太湖新银鱼微卫星位点的分离与序列特征分析

为了开发太湖新银鱼（Neosalanx taihuensis）的微卫星分子标记,采用生物素标记探针（AC）12、（AAC）10、（AAG）10和（GATA）8对其微卫星位点进行了筛选,并对其序列特征进行了分析。共获得490个微卫星序列,筛选的总效率为78．09％。筛选出725个微卫星位点,其中完美型592个,占81．66％;混合型82个,占11．31％;非完美型51个,占7．03％。探针（AC）12富集到的微卫星重复次数大多集中在14～26次,最高44次;探针（AAC）10和探针（AAG）10富集得到的微卫星重复次数主要集中在8～20次,最高42次;探针（GATA）8富集得到的微卫星重复次数一般在6～15次,最高32次。探针（AC）12、（AAC）10、（AAG）10和（GATA）8的杂交效率分别为85．19％、60．19％、5．16％和10．64％。筛选得到的725个微卫星位点中,二碱基重复位点390个（53．79％）,三碱基重复位点284个（39．17％）,四碱基重复位点47个（6．48％）,五碱基重复位点 1个（0．14％）和六碱基重复位点3 个（0.42％）。根据二碱基重复核心序列进行引物设计,对抚仙湖24尾太湖新银鱼样本进行 PCR 扩增,电泳结果显示部分微卫星位点有较高的多态性,同时本研究获得的三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复位点也可为长重复单元微卫星引物的开发提供基础。     

大黄鱼EST微卫星标记初步筛选

通过构建大黄鱼性腺线性化cDNA文库，并经测序后获得3535条EST，对其二碱基至六碱基重复序列进行筛选，共发现微卫星位点150个，占EST序列的4．24％；其中包括二碱基重复序列64条，三碱基重复序列80条，四碱基重复序列5条，五碱基重复序列1条；三碱基重复序列是最丰富的重复单元，占53．3％。在这些微卫星序列中，（TG／GT／AC／CA）n形式在二碱基重复中最为常见，（GAG／AGG／GGA／CCT）n形式在三碱基重复序列中最为常见，分别占微卫星序列总数的26％和14％。选取其中的62条微卫星序列进行引物设计、合成与多态性检测，经过PCR扩增，2．0％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得呈多态性微卫星引物8对，多态率为12．9％。本研究为开发大黄鱼EST微卫星分子标记和大黄鱼基因编码区微卫星的功能研究提供有价值的信息。     

基于胡鲇科和鲇科ESTs序列初步筛选兰州鲇EST-SSR分子标记

利用SSRHunter软件对现已公布的鲇形目(Siluriformes)中胡鲇科(Clariidae)和鲇科(Siluridea)共2002条EST(Expressed Sequence Tag)序列筛选兰州鲇(Silurus lanzhouensis)微卫星标记,并分析其序列丰度和分布特征。结果共发现209个微卫星序列,占整个ESTs数据库的10.44%;其中三碱基重复序列数量最多,占ESTs数据库中发现微卫星序列总数的35.62%;二、四、五、六碱基重复序列分别占微卫星序列总数的28.31%、25.57%、7.76%、2.74%。根据侧翼序列,设计125对引物,随机选取58对进行扩增鉴定及多态性筛选。结果显示29对引物能稳定扩增,16对引物具有多态性,每个位点等位基因数2~7个(平均3.75),观测杂合度(Ho)0.133 2~0.732 2(平均0.405 1),期望杂合度(He)0.198 2~0.848 3(平均0.560 2),多态信息含量(PIC)0.124 1~0.794 5(平均0.506 5)。研究表明,借用已有鲇形目鱼类ESTs数据库筛选到的兰州鲇微卫星标记质量较好,可为兰州鲇种质资源保护、微卫星连锁图谱构建、经济性状的QTL定位及分子标记辅助育种奠定基础。     

黄鳍鲷基因组微卫星的分离

采用磁珠富集法构建黄鳍鲷(Acanthopagrus latus Houttuyn)基因组微卫星富集文库。共挑选60个克隆进行测序,分析发现58个克隆分别含(GA)n或(CA)n两碱基重复单元。进一步通过序列比对,最终获得41个具有特异微卫星序列的阳性克隆。其中,23个克隆含有(GA)n或(CT)n两碱基重复序列,17个克隆含有(GT)n或(CA)n重复序列,另1个含有以上两种重复类型。获得的微卫星序列中,单一型及间断型序列各有20条,另有1条属于复合型序列。序列长度为117~512 bp,平均259 bp。微卫星核心序列两碱基重复5到38次,绝大多数序列重复次数大于10。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了3对能够在黄鳍鲷基因组有效扩增的微卫星引物。本研究旨为进一步开展黄鳍鲷分子育种及资源评价分析提供基础资料。     

