苏云金芽孢杆菌cry218基因改造

通过合成特异性的寡核苷酸，利用定点突变和ＰＣＲ扩增技术，在苏云金芽孢杆菌ｃｒｙ２１８杀虫晶体蛋白基因的编码区上游－１４４ｂｐ和下游２４２ｂｐ处分别引入ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ位点，以利于该基因克隆到其它表达载体中。当修饰后的ｃｒｙ２１８基因克隆到表达载体和穿梭载体后，均能表达出对小菜蛾有毒的１３０ｋＤａ蛋白质     

桂林喀斯特地貌分布区苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定

从桂林喀斯特地貌分布区采集了165份天然土壤样品,从中分离出10株苏云金芽孢杆菌。光学显微镜观察发现有菱形、球形、不规则等晶体类型。通过核酸电泳比对其大质粒DNA的图谱来区分菌株的类型,发现该批菌株有良好的多样性。对这10株菌进行cry1、cry11、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10类基因的PCR-RFLP鉴定,在8株菌中分别发现含有cry1、cry11、cry2、cry3等基因类型,而G4、G6菌株中不含有已知基因。SDS-PAGE分析了10株野生菌株的杀虫晶体蛋白表达谱,发现有10株表达约130kD蛋白,有3株既表达130kD蛋白又表达60kD蛋白。对大猿叶甲、小菜蛾进行了杀虫活性测定,发现了一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株G8,其LC50为48.2μg/ml,置信区间为9.6～1.4ml;有6株菌株对小菜蛾有高活性。     

苏云金芽孢杆菌cry9Aa基因的克隆、表达及活性分析

为了解决目前广泛使用的cry1A类基因的抗性问题,获得对鳞翅目害虫高效杀虫基因,从菌株SC5D2和T03C001中鉴定并克隆到了2个新型cry9Aa基因,被Bt国际命名委员会分别正式命名为cry9Aa3和cry9Aa4,并进一步对其编码的蛋白进行活性测定。结果显示,2个基因对小菜蛾、玉米螟均具有较高的杀虫活性,其中对小菜蛾的LC50分别为1.83μg/mL和1.90μg/mL,对玉米螟的LC50分别为6.93μg/mL和1.06μg/mL。同时,两种Cry9Aa蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾都具有较高的杀虫活性,LC50分别为1.74μg/mL和1.39μg/mL,与敏感小菜蛾杀虫活性测定数据相当,表明Cry9Aa与Cry1Ac没有交互抗性。     

苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基因鉴定、克隆及杀虫活性分析

苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、cry2Ab和一种新的cry1类基因,SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达,在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs)基因,并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段(1.95kb)插入表达载体pET-21b,转化EscherichiacoliRosetta(DE3)菌株,表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性,LC50分别为100.74μg/mL和29.87μg/mL,进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。     

苏云金芽孢杆菌菌株B-Pr-88的生物学特性

就自行分离的、对鳞翅目夜蛾科害虫具有高毒力的Bt菌株B-Pr-88的生物学特性进行了系统研究.B-Pr-88可形成菱形、球形和不规则形等多种形态的晶体,主要由130kDa和60kDa两种蛋白组成;酯酶型与标准菌株蜡螟亚种和库斯塔克亚种一致,同属于galleriae型;10项生理生化反应结果表明,B-Pr-88与标准菌株蜡螟亚种反应一致;B-Pr-88菌株至少含有3种大小不同的质粒,经PCR-RFLP鉴定该菌株至少包括cry2Ab、cry9Ba和多种cry1(包括cry1Cb、cry1Db、cry1Fb和cry1Gb)等6种不同的杀虫晶体蛋白基因.     

