境下花绒寄甲幼虫和成虫均表现出良好的活力,且侵染率为0。表明球孢白僵菌和花绒寄甲之间具有很好的相容性,可以同时应用于松墨天牛的生物防治。     

四种杀菌剂对烟草灰霉病菌的毒力及对烟草灰霉病的抑制作用

为筛选防治烟草灰霉病的有效药剂,采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定氟啶胺、咪鲜胺、苯醚甲环唑及代森锰锌4种杀菌剂对烟草灰霉病菌Botrytis cinerea的毒力,同时通过离体叶片评价这4种杀菌剂对烟草灰霉病的保护和治疗作用。结果表明,氟啶胺和咪鲜胺对菌丝生长活性抑制最强,有效抑制中浓度ECjs50平均值分别为0.02、0.03 mg/L,苯醚甲环唑次之,代森锰锌最弱,EC_(js50)平均值分别为0.39、7.86 mg/L;氟啶胺对孢子萌发活性抑制最强,代森锰锌次之,有效抑制中浓度EC_(mf50)平均值分别为0.06、0.16 mg/L,咪鲜胺和苯醚甲环唑最弱,ECmf50平均值均大于25.00 mg/L。离体试验表明,氟啶胺对烟草灰霉病保护作用最强,浓度为50 mg/L时,防治效果为100.00%,咪鲜胺和苯醚甲环唑次之,防治效果分别为88.62%和76.46%,代森锰锌最弱,浓度为1 000 mg/L时防治效果仅为75.81%;氟啶胺对烟草灰霉病治疗作用最强,浓度为100 mg/L时的防治效果为85.75%,咪鲜胺和苯醚甲环唑次之,浓度为200 mg/L时的防治效果分别为85.47%和76.48%,代森锰锌最弱,浓度为1 000 mg/L时防治效果为70.24%。表明氟啶胺和咪鲜胺更适合烟草灰霉病的防治。     

武夷菌素对番茄灰霉菌的抑制作用及对番茄抗病性相关酶活性的影响

采用凹陷载玻片法测定了武夷菌素对番茄灰霉菌分生孢子萌发的抑制作用,在离体番茄叶片上测定了被武夷菌素处理后的番茄灰霉菌菌丝和分生孢子致病性的变化以及武夷菌素对番茄幼苗体内抗病性相关酶活性的影响。结果表明:武夷菌素对番茄灰霉菌的分生孢子有较强的抑制作用,其EC₅₀为14.1μg／mL。浓度为100μg／mL的武夷菌素可完全抑制孢子的萌发。武夷菌素能使灰霉菌菌丝和分生孢子的致病性明显下降,同时还能诱导番茄体内抗病性相关酶(SOD、POD、PPO、PAL)活性的增强,提高番茄幼苗的抗病性。     

南方根结线虫MiV901基因在拟南芥中的异源表达及其表型分析

为明确南方根结线虫Meloidogyne incognita效应蛋白MiV901在其寄生过程中的生物学功能,通过构建MiV901基因的植物表达载体,利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的花序浸染法将其转化拟南芥Arabidopsis thaliana,并采用室内人工接种法测定转基因植株对灰葡萄孢 Botrytis cinerea侵染及南方根结线虫寄生的影响。结果显示：经Southern blot检测,MiV901基因以不同的拷贝数插入到转基因拟南芥株系901-6、901-8和901-12的基因组中,且qPCR检测结果证实 MiV901基因能够正常表达。3个转基因拟南芥株系901-6、901-8和901-12叶部接种灰葡萄孢3 d后,叶片上形成的病斑平均直径分别为1.00、1.06、1.05 cm,比野生型对照扩大了9.9%~16.5%。相比野生型对照,转基因拟南芥株系901-12、901-6和901-8接种南方根结线虫2龄幼虫后根系上产生了更多的雌虫和卵块,雌虫数分别显著增加了45.4%、34.4%和23.7%,卵块数分别显著增加了51.2%、 46.3%和31.7%。表明异源表达MiV901基因能够抑制植物免疫,增加拟南芥对灰葡萄孢和南方根结线虫侵染的敏感性。     