合浦珠母贝微卫星DNA标记分离与分析

采用生物素标记的（CA）15、（AG）12、（ACA）15、（GATA）8、（GATT）75个探针和磁珠富集法构建马氏珠母贝（Pinctada martensii Dunker）基因组微卫星富集文库。随机挑选500个进行PCR筛选，得到138（27．6％）个候选克隆，测序分析发现130个克隆含有微卫星基重复单元。进一步通过序列比对，最终获得109个具有特异微卫星序列的阳性克隆，其中包含179个微卫星DNA结构域。获得的微卫星序列中，属于完全型序列的有154条，不完全型重复型序列有19条，复合型重复序列有6条。序列长度为70～490bp，平均295bp。微卫星核心序列两碱基重复3到39次，绝大多数序列重复次数大于10。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了13对能够在马氏珠母贝基因组有效扩增的微卫星引物。本研究旨为进一步开展马氏珠母贝分子育种及资源评价分析提供基础资料。     

虾虎鱼科(Gobiidae)基因组微卫星DNA的分布特征

为了解虾虎鱼科(Gobiidae)鱼类基因组遗传结构特征，本研究自主开发矛尾复虾虎鱼(Synechogobius hasta)微卫星序列153条，结合从 GenBank 中筛选出的虾虎鱼科微卫星序列535条，合计686条微卫星序列，隶属于19种虾虎鱼，序列总长度为295062 bp，包含473个微卫星位点，微卫星位点累计长度为33370 bp。统计微卫星重复类型，发现在所有微卫星重复类型中以二碱基重复出现次数最多，位点数为361个，占总微卫星的76.32%，其中，重复拷贝类别最多的是 AC (340个)，占全部微卫星的71.88%，占二碱基重复微卫星的94.18%，在二碱基重复类型中没有发现 AT 和 GC 两种重复类型。三碱基重复位点数为35个，占总微卫星的7.4%，其中以 ACT 重复拷贝类别最多(12个)，占三碱基重复微卫星的34.29%。四碱基重复位点数为68个，其中以 CTAT 重复最多(31个)，占总微卫星的14.38%。五碱基重复类型中只有 TCTGG和 ATCTA 两种类型，只占全部微卫星的0.42%。六碱基重复7个，占总微卫星的1.48%，六碱基重复中各重复类型出现次数相当。在所有微卫星重复类型中没有发现单核苷酸重复类型。     

从中国对虾ESTs中筛选微卫星标记的研究

利用生物信息学方法在含有10446个中国对虾ESTs的数据库中进行微卫星序列的筛选，共发现微卫星序列229个，占整个ESTs数据库的2．19％，其中含双碱基重复序列146个和3碱基重复序列58个，分别占在ESTs数据库中发现微卫星序列总数的63．76％，和25．33％，大部分发现的微卫星序列均为Perfect形式的重复序列。根据筛选得到的微卫星序列设计并合成引物19对进行多态性检测，在有扩增产物的16对引物中，首次筛选得到8个中国对虾微卫星标记，并对这些微卫星标记进行了等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度、PIC值等统计学指标的评价。结果表明，在8个微卫星位点上，等位基因的数目从5到15不等，等位基因长度从：165～305bp，期望杂合度和多态性信息含量分别为0．59到0．89和0．56到0．88，表明这8个中国对虾微卫星标记完全适合于遗传分析。     

文蛤转录组中微卫星位点生物信息分析#br#

采用生物信息学方法分析了文蛤(Meretrix meretrix)转录组中微卫星序列(简单重复序列,simple sequence repeat)的分布规律。结果表明:在文蛤转录组SSR中,单碱基重复序列的数量最多,有3001个;其次为三碱基和四碱基重复序列,分别为2254和2200个;二碱基重复序列1052个;五碱基重复序列332个;六碱基重复序列最少,仅13个。文蛤转录组SSR共包含26种重复基元,其中优势基元为单碱基重复A/T有2809个,其次为三碱基重复AAC/TTG有907个,四碱基和二碱基重复中的AAAC/TTTG和AT/TA分别有588和561个,说明文蛤转录组微卫星位点的分布对A/T具有偏好性。文蛤完整SSR的平均长度为18.34 bp,长度分布在12~20 bp,约占41%。研究结果将为研究文蛤SSR标记开发、群体遗传多样性、遗传连锁图谱、种质资源鉴定和分子遗传育种等后续研究提供基础数据。     