苏云金杆菌（Bt）芽孢的杀虫作用

本文简要综述了苏云金杆菌（Ｂｔ）芽孢的杀虫作用。讨论了Ｂｔ芽孢和晶体之间的增效作用，芽孢孢衣蛋白和晶体蛋白的同源性，芽孢孢衣蛋白的杀虫活性以及芽孢杀虫的可能机制。     

苏云金芽孢杆菌防治鞘翅目害虫的研究进展

本文综述了国内外有关防治鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌菌株、杀虫晶体蛋白及作用方式、生物测定以及制剂和应用等方面的研究进展。     

北京植物园苏云金芽胞杆菌菌株的分离鉴定

[目的]从北京植物园采集的土壤样品中分离高毒力的苏云金芽胞杆菌.[方法]采用温度法筛选Bt菌株,比对大质粒DNA图谱,区分不同类型的Bt菌株,PCR-RFLP方法对cry1～cry40类基因型进行鉴定,SDS-PAGE分析杀虫晶体蛋白,测定Bt分离株对大猿叶甲、小菜蛾幼虫的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株.[结果]从149份土壤样品中分离出147株Bt,分为12种类型,含有菱形、方形、球形和不规则等晶体类型;6株菌中分别含有fry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cy1Ah、cry1Ba、cry1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab和cry7Aa等基因类型,其余6株中不含有已知基因.有9株表达约130 ku蛋白,1株表达约70 ku蛋白,2株表达约150 ku蛋白,有3株既表达130 ku蛋白又表达60 ku蛋白;发现一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株ZWY-7,1株对小菜蛾有高毒力的菌株ZWY-9,2株菌都没有检测到已知基因型.[结论]北京植物园中Bt分布广泛,类型多样,其中发现两株高毒力的菌株,有望获得新的杀虫基因.     

植物提取物对苏云金芽孢杆菌杀虫活性的影响

植物提取物对苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)的杀虫活性有不同程度的影响。试验结果表明,处理48 h后,花椒Zanthoxylum bungeanum、假连翘Duranta repens、南洋楹Albizia falcataria、羊蹄甲Bauhinia variegata、番石榴Psidium guajava、荷花玉兰Magnolia grandiflora 的乙醇提取物对Bt的杀虫活性有显著增效作用; 小蜡Ligustrum sinense、胜红蓟Ageratum conyzoides、 一品红Euphorbia pulcherrima、烟草Nicotiana tabacum、南洋杉Araucaria cunninghamii、 繁缕Stellaria media、光叶子花Bougainvillea glabra、小飞蓬Conyza canadensis、地肤Kochia scoparia的乙醇提取物对Bt杀虫活性有显著拮抗作用;其他植物提取物则没有显著影响。     

苏云金杆菌(Bt)芽孢的杀虫作用

本文简要综述了苏云金杆菌(Bt)芽孢的杀虫作用。讨论了Bt芽孢和晶体之间的增效作用,芽孢孢衣蛋白和晶体蛋白的同源性,芽孢孢衣蛋白的杀虫活性以及芽孢杀虫的可能机制。     

四川盆地部分地区土壤中苏云金芽胞杆菌分离与cry基因鉴定*

［目的］ 对四川盆地土壤中Bt资源进行研究,了解其分布特点,为我国苏云金芽胞杆菌的储备奠定基础。［方法］ 从四川盆地5个地区采集土样,分离苏云金芽胞杆菌野生菌株。利用PCR RFLP及SDS PAGE方法对Bt分离株进行基因型鉴定和蛋白分析,并对其室内杀虫活性进行初步测定。［结果］ 从207份土样中获得26株苏云金芽胞杆菌野生菌株,出菌率为12.56%。油镜观察可看到球形、方形、菱形及不规则形的伴胞晶体。在21株Bt分离株中检测到cry1、cry1I、cry2、cry9四类基因,且多数菌株都是同时含有多个基因类型,有5株Bt分离株未发现已知基因;SDS-PAGE显示有9株菌株只表达了130 ku的蛋白, 2株只表达了124 ku的蛋白,2株只表达了45 ku的蛋白,6株同时表达了130 ku和60 ku的蛋白, 4株同时表达了124 ku和60 ku的蛋白, 2株同时表达了135 ku和60 ku的蛋白, 1株同时表达了130、90 ku及75 ku的蛋白。毒力测定结果表明：9株菌株对小菜蛾具有高毒力,2株对大猿叶虫有一定的杀虫活性。［结论］四川盆地土壤中Bt资源多样性丰富,其中有2株有一定的研究前景。     

