鳢肠乙醇粗提物与Cry1Ca的协同增效及对甜菜夜蛾SeABCC1―SeABCC3 mRNA表达量的影响

本试验旨在明确鳢肠Eclipta prostrata乙醇粗提物与Bt毒素Cry1Ca防治甜菜夜蛾Spodoptera exigua的协同增效作用,及对甜菜夜蛾转运蛋白C(SeABCC1―SeABCC3)m RNA表达量的影响。结果表明,鳢肠乙醇粗提物对甜菜夜蛾2龄幼虫具有明显毒杀作用,喂食5.26 mg/cm2鳢肠乙醇粗提物7 d后,幼虫死亡率为58.4%;喂食鳢肠乙醇粗提物(LD_(30))与Cry1Ca(LD_(30))混合物3、5和7 d死亡率分别为59.72%、73.61%和83.33%,但仅喂食Cry1Ca(LD_(30))死亡率分别为5.6%、13.9%和31.9%,仅喂食鳢肠乙醇粗提物(LD_(30))死亡率分别为21.8%、28.7%和30.1%,鳢肠乙醇粗提物与Cry1Ca的协同增效作用显著;qPCR分析SeABCC1―SeABCC3 mRNA表达量变化,经鳢肠乙醇粗提物(LD_(30))处理后SeABCC1、SeABCC2和SeABCC3表达量升高,引起甜菜夜蛾幼虫对Cry1Ca的敏感性升高。综上所述,鳢肠乙醇粗提物可作为植物源农药与Bt毒素混配使用,提高对甜菜夜蛾的防治效果。     

对甜菜夜蛾高杀虫毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ah5的克隆表达

利用生物活性测定方法从本实验室已分离保存的Bt菌株中筛选出了5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的菌株。该5株Bt菌株对甜菜夜蛾初孵幼虫的LC₅₀值为0.556~0.914mg/mL胞晶混合物,其中GS3菌株杀虫活性最高,LC₅₀值为0.556mg/mL胞晶混合物;包含晶体形态主要是球形、大菱形、小菱形等;所含基因类型主要是cry1Aa、cry1Ab、cry1La、cry1Ia、cry1Ib、cry2Ab、cry2Ad、cry2Ah、cry7Ab、cry9Ba等;5株菌株均表达约60kD和130~150kD蛋白,其中2株还表达较弱的80kD蛋白。从GS3菌株中克隆得到一种新的cry2A基因,GenBank登录号为KT692984,由Bt基因国际命名委员会命名为cry2Ah5。该基因开放阅读框为1899bp,编码632个氨基酸,编码蛋白分子量为70.8kD,等电点pI为8.18,与其他Cry2Ah蛋白序列相似性为97%~99%。该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达约70kD蛋白,与预测分子量相符。本研究筛选得到5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的Bt菌株,克隆表达了一种新的cry2A基因cry2Ah5,为甜菜夜蛾的生物防治提供了新的菌株及基因资源。     

球孢白僵菌MZ050724对亚洲玉米螟幼虫毒力测定研究

利用浓度为4.0×104、4.0×105、4.0×106、4.0×107、4.0×108个/mL的球孢白僵菌MZ050724分生孢子液对3龄和4龄的亚洲玉米螟幼虫进行毒力测定研究。结果表明,该菌株具有较高的杀虫活性。对3龄幼虫最高累计校正死亡率为88.65%,致死中浓度是(2.195±0.135)×104个/mL,致死中时间是(4.30±0.16)d;对4龄幼虫最高累计校正死亡率为85.75%,其致死中浓度(4.362±0.088)×105个/mL,致死中时间为(4.77±0.11)d。相比较对3龄幼虫的防治效果好于对4龄幼虫的防治效果。     