瓦氏马尾藻微卫星分子标记的筛选

采用锚定PCR技术,构建了瓦氏马尾藻(Sargassum vachellianum)微卫星富集文库。阳性克隆筛选、测序和序列分析结果表明,在筛选的523个白色菌落中,214个克隆(占筛选白色菌落数的41%)含有重复的微卫星序列,其中105个(20.1%)有随机侧翼区,可以进行引物设计,109个缺乏足够的侧翼序列。在获得的微卫星序列中,完全的占50%;不完全的占2.3%;复合的占47.7%。重复次数5以上的微卫星序列主要以二碱基重复为主,除引物中使用的CT、GT和CAC重复单元外,还观察到AC、GA、CG、AT、CTA、TAG和AGT的重复序列。微卫星重复次数主要集中在6~10次之间,占92%,最高为23次。设计的54对微卫星引物中有8对能够在野生瓦氏马尾藻群体中进行多态性扩增。本研究中构建的瓦氏马尾藻富集微卫星文库将为以后开发未知微卫星标记提供帮助。     

基于转录组测序的圆口铜鱼SSR标记初步筛选及特征分析

分析圆口铜鱼(Coreius guichenoti)的遗传多样性,可为其人工繁殖家系鉴别、分子标记辅助育种及长江上游珍稀特有鱼类的种质资源保护提供理论依据和技术支撑。以室内循环水养殖的圆口铜鱼为研究对象,提取其肝脏RNA,通过Illumina HiSeq? 2000 高通量测序平台进行转录组测序,利用MISA软件对测序获得的unigene进行微卫星（SSR）位点挖掘和特征分析,设计SSR位点引物并进行验证。结果显示,圆口铜鱼转录组测序共获得80 688条 unigene,通过查找获得34 155个SSR位点,分布在25 947条序列上,发生率为32.2%。圆口铜鱼SSR中主要重复单元类型为单碱基和二碱基,其中A/T和AC/GT为优势单碱基和二碱基重复单元,占总SSR数量的57.2%和19.7%。SSR重复数在5~60次,其中有40.3%的SSR序列集中在11~15次;SSR序列长度变化显著,单碱基至六碱基重复类型的总体长度在11~101 bp,其中12~35 bp序列长度占78.8%。随机选取50个SSR位点合成引物对9尾圆口铜鱼样本进行PCR 扩增验证,可稳定扩增出目的条带的有40对引物,其中16对具有多态性,证明了通过转录组测序开发圆口铜鱼SSR标记的可行性。     

Characterization of 95 novel microsatellite markers for Zhikong scallop Chlamys farreri using FIASCO-colony hybridization and EST database mining

ABSTRACT:   In order to construct a simple sequence repeat (SSR)-based genetic linkage map and to promote molecular marker-assisted selection (MAS) in scallop breeding, the methods of Fast Isolation by AFLP of Sequences COntaining repeats (FIASCO)-colony hybridization and expressed sequence tag (EST) database mining were modified and used to develop 95 novel microsatellite markers for Zhikong scallop. The SSR-enriched library constructed by the FIASCO method consisted of 830 clones, and 295 (35.5%) positive clones were identified after colony hybridization. One hundred and fifty clones were randomly sequenced and the results showed all clones contained at least one microsatellite. Of 91 primer pairs designed, 72 were amplified scorable polymerase chain reaction (PCR) products and 70 were polymorphic with the allele number range of 3–16 alleles/locus (average 7.0 alleles/locus). When EST database mining was performed, 66 microsatellites containing ESTs were identified from 3467 sequences deposited in GenBank. Based on cluster analysis of length and GC content of the flanking regions, 47 primer pairs were designed and 23 scorable EST SSRs were obtained. Compared with genomic SSRs developed in this study, EST SSRs showed lower genetic variability with an average of 4.2 alleles/locus. The results in the present study demonstrate that modified FIASCO-colony hybridization is an efficient and low-cost method for the isolation of large numbers of microsatellite markers for scallop species.     

