水稻白叶枯病菌室内链霉素抗性菌株的诱导及其抗性分子机制和风险评价

通过紫外光照射诱导获得了6株水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae抗链霉素突变体。测得链霉素对水稻白叶枯病菌敏感菌株ZJ173及其抗性突变体的最低抑制浓度(MIC)分别为0.10和600 μg/mL;对敏感菌株的有效抑制中浓度(EC50)为0.03 μg/mL,对抗性菌株的平均EC50值为11.64 μg/mL,平均抗性倍数为388。通过PCR扩增了敏感菌株ZJ173及5株抗性菌株的rpsL基因(编码S12核糖体蛋白)和rrs基因(编码16S rRNA),并检测了strA基因是否存在。序列分析表明,5株被测抗性菌株的rpsL基因均发生了突变,其中4株在氨基酸43位、1株在88位,均由赖氨酸突变为精氨酸,而rrs基因未发生突变,strA基因未被检测到。表明实验室诱导获得的水稻白叶枯病菌抗性菌株对链霉素的抗药性是由rpsL基因突变引起的。抗性风险研究表明,抗性突变体的抗药性在无药剂压力下可稳定保持,其致病性、生长速率与敏感菌株相比无明显差异,竞争性低于或略低于敏感菌株,抗性自发突变率较高,且抗性突变为单一位点突变,病害循环为多循环,因此由rpsL基因突变引起的水稻白叶枯病菌对链霉素的抗性风险较高。     

棕榈蓟马2种杀虫剂抗感种群间多种酶活性的比较

为明确乙基多杀菌素和吡虫啉对棕榈蓟马的抗性风险,采用叶管药膜法测定了棕榈蓟马种群对乙基多杀菌素和吡虫啉的抗性倍数,比较了其抗性种群和敏感种群之间羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、乙酰胆碱酯酶(AchE)3种酶的活性和细胞色素P450、细胞色素b5的含量变化。结果表明,棕榈蓟马种群对吡虫啉产生了中等水平的抗性(抗性倍数为12.73),对乙基多杀菌素产生了低水平的抗性(抗性倍数为9.53)。除棕榈蓟马吡虫啉抗性种群(BK)的AchE活性下降(0.58倍)外,乙基多杀菌素抗性种群(DK)的AchE活性则提高为1.31倍;DK和BK的CarE活性分别提高为敏感种群的1.46、1.79倍,GST活性分别提高为1.40倍和1.59倍,细胞色素P450含量分别提高为2.48倍和4.25倍,细胞色素b5含量分别提高为1.79倍和3.53倍,均高于敏感品系酶活水平。其结果表明,棕榈蓟马体内酶活的变化是其对杀虫剂产生抗药性的重要因素。     

乙基多杀菌素与4种杀虫剂复配对黄胸蓟马的联合毒力

为筛选出与乙基多杀菌素复配具有增效作用的杀虫剂组合,采用叶管药膜法测定了乙基多杀菌素分别与啶虫脒、毒死蜱、阿维菌素、高效氯氰菊酯复配对黄胸蓟马2龄若虫的联合毒力,并采用共毒系数法评价了复配组合的联合作用。结果表明,乙基多杀菌素与啶虫脒在配比为3∶7、5∶5、7∶3和8∶2时,与毒死蜱在所有配比组合中,与阿维菌素在配比为2∶8、3∶7和6∶4时,其共毒系数(CTC)均大于120,表现出显著的增效作用;而与高效氯氰菊酯在所有配比下均不具有增效作用。乙基多杀菌素与啶虫脒、毒死蜱、阿维菌素采用上述具有增效作用的复配比复配,在害虫治理和抗性治理中具有一定的应用前景和开发潜力。     