油松毛虫幼虫抗菌物质及其抗菌活性研究

采用体内注射法,对油松毛虫Dendrolimus tabulaeformisTsaietLiu3龄幼虫注射浓度为1.0×108孢子/mL的大肠杆菌Escherichia coli菌悬液,诱导其产生抗菌物质,12h后收集制备血淋巴粗提液。分别测定对4种细菌和4种真菌的抗菌活性,并检测温度、pH值变化和反复冻融对抗菌活性的影响。采用Tricine-SDS-PAGE电泳法确定抗菌物质的分子量大小。结果发现,诱导后的油松毛虫3龄幼虫血淋巴粗提液对试验的细菌和真菌均有不同程度的抑制作用,其中对革兰氏阴性细菌大肠杆菌E.coli和变形杆菌Proteus species的抑制作用强于革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。血淋巴粗提液的的抗菌活性在50℃水浴处理和4~9的pH值条件下保持稳定,反复冻融1~5次抗菌物质的活性降低4.3%~14.9%。电泳结果显示,诱导组血淋巴粗提液在23.2kD和15.0kD处分别出现一条特异性条带,在60.4kD处蛋白带变浅。由此推测从油松毛虫幼虫体内诱导产生的抗菌物质分子量可能是23.2kD和15.0kD。     

真核表达产物Y3诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性研究

从毛头鬼伞Coprinus comatus中提取的碱性糖蛋白Y3可以降低烟草花叶病毒（TMV）的侵染。克隆获得Y3蛋白cDNA后与真核表达载体pPIC-9k连接,重组载体pPIC-9k-Y3成功电转化入毕赤酵母Pichia pastoris后,转化子在28℃、250 r/min培养条件下,使用1.0%甲醇诱导表达6 d,成功实现了Y3蛋白的真核表达。300 μg/mL浓度的Y3蛋白对普通烟进行诱导处理后摩擦接种TMV结果表明,诱导处理后烟草体内除过氧化物酶POD外,多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL和β-1,3葡聚糖酶活性都有不同程度提高。蛋白处理24 h后植株中PPO活性达到最大,为对照组的2倍。利用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）研究抗性相关基因表达情况,Y3诱导后烟草植株碱性病程相关基因1（PR1-b）、病程相关基因非表达子1（NPR1）、PAL在转录水平上均显著上调（P<0.05）。推测真核表达产物Y3蛋白可通过提高水杨酸信号途径相关防御酶活性以及抗病基因转录来诱导烟草对TMV产生系统抗性,为Y3蛋白作为生物农药开发提供理论基础。     

对暗黑鳃金龟成虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选

暗黑鳃金龟Holotrichia parallela是一种重要的农业害虫,其成虫和幼虫均能对多种作物造成严重危害。为筛选对暗黑鳃金龟成虫具有毒杀活性的Bt蛋白,本研究首先对暗黑鳃金龟成虫的生活习性进行观察,用浸泡蛋白的榆树叶饲喂成虫,建立了Bt蛋白对暗黑鳃金龟成虫的生物学活性测定方法;制备了6种Bt Cry8类杀虫晶体全长蛋白和胰蛋白酶消化蛋白,对暗黑鳃金龟成虫进行了杀虫活性测定。初筛结果发现Cry8Ga1原毒素和消化蛋白均对暗黑鳃金龟成虫具有较高毒杀活性,其在浓度1.0 mg/mL时对暗黑鳃金龟成虫的7 d校正死亡率分别为100%和55%。为更进一步确定Cry8Ga1蛋白的杀虫活性,进行了致死中浓度测定,7 d生测结果显示,Cry8Ga1原毒素的LC₅₀为0.387 mg/mL （95%置信区间为0.108~0.746 mg/mL）,Cry8Ga1蛋白经胰蛋白酶消化后的LC₅₀为0.702 mg/mL （95%置信区间为0.150~2.664 mg/mL）。取食Cry8Ga1原毒素蛋白及其消化蛋白后的暗黑鳃金龟成虫中肠细胞产生显著的病理学变化。本研究筛选到对暗黑鳃金龟成虫有毒杀作用的Bt蛋白,研究结果将为金龟子的生物防治开辟新的途径。     