施氏鲟、西伯利亚鲟、达氏鳇及其杂交种种质鉴定方法的建立及其应用

以施氏鲟（Huso dauricus）为研究材料，分别从线粒体基因组及核基因组两个层面进行物种分子鉴定方法研究。在线粒体基因组层面，对3种鲟及未知鲟种类共计119个样品的D-Loop区进行测序，通过同源序列比对，构建NJ进化树、计算群体间遗传距离，以鉴定其中30尾未知种类。在核基因组层面，利用15对微卫星标记扩增3种鲟DNA，筛选出特异性标记Ls19和SX226。Ls19在施氏鲟中扩增出特异条带126 bp、130 bp，在西伯利亚鲟中扩增出特异条带139 bp、143 bp，在达氏鳇中扩增出特异条带124 bp、127 bp；SX226在施氏鲟中扩增出特异条带185 bp，在西伯利亚鲟中扩增出特异条带260 bp、273 bp、283 bp，在达氏鳇中扩增出特异条带180 bp、182 bp。通过特异条带对未知鲟进行鉴定，结果显示：30尾未知鲟种类中，有西伯利亚鲟17尾，施氏鲟1尾，达氏鳇1尾，达氏鳇×施氏鲟2尾，施氏鲟×达氏鳇1尾，施氏鲟×西伯利亚鲟8尾。结果表明，特异性微卫星引物Ls19和SX226可以应用于施氏鲟、西伯利亚鲟、达氏鳇的纯种及杂交种分子水平种质鉴定。     

三角帆蚌微卫星位点筛选及多态性分析

采用磁珠富集法,以生物素标记的(CA)10寡核苷酸为探针,构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)基因组微卫星富集文库。根据微卫星位点的侧翼序列设计引物,随机挑选扩增出与预期大小相符的32对引物,引物荧光标记后对24个三角帆蚌个体分别进行PCR扩增,共筛选出20对多态性较好的引物。结果表明,20个微卫星位点的等位基因数为5～20,有效等位基因数2.321 3～13.260 3。观察杂合度和期望杂合度分别为0.318 2～1.000 0和0.582 5～0.946 1;PIC值0.547 2～0.919 9;其中14个位点符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。本研究筛选的20个微卫星标记可作为三角帆蚌遗传多样性、种群遗传结构等研究的理想分子标记。     

脊尾白虾血细胞ESTs的生物信息学与微卫星序列特征分析

对前期测序得到的脊尾白虾血细胞2853条EST序列进行了生物信息学和微卫星序列特征分析。EST序列拼接得到1053条Unigenes,包括329条Contigs和724条Singlets。BLAST分析表明,593(56.3%)条Uingenes与数据库中已知基因具有相似性。KEGG代谢途径分析表明,181条Unigenes映射到120条代谢途径。通过EST-SSR分析,共得到416条微卫星序列,检出率为14.58%。其中,两碱基重复序列374条,占89.90%,AG重复类型最多;三碱基35条,占8.41%,AAT重复类型最多;四碱基7条,占1.68%,AAGT重复类型最多。本研究可为脊尾白虾功能基因资源挖掘及分子标记筛选提供有效数据。     

长江刀鲚选育群体转录组EST-SSR的分布特征分析

本研究利用MISA软件挖掘长江刀鲚(Coilia ectenes)肌肉和肝脏转录组中的微卫星标记，为刀鲚选育群体的种质资源评估和分子标记辅助育种奠定基础。结果显示，从71869条Unigenes中共获得33896条重复单元长度为1~6碱基的微卫星序列；刀鲚转录组中不同类型微卫星的重复基序具有不同的分布特征，其中，单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复为主要的微卫星重复类型，分别占总微卫星数目的34.94%、49.47%和13.34%；不同微卫星重复类型的优势重复基序亦有所不同，其中，A/T为单核苷酸重复基序的优势重复基序占86.25%，AC/GT为二核苷酸重复基序的为优势重复基序占75.25%，AGG/CCT为三核苷酸重复基序的优势重复基序占28.57%；不同微卫星重复基序核苷酸的数量和重复次数亦有所不同，重复次数伴随着重复单元中核苷酸数量的增加而呈现降低的趋势；从100对四核苷酸重复的SSR引物中筛选获得了16对多态性微卫星标记，并以此为基础，对长江刀鲚选育群体(F3)的遗传学特征进行了初步评估，结果显示，长江刀鲚选育群体F3的平均有效等位基因数(Ne)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)和Shannon多样性指数I分别为1.7580、0.3414、0.3977和0.6278。以上结果表明，基于刀鲚转录组数据批量开发微卫星是切实可行的，所开发的多态性微卫星标记能够应用于长江刀鲚选育群体的遗传背景评估和进一步的遗传育种研究。     

草鱼全基因组微卫星特征分析与亲子鉴定

为分析草鱼全基因组微卫星特征并开发高多态性微卫星标记亲子鉴定平台,实验利用已发布的草鱼全基因组序列,开发高度多态、准确度高、重复单元在4～6碱基范围的微卫星标记.结果显示,在草鱼900.51 Mb基因组序列中共筛选到微卫星序列677363个,总长度12 835 407 bp,占全基因组长度的1.4254％,平均跨度为1...