武夷菌素生物合成调控基因wysPⅢ的功能

为了深入研究武夷菌素生物合成调控机理,通过筛选对武夷菌素产量有影响的基因,明确基因的功能,利用分子育种技术来获得武夷菌素高产菌株。本研究通过基因敲除和过表达技术,获得了wysPⅢ基因的缺失突变株、互补菌株和过表达菌株,验证了该基因在武夷菌素生物合成过程中的功能和武夷菌素产量的关系。结果表明:wysPⅢ基因的过表达菌株生长速率加快,产孢时间提前,而缺失突变株较野生菌株生长变慢,产孢量下降,孢子颜色由正常的深灰色变为灰白色,菌丝变稀疏,但是构建好的菌株与野生型菌株相比,武夷菌素产量没有显著变化。由此可知:wysPⅢ基因调节菌株的生长和产孢特征,而不影响武夷菌素的产量,过表达菌株生长速率加快可缩短武夷菌素发酵时间,降低生产成本。     

烟草赤星病菌对嘧菌酯抗性突变体的诱导及其生物学特性

为评价烟草赤星病致病菌链格孢Alternaria alternata对嘧菌酯的抗性风险，以敏感菌株J6为试材，通过菌丝药剂驯化和分生孢子紫外诱变诱导抗性突变体，并对抗性突变体的生物学特性进行了研究，同时对抗性突变体与敏感菌株线粒体的细胞色素b基因 (cyt b) cDNA序列全长进行了测序分析。结果表明:经药剂驯化未获得抗性突变体，而紫外诱变共获得7株抗性突变体，突变频率约为0.007%，抗性水平分别为5.27、8.28、25.28、12.82、6.14、9.28和52.91倍。适合度研究表明，抗性突变体与敏感菌株的分生孢子萌发能力及致病力相当，但分生孢子产生量均高于敏感菌株，菌丝生长速率除突变体6-1外均快于敏感菌株。cyt b基因cDNA序列分析表明:有4株抗性突变体在不同位点上发生了核苷酸突变，其中突变体6-7 cyt b的249位和871位碱基由T突变为C，但其编码的氨基酸未发生突变；突变体6-8 cyt b的734位碱基由T突变为C，引起所编码的245位丙氨酸突变为缬氨酸 (V245A)；突变体6-9 cyt b的510位碱基由T突变为A，所编码的170位由精氨酸替代了丝氨酸 (S170R)；突变体6-11 cyt b的732位碱基由T突变为A，所编码的244位由苯丙氨酸替代了亮氨酸 (L244F)，其776位碱基由T突变为C，所编码的259位由丙氨酸替代了缬氨酸（V259A），其1 156位碱基由A突变为G，所编码的氨基酸未发生变化。研究结果初步表明，烟草赤星病菌对嘧菌酯存在潜在的抗药性风险，其cyt b基因的点突变与其对嘧菌酯的抗药性有关。     

武夷菌素生物合成调控基因wysPIII的功能

为了深入研究武夷菌素生物合成调控机理，通过筛选对武夷菌素产量有影响的基因，明确基因的功能，利用分子育种技术来获得武夷菌素高产菌株。本研究通过基因敲除和过表达技术，获得了wysPⅢ基因的缺失突变株、互补菌株和过表达菌株，验证了该基因在武夷菌素生物合成过程中的功能和武夷菌素产量的关系。结果表明：wysPⅢ基因的过表达菌株生长速率加快，产孢时间提前，而缺失突变株较野生菌株生长变慢，产孢量下降，孢子颜色由正常的深灰色变为灰白色，菌丝变稀疏，但是构建好的菌株与野生型菌株相比，武夷菌素产量没有显著变化。由此可知：wysPⅢ基因调节菌株的生长和产孢特征，而不影响武夷菌素的产量，过表达菌株生长速率加快可缩短武夷菌素发酵时间，降低生产成本。     

多杀菌素类杀虫剂的环境降解及抗性机制研究进展

多杀菌素类杀虫剂具有高效低毒、杀虫谱广及环境友好等优点,在害虫综合防治中具有很好的应用前景。近年的研究明确了多杀菌素和乙基多杀菌素的环境/农作物的降解代谢物及降解动力学,重点阐明了多杀菌素和乙基多杀菌素的代谢及靶标抗性机制,对多杀菌素类杀虫剂的合理使用和抗性治理提供了科学依据。同时,在杀虫活性更好、防治谱更广的乙基多杀菌素的开发过程中,计算建模、生物路径调控及化学合成等技术的综合应用发挥了巨大作用,为进行天然产物结构改造、开发新型杀虫剂提供了重要参考。本文论述了多杀菌素和乙基多杀菌素的结构特点及环境降解特性,综述了多杀菌素和乙基多杀菌素抗性机制的研究进展。     