烯虫酯对烟草甲和烟草粉螟的生物活性

为明确烯虫酯对烟叶仓储害虫烟草甲和烟草粉螟的生物活性, 采用卵卡浸渍法测定烯虫酯对孵化率的影响, 采用浸叶法测定对化蛹率、羽化率和发育历期的影响。结果表明, 烯虫酯对烟草甲和烟草粉螟的致死效果随浓度的升高而增强。烯虫酯可显著降低两种害虫卵的孵化率、幼虫化蛹率及成虫羽化率, 并可明显延长幼虫的发育历期。其中, 5 mg/kg烯虫酯处理烟草甲和烟草粉螟卵7 d的校正死亡率分别为67.2%和50.7%, 处理烟草甲幼虫42 d的校正死亡率为57.1%, 处理烟草粉螟幼虫84 d的校正死亡率为60.1%, 幼虫化蛹率分别为9.6%和3.6%, 成虫不能正常羽化。因此, 5 mg/kg为室内筛选出的可同时防治这两种害虫的烯虫酯适宜浓度。     

苏云金芽孢杆菌cry基因在大肠杆菌中表达产物和生物活性

研究了几种Bt cry基因于大肠杆菌(Escherichia coli)中表达产物在pH 10.0的50mmol/L碳酸钠和20mmol/L乙醇胺溶解液中的溶解性 ,发现同样的Cry蛋白在碳酸钠中的溶解度大于乙醇胺。通过胰蛋白酶消化 ,明确Cry1Ca7、Cry1Ia8酶解产物为 38kD多肽 ;Cry1Ie1、Cry1Cb2、Cry2Ab4酶解产物为 41kD多肽 ;Cry1Ac酶解产物为60kD多肽。采用FPLC层析方法对 6种原毒素及其酶解后得到的毒素多肽进行了分离纯化 ,比较了原毒素和毒素的杀虫活性的差异。其结果表明 ,Cry1Ac的原毒素和毒素对棉铃虫初孵幼虫的校正死亡率均为 100% ,Cry2Ab4的原毒素的毒力高于其酶解毒素。     

毕赤酵母Mut+和Muts重组子表达美洲商陆抗病毒蛋白基因的比较

 将N末端信号肽和C末端毒性区域缺失突变的美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein,PAP)基因表达载体pPIC9KP酶切线性化后,通过电击转化整合到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115菌株细胞中,PCR筛选出表型为利用甲醇快速型(Mut⁺)的重组子。在相同培养条件下比较Mut⁺重组子和利用甲醇缓慢型(Mut^s)重组子在表达缺失突变型PAP方面的异同。结果表明,诱导培养48 h后,Mut⁺重组子表达产物在SDS-PAGE胶上可见清晰目的带,而Mut^s重组子培养72 h才能见到微弱的目的带。抗病毒活性实验表明Mut⁺重组子和Mut^s重组子的表达产物均对TMV病毒侵染有明显的抑制作用,它们的抗病毒活性没有显著的差异。     

马铃薯Y病毒N株系HC-Pro基因在毕赤酵母中分泌表达与鉴定

 以克隆载体pGEMT-PVY-NHC为模板,用PCR方法获得HC-Pro基因,构建表达载体pPIC9K-HC,将重组质粒经Sal I单酶切后电转化Pachia pichia GS115菌株,筛选出对G418有高抗性和在MM培养基上生长缓慢的转化子。经摇瓶发酵和1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵液上清,在66 kD处有1个特异条带表达,目的条带蛋白占上清液总蛋白的40%。Western blot鉴定表明,表达蛋白可以和HC抗体发生结合反应。     

