钙离子浓度对日本沼虾感光细胞内可溶性Gq蛋白α亚基含量的影响

研究了钙离子浓度对日本沼虾（Macrobrachium nipponense）感光细胞中可溶性Gq蛋白α亚基含量的影响。以暗适应状态日本沼虾的复眼视网膜为材料，分别用高钙溶液、生理溶液、低钙溶液进行孵育，应用SDS—PAGE及免疫印迹技术对其可溶性蛋白粗提取液进行分离和鉴定，并利用Tanon GIS凝胶图像处理系统对蛋白条带的含量进行分析，结果显示：不同钙离子浓度中孵育的日本沼虾感光细胞蛋白的条带数量和分子量大小基本相同。兔抗Gqcx多克隆抗体在高钙溶液、生理溶液及低钙溶液处理的日本沼虾感光细胞中均识别了可溶性Gq蛋白仅亚基，分子量为42ku，可溶性Gq蛋白α亚基的含量分别是8．6％、8．4％和7．2％。在暗适应条件下，细胞中可溶性Gq蛋白α亚基的含量与钙离子浓度成正比，这表明钙离子浓度的升高可俾刍牛膳结合的Go蛋白α某转化为可溶性的Ga蛋白α亚基。     

牛磺酸对日本沼虾生长及酚氧化酶活性的影响

通过在饵料中分别添加不同含量的牛磺酸, 初步研究牛磺酸对日本沼虾生长及体内酚氧化酶活性的影响。结果表明, 在饵料中添加 0 .4% ~0. 8%的牛磺酸, 日本沼虾的增重率显著增加 (P<0 .05); 饵料中添加 0. 4%的牛磺酸, 日本沼虾肌肉中的酚氧化酶活性也显著升高 (P<0 .05)。说明饵料中牛磺酸的含量对日本沼虾的生长和免疫力存在显著影响, 以饵料中添加 0. 4 %的牛磺酸比较适宜。     

日本沼虾表皮蛋白-5基因全长cDNA克隆及表达分析

为探究甲壳动物表皮蛋白多样性及其功能,根据表皮转录组资料,利用RACE技术扩增得到日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长序列,分析其生物信息学、不同蜕皮时期的表达特征以及KK-42对其表达特征的影响。日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长796bp,开放阅读框477bp,编码158个氨基酸,含RR基序,预测蛋白等电点为4.22,分子量为16.46ku;氨基酸序列比对发现日本沼虾表皮蛋白-5与克氏原螯虾Casp-2相似性最高,为76%,与其他甲壳动物表皮蛋白相似性为41%~53%。实时荧光定量PCR结果显示,日本沼虾表皮蛋白-5基因在3个时期——蜕皮间期、蜕皮前早期和蜕皮前晚期均有表达,其中在脱皮前晚期的相对表达量最高,为蜕皮间期的1400倍,与之有极显著差异(P0.01)。KK-42处理显著上调日本沼虾表皮蛋白-5基因在蜕皮前早期的表达,在处理后3、6h和48h表达量分别是对照组的6.3、4.8和11.4倍。KK-42诱导日本沼虾表皮蛋白-5基因的表达,使峰值前移,这可能是KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制之一。     

咪唑类物质KK-42对日本沼虾免疫功能的影响

为评估咪唑类物质KK-42对日本沼虾免疫相关基因表达及抗菌机能的影响,将处于蜕皮间期的日本沼虾分别用1.95×10~(-4) mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡1min,测定处理后3、6、12、24h和48h细胞质锰超氧化物歧化酶、线粒体锰超氧化物歧化酶和血蓝蛋白基因的表达以及相应酶活力的变化;KK-42处理12h后,腹部注射嗜水气单胞菌,测定感染后日本沼虾的死亡率。结果显示,KK-42处理后3、6、12h,细胞质锰超氧化物歧化酶、线粒体锰超氧化物歧化酶和血蓝蛋白基因表达明显提高,超氧化物歧化酶活力和血蓝蛋白含量也于6~48h持续升高,在24h达到最高值。KK-42预处理可以降低感染嗜水气单胞菌后日本沼虾的死亡率。试验结果表明,KK-42可诱导日本沼虾免疫相关基因的表达,并能提高日本沼虾的抗菌能力。     

乐果对日本沼虾血淋巴溶菌酶与酚氧化酶活力的影响

将日本沼虾暴露于0.0001、0.001、0.01、0.1、1.0 mg/L的乐果溶液中14 d,溶菌酶与酚氧化酶活力均较对照组明显降低,且随乐果浓度的增加和胁迫时间的延长而呈下降趋势.0.0001 mg/L的乐果对日本沼虾的免疫功能即有一定的抑制作用.溶菌酶与酚氧化酶活力可作为日本沼虾亚急性中毒的检测指标.     