豇豆闭花前后施药对防治蓟马效果的影响

蓟马是当前海南豇豆的头号害虫,防治主要依赖化学药剂。通过试验研究了分别在豇豆闭花前、后施药对于防治蓟马效果的影响,以确定施药适期。结果表明,豇豆闭花影响药剂的防治效果。与闭花后施药的防效相比,闭花前施用60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂,药后第1、3天和7天的防效分别提高了4.76、4.30和3.03百分点;闭花前施用20%啶虫脒可溶性液剂,药后第1、3天和7天的防效分别提高了3.50、3.29和5.31百分点。两种药剂以乙基多杀菌素防效较高。     

乙基多杀菌素及其代谢物在杨梅中的残留及消解动态

开展了60g/L乙基多杀菌素悬浮剂在杨梅上的残留田间试验,对乙基多杀菌素及其代谢物在杨梅中的残留量及消解动态进行了分析,为乙基多杀菌素在杨梅上的膳食风险评估、合理使用及制定残留限量标准提供依据。建立了液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定杨梅中乙基多杀菌素及其代谢物的残留量的分析方法。当乙基多杀菌素及其代谢物在杨梅中的添加浓度为0. 05、1. 0、2. 0mg/kg时,平均回收率82. 6%～96. 6%,相对标准偏差为3. 3%～7. 4%,符合残留检测方法的要求。消解动态试验结果显示,乙基多杀菌素在杨梅中的消解动态规律符合一级动力学方程,半衰期为0. 9～2. 6d,属易降解农药。最终残留试验表明60g/L乙基多杀菌素悬浮剂按有效成分40和60mg/kg,施药1次和2次,末次施药后1、2、3、5、7d,杨梅中乙基多杀菌素最终残留量分别为0. 05～0. 38mg/kg、0. 05～0. 39mg/kg、0. 05～0. 32mg/kg、0. 05～0. 19mg/kg、0. 05～0. 11mg/kg。建议在杨梅上使用60g/L乙基多杀菌素悬浮剂时,有效成分用药量40mg/kg,施药1次,安全间隔期7d。     

多粘类芽胞杆菌LB-9的诱变及抑菌防病效果研究

为获得对烟草疫霉菌生防效果更佳的拮抗菌株，对多粘类芽胞杆菌LB-9进行基因诱变。利用原生质体电转化法，构建了菌株LB-9的Tn-5转座插入突变体库，获得约2000个转化子，通过平板对峙法筛选出对烟草疫霉菌拮抗能力增强且效果稳定的突变菌株3个，其中编号为A13的突变菌株对烟草疫霉菌的抑制效果达到80%以上，与原始菌株LB-9的抑菌率相比提高了20%以上。采用室内盆栽接种法研究了正突变菌株A13对烟草黑胫病的防控效果，并利用实时荧光定量PCR法初步分析了其诱导烟株体内抗病相关基因的表达。结果表明，正突变菌株A13处理烟株7 d后，对烟草黑胫病的防效高于原始菌株LB-9，防效可达80%以上，同时可诱导烟株体内不同信号通路中抗性相关基因的上调表达。本研究为多粘类芽胞杆菌插入诱变育种方法研究提供了理论支撑，对烟草黑胫病的生物防治具有重要意义。     

几个常用内参基因在淀粉酶产色链霉菌1628抗药性突变株中稳定性的评估

淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628是一株重要的生防菌株,其代谢产物对多种植物病原真菌具有较强的抑制效果。为了筛选在其不同抗药性高产突变株中均能稳定表达的内参基因,选择16S rRNA、sigB、hrdB、thyA、gyrB和rpoA共6个常见内参基因,分别探究它们在野生型菌株、链霉素抗性突变株、利福平抗性突变株和巴龙霉素抗性突变株中的表达情况,并用geNorm软件和NormFinder软件对结果进行分析。结果表明,使用不同软件分析得出的最佳内参基因略有差异。geNorm软件认为在上述4株菌株中,表达最稳定的内参基因分别是gyrB、gyrB、thyA、rpoA;而NormFinder软件认为rpoA基因在所有菌株的表达都是最稳定的。利用平均等级的算法平衡两个软件的分析差异,最终确定rpoA基因为表达最稳定的内参基因。通过检测toyG基因的表达水平,发现以rpoA作为内参基因能得到更合理的结果。     