小菜蛾腺苷受体基因PxAdoR克隆及杀虫靶标作用

利用蝉花虫草Ophiocordyceps sobolifera代谢产物N6-（2-羟乙基）腺苷（HEA）作用于小菜蛾Plutella xylostella L.获得差异表达的片段,采用RT-PCR和RACE技术从小菜蛾中克隆全长1828 bp的小菜蛾腺苷受体（Plutella xylostella adenosine receptor,PxAdoR）基因,通过生物信息学软件预测和分析蛋白质结构,PxAdoR为分子量49.2 kD,没有信号肽,疏水性不稳定蛋白,具有7次跨膜螺旋结构的一类G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor,GPCRs）。利用HEA及哺乳动物腺苷受体A2aR抑制剂SCH58261处理小菜蛾2龄幼虫,结果显示联合使用HEA和SCH58261后36~60 h,可使HEA引起的小菜蛾2龄幼虫的校正死亡率显著降低（42.7%~53.9%,P<0.05）;而联合用药后36、48、60 h小菜蛾2龄幼虫体重增长抑制率由43.3%、38.3%、46.2%显著降低（P<0.05）到13.2%、10.3%、8.6%。本研究表明SCH58261能显著降低HEA引起的小菜蛾2龄幼虫的死亡率和体重增长抑制率,HEA可能是通过PxAdoR而起作用,PxAdoR基因可以作为新的杀虫靶点用于害虫控制研究。     

用毕赤酵母表达李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因及表达产物抗血清的制备与研究

用RT-PCR的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白(CP)基因,然后将其连接到pGEM-T载体上,得到pGEM-T-PNRSV重组载体,然后将其克隆到真核表达载体pPIC9K上,转化毕赤酵母GS115菌株后,在甲醇的诱导下表达外壳蛋白,表达产物经过SDS-PAGE及Western-blot分析,结果表明该病毒的CP基因在毕赤酵母中得到了高效表达,回收表达蛋白并免疫家兔,获得PNRSV特异性抗血清共计40mL,经过间接酶联免疫吸附法测定其效价为3.2×104,本研究利用基因克隆的方法来制备PNRSV抗血清,完全避免了用该病毒的繁殖来制备抗血清而导致该病毒扩散蔓延的风险。     

棉铃虫类肌钙蛋白基因的克隆、原核表达纯化及其时空表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)类肌钙蛋白基因HaCal的生理功能及其所编码蛋白的生物特性,采用PCR方法克隆了HaCal的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,借助在线软件对其进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达和纯化其编码的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术分析其在棉铃虫不同发育龄期和组织中的表达量。结果显示,HaCal的ORF序列长度为564 bp,编码187个氨基酸,理论分子量为20.52 kD,理论等电点为7.64。其保守结构域与Calponin家族一致,但不含跨膜区和信号肽,系亲水性蛋白。原核表达结果显示,融合蛋白大小与理论值一致,纯化获得了纯度较高的目的蛋白。HaCal在棉铃虫幼虫不同发育阶段和不同组织中均有表达,在6龄幼虫体内表达量最高,是1龄幼虫的2.34倍;在5龄幼虫中肠中表达量最高,是头部的257.14倍。表明棉铃虫类肌钙蛋白基因HaCal可能与棉铃虫的生长发育过程密切相关。     

一株莱氏绿僵菌的筛选及其对草地贪夜蛾的毒力

开展草地贪夜蛾病原真菌的筛选和毒力测定可为草地贪夜蛾的绿色防控提供新的生物制剂。本研究从广西南宁田间采集的草地贪夜蛾幼虫僵虫上分离获得一株病原真菌,采用形态学和ITS-rDNA序列分析相结合的方法对该菌株进行了鉴定,并采用浸虫法测定了该菌株对草地贪夜蛾的致病力。结果表明新分离的菌株为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi,编号为CDTLJ1;该菌株对草地贪夜蛾幼虫、预蛹、蛹均有致病力,1.20×10⁷孢子/mL浓度下,接菌处理后第6 d,2~5龄幼虫的累积校正死亡率均达100%,6龄幼虫的累积校正死亡率为98.33%,预蛹和蛹的累积校正死亡率分别为28.33%、20.00%,草地贪夜蛾2~6龄幼虫的LT50值从3.91 d升至4.24 d;菌株CDTLJ1对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死率随孢子悬浮液浓度的升高而增加,当浓度达1×10⁸孢子/mL时,幼虫的致死LT50为4.10 d,接菌处理后第6 d,3龄幼虫的累积校正死亡率达100%,LC₅₀为1.12×10⁴孢子/mL。结果表明,莱氏绿僵菌CDTLJ1对草地贪夜蛾有良好的生防潜力,具有进一步深入研究和开发利用的前景。     