椰子织蛾幼虫致病Bt菌的鉴定与杀虫活性测定

从海南省五指山采集的椰子织蛾僵虫上分离得到一株对椰子织蛾幼虫具有毒杀作用的菌株WZS171并对其生物防治潜力进行评测。通过形态学、cry基因的鉴定明确了该菌株为苏云金芽胞杆菌(Bt)。基因鉴定结果表明该菌株含有cry1Aa13、cry1Gb1、cry1D、cry1Ia、cry2Af共5种新型cry基因,NCBI Blast与GenBank中已知基因序列最大相似性分别为98%、99%、90%、92%、99%;生测结果表明72 h后该菌株菌悬液对椰子织蛾幼虫的LC₅₀为9.08 μg/mL,95%置信区间6.72~12.26 μg/mL。该菌株含有5种新型的杀虫编码基因,并且对椰子织蛾幼虫具有较高毒力,生物防治潜力大。     

对甜菜夜蛾高杀虫毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ah5的克隆表达

利用生物活性测定方法从本实验室已分离保存的Bt菌株中筛选出了5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的菌株。该5株Bt菌株对甜菜夜蛾初孵幼虫的LC₅₀值为0.556~0.914mg/mL胞晶混合物,其中GS3菌株杀虫活性最高,LC₅₀值为0.556mg/mL胞晶混合物;包含晶体形态主要是球形、大菱形、小菱形等;所含基因类型主要是cry1Aa、cry1Ab、cry1La、cry1Ia、cry1Ib、cry2Ab、cry2Ad、cry2Ah、cry7Ab、cry9Ba等;5株菌株均表达约60kD和130~150kD蛋白,其中2株还表达较弱的80kD蛋白。从GS3菌株中克隆得到一种新的cry2A基因,GenBank登录号为KT692984,由Bt基因国际命名委员会命名为cry2Ah5。该基因开放阅读框为1899bp,编码632个氨基酸,编码蛋白分子量为70.8kD,等电点pI为8.18,与其他Cry2Ah蛋白序列相似性为97%~99%。该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达约70kD蛋白,与预测分子量相符。本研究筛选得到5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的Bt菌株,克隆表达了一种新的cry2A基因cry2Ah5,为甜菜夜蛾的生物防治提供了新的菌株及基因资源。     

对甜菜夜蛾具有杀虫活性的Bt菌株cry1Ca基因研究

根据已报道的14个cry1Ca基因,设计能够扩增cry1Ca全长基因的简并引物。利用该引物对本实验室分离的472株Bt菌株进行筛选。PCR扩增发现22株菌含有cry1Ca基因。对22株菌株进行cry基因多样性分析,结果获得5种类型酶切图谱,表明这些菌株分为5种类型。SDS-PAGE结果显示22株菌均表达约130ku的蛋白。Western Blotting结果证实这些株菌中cry1Ca基因均正常表达。提取菌株的晶体蛋白,经胰蛋白酶活化,对甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]进行初步生测,结果表明22株菌中活化的Cry蛋白对甜菜夜蛾均表现出很强的毒杀作用。进一步从5个类型的菌中各挑选一株毒力较高的菌株进行LC_(50)的测定,结果证实它们均具有很高毒力,其中,T1-E12(0.087μg/g)、B16-C8(0.103μg/g)、T1-B8(0.202μg/g)的活性与阳性对照菌株G03(0.090μg/g)相当,具有生产应用潜力。本研究为新型高效Bt菌株的挖掘奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌cry8Ea启动子区orf1片段缺失增强启动子活性