日本沼虾饲料最适蛋白质、脂肪含量及能量蛋白比的研究

本文研究了日本沼虾(Macrobrachium nipponense)饲料的最适蛋白质含量、脂肪含量及能量蛋白比。试验用饲料由酪蛋白、糊精、混合油、复合维生素和无机盐混合物等组成。本试验用的日本沼虾体重为 1.77±0.23克,试验期间水温为 21—25℃。用增重率、饲料系数和肝胰脏α-淀粉酶活力等作为评价指标。试验结果表明:日本沼虾配合饲料适宜蛋白质含量为 36.8—42.27％,适宜脂肪含量为6—12％。当配合饲料的蛋内质含量在适宜范围内,饲料能量蛋白比(C/P)为8千卡/克蛋白左右,每公斤配合饲料的总能量为3006—3561千卡是最为适宜的。当饲料总能量在一定范围内,随着饲料碳水化合物含量的增加,肝胰脏α-淀粉酶活力增强。     

咪唑类物质KK-42对日本沼虾α2-巨球蛋白基因表达的影响

为探讨KK-42提高感染嗜水气单孢菌的日本沼虾幼虾成活率的机制,实验首次克隆了α2M部分序列,研究了α2M基因的时空表达以及KK-42对其表达和活力的影响。将体长3.5~5.0 cm的日本沼虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,12 h后,每组再分为2个亚组,分别向虾腹部注射嗜水气单胞菌菌悬液(菌攻毒实验组和菌攻毒对照组)或生理盐水(实验组-1和对照组-1),于不同时间点测定幼虾的成活率、α2M基因表达水平和活力的变化。结果显示,KK-42预处理可显著提高感染嗜水气单胞菌的日本沼虾幼虾成活率。经BLAST比对,克隆的α2M部分mRNA序列与罗氏沼虾α2M具有90%以上同源性。实时荧光定量PCR实验显示,α2M基因表达水平在血细胞中最高,且以蜕皮前期最为显著。KK-42处理的幼虾血细胞α2M基因的表达无显著性差异;嗜水气单胞菌刺激使血细胞α2M mRNA水平在3 h比0 h提高了580%,其活力在24 h增幅为47.5%;而菌攻毒实验组mRNA水平在6~48 h明显高于菌攻毒对照组,尤其在12 h,增幅为511%,其活力水平也呈同样的变化趋势。研究表明,KK-42预处理能上调感染嗜水气单胞菌的幼虾血细胞α2M基因的转录水平,诱导α2M活力增强,这可能增强了幼虾的免疫水平,从而提高成活率。     

氨态氮和亚硝态氮对日本沼虾酚氧化酶活力及血蓝蛋白含量的影响

在水温(24±1)℃下分别测定了日本沼虾暴露在0、2.2、4.2、8.7、17.8、36.6 mg/L氨氮和0、2.0、3.2、5.0、7.9、13.3 mg/L亚硝酸盐后血淋巴中酚氧化酶活力和血蓝蛋白含量的变化。试验结果表明,随着氨氮和亚硝酸盐浓度的升高,酚氧化酶活力先升后降,在氨氮质量浓度为8.7 mg/L、亚硝酸盐质量浓度为5.0 mg/L时,酚氧化酶活力最高。在氨氮质量浓度为2.2 mg/L、亚硝酸盐质量浓度为2.0 mg/L时,血蓝蛋白含量显著高于对照组。日本沼虾血淋巴中酚氧化酶活力和血蓝蛋白含量没有相关性。     

青虾养殖投喂技术及抗应激管理

正青虾学名日本沼虾,又名河虾,在分类学上属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、游泳虾亚目、长臂虾科、沼虾属。青虾营养丰富、味道鲜美,蛋白质含量为18.42%,脂肪含量为1.3%,还含有丰富的钙、磷、铁和维生素等,深受广大消费者的欢迎。随着青虾新品种"太湖一号"的推广应用,青虾已成为江苏及附近地区主要养殖品种之一。与其他甲壳类动物一样,青虾对氧气的     

日本沼虾VASA蛋白的原核表达、抗体制备及其免疫鉴定

Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85 ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Westernblotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni²⁺-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160 000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识别融合蛋白,而且也能识别日本沼虾性腺粗提液中的内源性VASA蛋白,免疫组化进一步显示,VASA蛋白主要分布在卵母细胞核周围和精原细胞质中,成熟精子中无信号,暗示VASA在日本沼虾生殖细胞发育分化过程中扮演重要角色。     

虾夷扇贝毒素对Hela细胞凋亡的诱导及胞内钙离子浓度的影响

通过MTT分析、光学显微镜观察、Hoechst33342染色质荧光染色、DNA琼脂糖凝胶电泳、罗丹明123染色及钙离子激光扫描显微镜检测等手段,分析了虾夷扇贝毒素(yessotoxin,YTX)对Hela细胞的毒性作用.通过实验发现,正常Hela细胞与不同浓度YTX共孵育24 h后,一定浓度的YTX能对Hela细胞产生毒性作用,使其发生明显凋亡特征,如形态变化、染色质凝缩、DNA片段化以及线粒体膜电位降低.此外,YTX还能造成Hela细胞内胞质钙离子升高.这种毒性作用可能是YTX通过对胞内钙离子浓度的影响进而诱导发生的.     