不同药剂组合对稻飞虱和稻纵卷叶螟的防效及安全性

于2021年在浙江省桐庐县施用不同药剂组合在单季稻五(3)代稻飞虱、稻纵卷叶螟主害代若虫(幼虫)高峰期进行田间防治试验。结果显示，喷施1次10%三氟苯嘧啶SC 16 mL/667m² +6%阿维·氯苯酰SC 50 mL/667m²和喷施1次60%吡蚜·呋虫胺WG 18 g/667m² +30%茚虫威WG 10 g/667m²,对五(3)代稻飞虱的速效、控效均较好，药后3 d校正防效分别达90%和88%,药后7 d～14 d校正防效均达97%以上；对五(3)代稻纵卷叶螟幼虫、保叶效果也均较好，药后6 d对幼虫校正防效分别达75%和83%,对虫苞校正防效分别达82%和73%,药后13 d对虫苞校正防效仍分别达80%和81%;且均对稻飞虱主要天敌蜘蛛较安全。以上说明杀虫剂混施对单季稻五(3)代稻飞虱和稻纵稻纵卷叶螟主害代适期防治一次，具有较好的综合防控效果，可因地制宜在单季稻区轮换推广使用。     

8种杀虫剂对草地贪夜蛾幼虫的室内杀虫活性及毒力测定

为筛选农业生产中防治草地贪夜蛾幼虫效果较好的杀虫剂,以草地贪夜蛾初孵幼虫和3龄幼虫作为试材,采用浸叶法,研究了8种杀虫剂对草地贪夜蛾幼虫的室内杀虫活性和毒力测定。结果表明：8种杀虫剂对草地贪夜蛾初孵幼虫在田间推荐最低剂量下药后72 h、对3龄幼虫在田间推荐最高剂量下药后96 h的校正死亡率均为100%,都具有很好的杀虫活性;在室内毒力测定中,10%多杀霉素甲维盐WG和5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG对草地贪夜蛾初孵幼虫药后24 h和48 h的LC₅₀值分别为0.010 8 mg/L和0.010 9 mg/L,以及0.009 1 mg/L和0.007 7 mg/L,相对毒力较高;5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG对3龄幼虫药后24 h和48 h的LC₅₀值分别为0.024 6 mg/L和0.017 9 mg/L,相对毒力最高;8种杀虫剂对草地贪夜蛾初孵幼虫和3龄幼虫均表现为同一杀虫剂对初孵幼虫的LC₅₀值小于处理相同时间下对3龄幼虫的LC₅₀值,且同一杀虫剂处理48 h的LC₅₀值小于...     

蜈蚣草提取物杀虫活性初步研究

采用触杀法和拒食法测定了蜈蚣草甲醇粗提物和石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇4种溶剂萃取物对莴苣指管蚜和斜纹夜蛾的杀虫活性.结果表明,三氯甲烷萃取物对两种害虫具有较高的杀虫活性.莴苣指管蚜随着提取物质量浓度的增大和处理时间的延长,其校正死亡率升高.质量浓度为10 mg/mL时,莴苣指管蚜72h的校正死亡率达到86.92％,LC50为1.724 2 mg/mL;斜纹夜蛾4龄幼虫24h的非选择性拒食率为65.76％,AFC50为3.934 6 mg/mL.     