本文分别构建了cry8E基因上游的启动子(Porf18E)和其上游缺失orf1基因的启动子(PΔorf18E)融合lacZ基因的表达载体,通过β-半乳糖苷酶活性的分析,发现PΔorf18E的转录活性高于Porf18E。分别用PΔorf18E和Porf18E指导cry1Ac基因的表达,通过光学显微镜观察,发现两个启动子指导表达的Cry1Ac蛋白均可形成双锥形晶体;通过总蛋白定量分析发现,缺失orf1基因的启动子(PΔorf18E)指导的Cry1Ac蛋白表达量高于Porf18E启动子指导的Cry1Ac蛋白表达量;生物活性测定表明:PΔorf18E指导的Cry1Ac晶体蛋白对小菜蛾Plutella xylostella具有杀虫活性,高于Porf18E指导的Cry1Ac晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性。本文获得的强活性的启动子PΔorf18E是目前已报道的转录活性最高的cry基因启动子,该启动子为Cry蛋白的表达和遗传工程菌株构建提供了重要元件。     

对蛴螬有活性的苏云金芽胞杆菌菌株的筛选与基因鉴定

为了寻找对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因资源,以实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株为材料,通过杀虫活性测定筛选到43株对蛴螬有活性的菌株,其中菌株C9对3种供试昆虫均有活性.光学及扫描电镜检测发现这些菌株均释放球形晶体.SDS-PAGE分析显示这些菌株均表达约130kD的蛋白.采用3种方法分析43株菌株的杀虫晶体蛋白基因类型,结果显示:其中21株只含cry8Ca;13株同时含cry8Ca和cry8Ea基因;QC4等8株菌株只能用引物HRM8F/HRM8R获得高度保守区域约110bp的扩增产物,说明这些基因的5'端序列与已知基因差异较大.测序结果经BLAST分析显示,产物序列同cry8基因的相似性均在98%以上,但其全长基因类型还需要其它方法确定.菌株QCM的PCR-RFLF图谱不同于已发现的cry8基因,推测其中含有新基因.     

Bt菌株FB的生物学特性及其cry、vip基因型鉴定

菌株FB是1株对小菜蛾Plutella xylostella幼虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis （Bt）。本研究通过扫描电子显微镜、大质粒电泳、总蛋白SDS-PAGE及菌株生长特征观察的方式研究了菌株FB特征,克隆得到了基因cry1Ia、cry1Ea、cry1Ab、cry2Ab和vip3Aa全长,依据全基因组测序结果得到了1个cry8基因部分片段,首次在Bt菌株中同时发现基因cry1类和cry8类,这五种基因推导的氨基酸序列与已知基因序列相比,最高相似性分别为99%、98%、99%、100%、99%,而cry8半长基因与已知基因仅为63%。生测结果表明,蛋白Cry1Ia、Cry1Ea和Cry1Ab对小菜蛾幼虫具有较高杀虫活性。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ie1蛋白末端缺失的研究

通过PCR扩增法 ,以cry1Ie1全长基因为模板 ,分别得到不同末端缺失的基因片段 ,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达 ,得到 6种末端缺失蛋白。对小菜蛾生物测定结果表明 ,缺失蛋白IE659、IE656分别缺失了C末端60个和63个氨基酸残基 ,对小菜蛾的杀虫活性与Cry1Ie1全长蛋白相当 ;IE648、IE045分别缺失了C末端 71个氨基酸残基和N末端缺失44个、C末端缺失63个氨基酸残基 ,对小菜蛾的活性提高了50% ;IE633、IE105分别缺失了C末端 86个氨基酸残基和N末端缺失 104个、C末端63个氨基酸残基 ,丧失了对小菜蛾的活性。试验明确Cry1Ie1蛋白的最小活性区N端在45～104氨基酸位点之间 ,C端在633～648氨基酸位点之间。