甲壳类水产品中呋喃西林代谢物氨基脲的本底调查及来源分析

通过对常见甲壳类水产品中呋喃西林代谢物氨基脲本底含量的调查及来源分析,为水产品质量安全监管提供依据。本研究运用液相色谱-串联质谱法,对常见的4种甲壳类水产品中本底氨基脲的含量进行测定。结果表明,在4种甲壳类水产品中,日本沼虾和罗氏沼虾中氨基脲检出率达100%,日本沼虾中氨基脲平均检出值为6.92μg/kg,罗氏沼虾中氨基脲平均检出值为2.52μg/kg,均超过现行残留限量,而凡纳滨对虾和中华绒螯蟹中的氨基脲含量较低。本研究的结果为甲壳类水产品中氨基脲残留限量的制定提供了数据支持。     

虾夷扇贝毒素对ICR小鼠小脑浦肯野细胞毒性作用的初步研究

以雌性ICR小鼠为研究对象,尾静脉注射虾夷扇贝毒素24h后处死,通过脑组织切片,苏木精伊红染色、甲苯胺蓝染色以及钙结合蛋白S-100免疫染色,研究了虾夷扇贝毒素对小鼠浦肯野细胞的毒性作用。结果表明,尾静脉注射虾夷扇贝毒素的小鼠小脑浦肯野细胞细胞质有明显变化,同时在光学显微镜下观察到细胞核有收缩而用钙离子结合蛋白S-100的免疫荧光染色结果表明,虾夷扇贝毒素作用后,小鼠浦肯野细胞的S-100蛋白表达增多,而其他组织则没有明显变化。浦肯野细胞形态学以及细胞内钙离子结合蛋白的变化说明虾夷扇贝毒素可能对神经细胞有毒性作用。     

不同Ca~(2+)养殖条件下三角帆蚌外套膜和内脏团组织细胞的钙含量及其对碳酸酐酶的影响

为了探讨三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)在不同钙离子浓度养殖时,内脏团和外套膜细胞对环境中钙离子的吸收,以及细胞内钙离子浓度对碳酸酐酶的影响,本实验设定了5种钙离子的环境浓度(0 m M、0.5m M、1.25 m M、2 m M、3 m M),采用流式细胞仪测定内脏团和外套膜组织细胞内钙离子含量,用荧光定量PCR检测α-碳酸酐酶基因(HcCA)表达,并用乙酸对硝基苯酯的水解间接测定碳酸酐酶活性,以期能阐明环境中钙浓度对组织细胞钙含量的影响,和组织细胞内不同钙含量与碳酸酐酶基因表达和酶活性之间的关系。研究结果表明,在相同环境的钙离子浓度下,活体三角帆蚌的内脏团细胞中钙含量显著高于外套膜细胞(P0.05),并且表明从0 m M到2 m M浓度,内脏团和外套膜细胞内的钙含量显著上升(P0.05),在3 m M浓度时出现下降(P0.05)。同时,细胞内Ca~(2+)含量较低时,HcCA在内脏团和外套膜中的表达量均显著低于细胞内Ca~(2+)含量较高组(P0.05),但细胞内Ca~(2+)荧光强度为8×104时达到饱和且开始下降,而HcCA的表达在细胞内Ca~(2+)荧光强度为6×104已经最高,并开始下降。环境钙离子浓度在0 m M、0.5 m M时碳酸酐酶活性显著高于1.25 m M、2 m M、3 m M浓度组(P0.05),而且1.25 m M、2 m M、3 m M浓度组间无显著差异(P0.05),由此发现碳酸酐酶在0.5 m M钙离子浓度中活性较高但表达量却较低,而在1.25 m M和2 m M浓度中表达量高但活性较低,并且碳酸酐酶外套膜细胞酶活性在各浓度均显著高于内脏团细胞(P0.05)。本研究为三角帆蚌水体最适养殖钙浓度提供了重要依据。     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。     