牛至精油及其主要成分香芹酚和百里酚对16种植物病原真菌的抑制活性

为评价牛至精油及其2种主要成分香芹酚和百里酚在植物真菌病害防治方面的应用前景，采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定3种物质对16种植物病原真菌菌丝生长和孢子萌发的抑制活性，并采用黄瓜子叶法测定其对黄瓜灰霉病的防治效果。结果表明，牛至精油在500 mg/L浓度处理下可完全抑制番茄早疫病菌Alternaria solani、黄瓜灰霉病菌Botrytis cinerea和小麦根腐病菌Bipolaris sorokiniana等12种植物病原真菌的菌丝生长，对棉花黄萎病菌Verticillium dahliae的菌丝生长抑制率也达到97.66%。牛至精油对这13种病原真菌的EC₅₀在83.09~236.58 mg/L之间，香芹酚和百里酚对这13种病原真菌的毒力均高于牛至精油，其中香芹酚对黄瓜灰霉病菌、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis、棉花黄萎病菌和小麦茎基腐病菌Fusarium pseudograminearum菌丝生长的毒力较强，EC₅₀分别为9.09、22.45、24.28、28.40和28.80 mg/L；百里酚对黄瓜灰霉病菌和小麦全蚀病菌菌丝生长的毒力较强，EC50分别为21.32 mg/L和27.08 mg/L。香芹酚和百里酚对棉花黄萎病菌、玉米大斑病菌Setosphaeria turcica、苦瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.momordicae、黄瓜灰霉病菌和黄瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare的孢子萌发亦有较强毒力，其EC₅₀为3.78~289.07 mg/L。1 000 mg/L牛至精油对黄瓜灰霉病的预防效果与400 mg/L嘧霉胺悬浮剂的预防效果无显著差异；500 mg/L百里酚对黄瓜灰霉病的预防效果和治疗效果均与400 mg/L嘧霉胺悬浮剂的效果相当，而香芹酚的治疗效果显著优于400 mg/L嘧霉胺悬浮剂。表明牛至精油及其主要成分香芹酚和百里酚的抑菌谱广且活性强，具有作为植物源杀菌剂的开发应用潜力。     

拟南芥转录因子IDD4不同突变体对灰葡萄孢菌的抗性分析

为明确IDD家族IDD4基因在拟南芥Arabidopsis thaliana抵抗灰葡萄孢菌Botrytis cinerea侵染过程中的作用,通过统计病情指数检测拟南芥野生型（wild type,WT）植株、过表达植株IDD4-OE和缺失突变体idd4植株感染灰葡萄孢菌情况,利用组织染色检测叶片细胞死亡和H₂O₂的积累情况,采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative-PT-PCR,qRT-PCR）技术分析灰葡萄孢菌肌动蛋白基因Bc. ACTIN在3种植株叶片中的表达情况,并施加0.1 mmol/L外源水杨酸（salicylic acid,SA）后测定IDD4-OE植株的病情指数。结果显示,不同株系对灰葡萄孢菌的抗性由高到低依次为idd4＞WT＞IDD4-OE,IDD4-OE植株中病原菌感染部位的寄主细胞死亡程度比idd4植株严重。染色结果表明,病原菌侵染拟南芥后4 h,接种部位已有H₂O₂积累。qRT-PCR反应结果显示,Bc. ACTIN在IDD4-OE中比在idd4植株中的表达水平更高,表明灰葡萄孢菌在IDD4-OE植株中的繁殖速率更快。对IDD4-OE植株外源施加SA后,其病情指数、Bc. ACTIN表达量与WT植株间均无显著差异,说明SA能将感病植株的抗性提高至WT植株的水平,表明IDD4作为负调控因子参与了拟南芥对灰葡萄孢菌的抗性调控,SA在其中发挥着重要作用。