抗氰烯菌酯假禾谷镰孢突变体的诱导及其生物学特性

为评估引起小麦茎基腐病的病原菌假禾谷镰孢Fusarium pseudograminearum对氰烯菌酯的抗性风险,对5株敏感菌株进行了室内药剂驯化,获得33株抗性突变体,突变频率为16.5%,其对氰烯菌酯的抗性水平范围为7.39～1 665.76倍,3株表现低抗,4株表现中抗,26株表现高抗;发现在myosin-5基因上存在11种抗性突变类型,其中217位的丝氨酸突变为亮氨酸(S217L)、420位的谷氨酸突变为赖氨酸(E420K)和135位的丙氨酸突变为苏氨酸(A135T)为主要突变类型,其比例分别为45.5%、15.2%和9.1%。S217L型抗性突变体的产孢量显著下降,菌丝生长速率和致病力与亲本菌株无显著差异。E420K型抗性突变体的菌丝生长速率和致病力显著下降,产孢量与亲本菌株无显著差异。A135T型抗性突变体的菌丝生长速率和产孢量与亲本菌株无显著差异。研究结果表明假禾谷镰孢在药剂选择压力下易形成氰烯菌酯的抗性群体,对氰烯菌酯存在中到高等的潜在抗性风险,其myosin-5的点突变与其对氰烯菌酯的抗性相关。     

乙基多杀菌素

理化性质：乙基多杀菌素是从放线菌刺糖多孢菌（saccharopolyspora spinosa）发酵产生的．是多杀菌素（spinasad）的换代产品。其原药的有效成分是乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L的混合物（比值为3：1）,     

利用链霉素耐药性突变筛选抗菌活性放线菌

利用链霉素耐药性突变,从天然无抗菌活性或活性微弱的12株放线菌中筛选活性菌株。在链霉素浓度为25 μg/mL时共获得99株耐药菌株。通过抑菌活性测定,发现7株耐药突变菌株的发酵液产生了抑制细菌活性,其中仅耐药突变株67S-14所产生活性物质的遗传性能稳定。室内抑制真菌活性测定结果表明:菌株67S-14发酵液对玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum的抑制率较原始菌株No.67提高50%以上。该突变株在菌落形态方面与原始菌株存在较大的差异。Doskochilova溶剂系统纸层析结果表明,该活性物质可能为大环内酯类抗生素。HPLC分析结果表明,该抗生素可能是突变菌株67S-14产生的代谢产物。     

樱桃采后灰霉病菌对甲基硫菌灵、乙霉威和腐霉利的抗性

本文采用单孢分离法对四川汉源和山东烟台等地采集的樱桃果实进行了采后灰霉病的病原菌分离和鉴定;采用区分剂量法分别测定了菌株对苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵、乙霉威和二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利的敏感性,并进一步分析了抗药性菌株的分子机制。结果表明,分离得到的54株樱桃采后灰霉病菌均为灰葡萄孢Botrytis cinerea,对甲基硫菌灵的总抗性频率高达79.6%,其中甲基硫菌灵抗性-乙霉威敏感 (BEN R1) 菌株频率为 25.9%;甲基硫菌灵-乙霉威双重抗性菌株 (BEN R2) 频率为53.7%;检测到腐霉利抗性菌株 (DCF R) 9 株,频率为16.7%。甲基硫菌灵抗性菌株在β-tubulin基因上的突变共有2种类型: BEN R1抗性菌株中,第198位密码子发生点突变 (GAG→GCG),编码氨基酸由Glu (E)突变成缬氨酸Ala (A);在BEN R2抗性菌株中,第198位密码子发生点突变 (GAG→GTG),编码氨基酸由Glu (E)突变成缬氨酸Val (V)。DCF R菌株在BcOS1的第365位密码子由ATC突变成AAC或AGC,导致编码的氨基酸由异亮氨酸Ile (I)突变成天冬酰胺Asn (N)或丝氨酸Ser (S)。本研究表明樱桃采后灰霉病菌对甲基硫菌灵和腐霉利存在不同程度抗性,应在加强抗药性监测的同时与其他类型杀菌剂交替使用,延缓抗药性发展。     