基于线粒体COI基因的河南境内四水系日本沼虾种群遗传多样性

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)是一种经济价值较高的淡水虾类, 广泛分布于我国各淡水水体, 其在河南境内各水系均有分布。随着水产养殖业的发展、水域生态环境的变化及人为因素的影响, 日本沼虾的种质资源也逐渐受到影响。为评估河南境内水系日本沼虾的种质资源现状及其遗传多样性, 本研究利用线粒体 COI 基因对河南境内 18 个地理群体 135 尾日本沼虾开展种群遗传学研究, 样品覆盖河南境内的长江、黄河、淮河和海河 4 个水系。结果显示, 河南境内日本沼虾 18 个地理群体共包含 27 个单倍型, 群体平均单倍型多样性(H_d)为 0.78574, 平均核苷酸多样性(π)为 0.01059, 其中淮河水系日本沼虾群体平均遗传多样性最低, 长江水系日本沼虾群体平均遗传多样性最高, 且各水系群体均显示出高 H_d 低 π 的特点。AMOVA 分析显示, 日本沼虾遗传变异主要来源于日本沼虾群体内(66.03%), 群体间遗传变异为 40.22%。系统发育树和单倍型网络均未显示出明显的水系分化。中性检验、错配分布及贝叶斯天际线分析表明, 日本沼虾群体近期没有发生种群扩张, 群体相对稳定。本研究可为河南境内日本沼虾种质资源的保护和合理开发利用提供参考。     

双低菜籽粕在草鱼、鲤和日本沼虾配合饲料中适宜使用量的研究

以豆粕和鱼粉为基础蛋白源,以双低菜籽粕等氮替代一定量的豆粕和鱼粉,用于草鱼、鲤和日本沼虾的饲养。结果表明,饲料中菜籽粕等氮替代豆粕蛋白质等于或低于75%时,草鱼的增重率、特定生长率和摄食率与对照组相比均无显著差异;等氮替代率等于或低于50%时,饵料系数无显著差异;100%等氮替代豆粕和鱼粉蛋白质时各项生长性能均最差。饲料中菜籽粕等氮替代豆粕蛋白质等于或低于50%时,鲤的特定生长率和摄食率与对照组相比均无显著差异,25%等氮替代率时饵料系数最低。等氮替代7%豆粕蛋白质(饲料中菜籽粕含量为4.1%)时,日本沼虾的生长情况与对照组基本一致,等氮替代14%(菜籽粕含量为8.2%)时,日本沼虾的增重率显著低于对照组和XⅡ组,随着菜籽粕含量的增加,饲料系数增大,成活率下降。     

日本沼虾三个野生群体亲缘关系分析

为研究我国野生日本沼虾洞庭湖、鄱阳湖、龙感湖3个不同地理群体之间的亲缘关系,利用微卫星(SSR)分子标记技术对上述3个群体进行了亲缘关系分析。从47对引物中筛选出11对引物对日本沼虾上述3个不同地理群体的基因组进行PCR扩增,共扩增90个条带,其中69个(占76.6 ％)为多态性条带。参照pBR322DNA/MspI Marker估算所扩增的条带大小,根据条带的位置确定其基因型,并利用GENEPOP32软件进行遗传距离和相似指数数据分析。结果发现:日本沼虾3个不同地理群体间遗传距离最大为0.196 5,最小为0.186 1,平均遗传距离为0.188 8。采用NTsys2.20聚类分析软件的UPGMA聚类法进行聚类分析的结果表明:龙感湖群体与鄱阳湖群体的亲缘关系最近,而与洞庭湖群体的亲缘关系最远。     

胰蛋白酶水解虾头壳制备钙结合肽的工艺条件优化研究

在单因素试验研究时间、底物浓度、pH,酶浓度和温度对蛋白水解度和酶解液中可溶性钙含量的影响基础上,通过响应面分析法对酶解条件进行了优化,得出最佳酶水解工艺条件为:底物浓度10%,pH 7.4,温度50℃,酶添加量1.39%,水解5h.在此条件下,酶解液水解度为29.0%,可溶性钙含量为176.4 mg/ml,水解液经凝...     

KK-42对日本沼虾D3期头胸甲表皮结构的影响

为探讨KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制,实验采用组织学方法观察了幼虾头胸甲表皮结构,定量测定了肝胰腺N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的活力。将体长(3.3±0.5)cm的日本沼虾随机分为两组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液(实验组)或不含KK-42的溶液(对照组)浸泡处理1 min之后,选取处于蜕皮前期D3期的日本沼虾,观察头胸甲表皮结构,测定肝胰腺NAGase活力。结果显示,KK-42处理后第1天,头胸甲外表皮厚度与对照组相比显著增长42.83%;第3天和第9天,内表皮的厚度同比提高70.72%、77.27%,整个头胸甲的厚度同比显著增厚。KK-42处理后第3天,上皮细胞的高度比对照组提高31.69%。KK-42处理后6、12和24 h,NAGase活力分别比相应的对照组升高42.53%、34.28%和18.36%。研究表明,KK-42处理可显著增加D3期日本沼虾头胸甲外骨骼的厚度,提高肝胰腺NAGase活力。