保幼激素诱导尖唇散白蚁兵蚁分化的特征及其相关基因的表达谱

为明确保幼激素调控白蚁兵蚁分化的机理，以尖唇散白蚁Reticulitermes aculabialis为研究对象，用保幼激素Ⅲ及其类似物吡丙醚诱导其工蚁向兵蚁分化，并用荧光定量PCR技术对兵蚁分化过程中保幼激素信号相关基因的表达模式进行分析。结果显示，春、夏季节保幼激素Ⅲ和吡丙醚对尖唇散白蚁前兵蚁的诱导率和死亡率均高于秋、冬季节，如在春、夏季的诱导率最高达60.84%，死亡率最高为47.18%；而在秋、冬季的诱导率最高仅为20.00%，死亡率最高为12.50%。相同浓度的保幼激素Ⅲ和吡丙醚诱导尖唇散白蚁时，在前兵蚁阶段Met、Kr-h1、Br-C和USP基因的表达模式基本相似，除了USP外，均有表达高峰；Met在前兵蚁阶段的第5天达到高峰；保幼激素Ⅲ诱导与吡丙醚诱导相比，Kr-h1和Br-C的表达高峰均提前2 d。不同浓度的吡丙醚诱导白蚁时，120 μg/mL和160 μg/mL浓度诱导下Met、Kr-h1和Br-C基因均在第5天出现表达高峰（Br-C的160 μg/mL处理除外，表达高峰推迟2 d）。表明春、夏季保幼激素及其类似物更容易诱导分化出前兵蚁，且保幼激素Ⅲ比吡丙醚对下游基因的影响更明显。     

海南槟榔园昆虫病原线虫对红脉穗螟的致病力

红脉穗螟Tirathaba rufivena Walker是槟榔上的重要害虫。本研究采用大蜡螟诱捕法,对海南省主要槟榔产区槟榔园中采集到的土样进行昆虫病原线虫的诱捕,并评估了目标线虫对红脉穗螟的致病力。在采集的150份土样中共有12个土样经检测发现含有昆虫病原线虫,检出率为8%。其中,屯昌、定安和万宁三个市县采集的土样中检出的带线虫比率相对较高,分别为12.90%、11.76%和10.00%,而海口和保亭土样中未检出昆虫病原线虫。在室内以大蜡螟为试虫测试线虫的致病力,结果表明诱捕的12个线虫种群均对大蜡螟幼虫具有一定的致病力,但致病力的大小存在较大差异（120 h校正死亡率21.11%～72.22%）。选取致病力较高的Tc05、Wn01和Wn09样本测试对红脉穗螟3龄幼虫的致病作用,结果显示在600 IJs/mL线虫液处理后24 h,Wn01种群对寄主的校正死亡率达到86.67%,半致死浓度LC₅₀为283.70 IJs/mL;Tc05和Wn09对红脉穗螟的致病力相近,校正死亡率分别为61.67%和65.00%,LC₅₀分别为504.75 IJs/mL和502.70 IJs/mL。研究表明,Wn01,Tc05和Wn09线虫种群对红脉穗螟幼虫具有一定的控制潜力。     

苏云金芽胞杆菌G033A对新发南美番茄潜叶蛾的室内毒力及田间防效

南美番茄潜叶蛾Tuta absoluta（Meyrick）是新近传入我国的一种世界毁灭性番茄害虫，对我国番茄产业的潜在威胁巨大。为有效控制南美番茄潜叶蛾，测定了新型苏云金芽胞杆菌基因工程菌G033A（Bt G033A）对该昆虫的室内毒力及田间防效。结果表明，在室内条件下，以32000 IU/mg Bt G033A WP处理过的番茄叶片饲喂南美番茄潜叶蛾幼虫，其室内毒力效果由高至底依次为4龄幼虫，3龄幼虫，1～2龄幼虫，致死中浓度LC₅₀分别为14.63、15.59和23.17 g/L；浓度在10 g/L及以上时，Bt G033A对南美番茄潜叶蛾各龄幼虫的毒力均较高，处理后96 h（第4 d）校正死亡率均超过90%。在田间条件下，以Bt G033A WP 100倍液（10 g/L）喷雾防治低龄幼虫即有较好的防效，药后第5 d对1龄和2龄幼虫的校正死亡率分别为89.1%和98.0%，药后第7 d对1龄和2龄幼虫的校正死亡率均为100%；并且，与常用的生物杀虫药剂鱼藤酮的防效相当。研究结果对有机蔬菜生产基地新发南美番茄潜叶蛾的有效控制及其综合防控方案制定，具有重要指导意义。