北京地区草莓灰霉病菌对异菌脲的抗性及抗性分子机制

由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)引起的草莓灰霉病是草莓上危害严重的病害之一。为了解北京地区草莓灰霉病菌对二甲酰亚胺类常用杀菌剂异菌脲的抗性,本研究采用最低抑制浓度法分别检测了2013年和2014年从北京地区15个草莓园采集的共计121株草莓灰霉病菌对异菌脲的抗性。结果表明,北京地区草莓灰霉病菌对异菌脲存在较高的抗性频率,2014年较2013年的抗性频率略有上升,由40.4%上升为45.3%。不同草莓园菌株的抗性频率差异很大,可能与用药水平有关。2014年的低抗、中抗和高抗菌株数分别占检测菌株总数的9.4%、28.1%和7.8%。利用PCR技术扩增编码组氨酸激酶基因BcOS1中与二甲酰亚胺抗性相关的区段,对抗性菌株的分子机制进行了初步研究,结果表明BcOS1基因第1 214位核苷酸发生了2类突变:以第Ⅰ类为主,菌株的抗性水平为中抗和高抗,由ATC突变为AGC,导致第365位氨基酸由异亮氨酸变为丝氨酸;第Ⅱ类菌株为低抗,由ATC突变AAC,导致第365位氨基酸由异亮氨酸变为天冬酰胺。     

甲氯虫酰肼·乙基多杀菌素360g/L悬浮剂对大葱甜菜夜蛾和蓟马的田间防效

甜菜夜蛾和葱蓟马是为害大葱的重要害虫,为了寻找高效、环境友好且能兼治的药剂,特进行了本研究.结果表明:甲氧虫酰肼·乙基多杀菌素360g/L悬浮剂对甜菜夜蛾的防效在施药后第1、3、7d逐渐提高,药后第10d在24.4g/667m2的剂量下,防效可达98.40％;对葱蓟马防效药后第3d最好,在24.4g/667m2的剂量下,平均防效为74.56％,药后第7、10d防效略有降低.因此,甲氧虫酰肼·乙基多杀菌素360g/L悬浮剂可作为大葱田防治甜菜夜蛾和蓟马的优良药剂.     

甲氧虫酰肼·乙基多杀菌素360g/L悬浮剂对大葱甜菜夜蛾和蓟马的田间防效

甜菜夜蛾和葱蓟马是为害大葱的重要害虫,为了寻找高效、环境友好且能兼治的药剂,特进行了本研究。结果表明:甲氧虫酰肼·乙基多杀菌素360g/L悬浮剂对甜菜夜蛾的防效在施药后第1、3、7d逐渐提高,药后第10d在24.4g/667m2的剂量下,防效可达98.40%;对葱蓟马防效药后第3d最好,在24.4g/667m2的剂量下,平均防效为74.56%,药后第7、10d防效略有降低。因此,甲氧虫酰肼·乙基多杀菌素360g/L悬浮剂可作为大葱田防治甜菜夜蛾和蓟马的优良药剂。     

中生菌素高产菌株的效果评价

经测定，中生菌素高产菌株ＵＶ－７与亲株Ｂ－７都比较稳定，但产素水平较亲株Ｂ－７提高了８０％左右；在６个有效组份中Ａ、Ｂ、Ｃ３组份的含量明显减少，而Ｆ组份的比例明显增加；有效组份的比例也发生了较大变化，产物杀菌能力也与中生菌素标准品不同，其杀细菌的能力增大，杀真菌的能力下降，防治真菌病害的效果略有下降     

4种药剂对辣椒蓟马的防效比较

比较了4种药剂对辣椒蓟马的防治效果,发现60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂1 500倍液对该虫具有较好的防治效果,其处理区虫口减退率最高,药后第3天达89.19%,防效达85.19%;至药后第7天,虫口减退率为77.02%,防效为67.59%,显著高于其他药剂处理的防效。