胡子鲇脑型芳香化酶基因全长cDNA克隆及表达

采用RT-PCR和RACE法,克隆了胡子鲇(Clarias fuscus)脑型芳香化酶基因Cyp19a1b,应用荧光实时定量PCR检测其在前脑、下丘脑、脑垂体、肝、精巢和卵巢6种组织,以及性腺分化前后(出膜后12～30 d)全鱼中的mRNA表达。结果表明,Cyp19a1b cDNA全长2 347 bp,5′端非编码区219 bp,3′端[不包括poly(A)]596 bp,开放阅读框(ORF)1 503 bp,编码500个氨基酸,推测其编码蛋白质分子量为56.388 kD。序列分析及分子系统进化树结果表明,胡子鲇Cyp19a1b氨基酸序列与非洲鲇(Clarias gariepinus)Cyp19a1b同源性最高,达95.6%;与南方大口鲇(Silurusmeridionalis)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、斑马鱼(Danio rerio)、斑点叉尾(Ictalurus punctatus)、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)、鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)及稀有鲫(Gobiocypris rarus)Cyp19a1b同源性达75%以上,但与上述鱼类的性腺型芳香化酶基因(Cyp19a1a)同源性低于62%,表明其为脑型芳香化酶,同源性分析结果与根据传统形态学和生化特征分类的结果相一致。荧光实时定量PCR结果显示,Cyp19a1b在胡子鲇上述组织中均有表达,其中下丘脑中表达量最高,肝和精巢最低,在脑部的表达存在明显的性别差异(P<0.05)。此外,在胡子鲇性腺分化前(出膜后12 d)Cyp19a1b即开始表达,但分化前后表达量无显著性差异(P>0.05)。结果暗示Cyp19a1b可能不是引起胡子鲇性腺分化的直接因素,但其可能通过"下丘脑垂体性腺轴"对性腺分化过程产生间接影响。     

淇河鲫cyp19a1b基因的克隆表达及芳香化酶抑制剂对其表达的影响

为探索脑型芳香化酶基因(cyp19a1b)在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,采用Real-time PCR分析其在不同组织、胚胎及胚后不同发育时期的表达情况,同时检测芳香化酶抑制剂Letrozole诱导性逆转及腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后cyp19a1b在脑中的表达情况。结果显示,淇河鲫cyp19a1b cDNA全长2 984 bp(GenBank ID:MF926270),包含132 bp5′非编码区,1 319 bp 3′非编码区,1 533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性较低,这与其分类地位一致;组织分布检测结果显示,cyp19a1b基因在淇河鲫脑中表达量最高,在卵巢等其他组织中表达量较低;Realtime PCR结果表明,在胚胎发育过程中cyp19a1b在外源精子刺激后从囊胚期开始上调,神经胚期达到最高,随后降低;出膜后随着发育的进行,该基因在脑中表达量逐步上调,在躯体中一直维持在较低水平;除此之外,伴随着Letrozole诱导的性逆转,cyp19a1b在脑中表达量降低;腹腔注射hCG可以促进cyp19a1b在脑中表达。研究表明,淇河鲫cyp19a1b基因可能通过参与神经系统的形成及神经内分泌活动,在性别决定与分化过程中起到一定的作用。     

剑尾鱼卵黄蛋白原C(Vg C)全长cDNA的克隆及表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法,克隆获得剑尾鱼卵黄蛋白原C(Vg C)基因的全长cDNA序列。剑尾鱼Vg C基因cDNA序列全长4 011 bp,其5′非编码区包含12 bp和3′非编码区包含246 bp;含有一个3 753 bp的开放阅读框(ORF),编码1 250个氨基酸,推测其编码氨基酸分子量大小为141.7 ku,编码氨基酸序列与其他鱼类卵黄白原C编码氨基酸序列相似性在44%～85%。荧光定量PCR结果显示,Vg C在剑尾鱼肝脏中表达量最高,脾、肾、卵巢中有微量表达,脑、肌肉、鳃中几乎没有检测到表达;对不同时间暴露在雌激素中剑尾鱼肝脏进行实时荧光定量PCR表达分析的结果表明,Vg C在剑尾鱼肝脏中第5天表达量最高,随后降低,第9天后维持相对较低的表达量。研究首次克隆了剑尾鱼Vg C基因全长cDNA序列,并对Vg C在剑尾鱼体内表达组织器官分布及雌激素诱导后不同时间表达谱进行了初步研究,为剑尾鱼生殖生理及环境污染物监测应用等不同领域研究打下重要基础。     

稀有■鲫Foxo3a、Foxo3b基因克隆和表达分析

利用RACE技术自稀有■鲫的卵巢中克隆叉头蛋白O3a(Foxo3a）、叉头蛋白O3b(Foxo3b）基因的全长cDNA序列，采用RT-PCR、qRT-PCR和原位杂交法检测其组织分布、时序表达、细胞定位和雷帕霉素处理后的表达。结果显示，Foxo3a基因全长cDNA序列为2562bp，包括242bp的5′端非编码区、367bp的3′端非编码区、1953bp的开放阅读框，编码650个氨基酸；Foxo3b基因全长cDNA序列为2804bp，包括470bp的5′端非编码区、375bp的3′端非编码区、1959bp的开放阅读框，编码652个氨基酸。Foxo3a基因只在脑和卵巢中表达，在其他组织中不表达；Foxo3b基因在所检测的组织中均有表达，在脑和卵巢中的表达量较高。随着卵巢的发育，Foxo3a基因表达量呈逐渐升高的趋势，Foxo3b基因表达量未出现显著变化。原位杂交结果显示，Foxo3a、Foxo3b基因定位于卵巢Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ时相的生殖细胞和滤泡细胞中。雷帕霉素处理影响了卵巢中Foxo3a基因的表达，对Foxo3b基因的表达无显著影响。试验结果表明，Foxo3a和Foxo3b基因可能在稀有■鲫...     

异齿裂腹鱼Clock基因cDNA的克隆与组织表达特征

异齿裂腹鱼广布于雅鲁藏布江,产卵期为每年的3—5月,表现出明显的季节性繁殖行为,Clock基因被认为是自然选择塑造日节律以及与动物繁殖等生活史特性有关潜在的目标基因,异齿裂腹鱼Clock蛋白C末端Poly-Q长度的变异可能与其产卵开始的时间关联。以采自雅鲁藏布江的异齿裂腹鱼为对象,采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆异齿裂腹鱼Clock基因cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR对其在异齿裂腹鱼雌、雄个体不同组织中的表达特征进行分析。试验结果显示：异齿裂腹鱼Clock基因cDNA全长为4291 bp(Genbank登录号MT774361),5′非编码区为539 bp, 3′非编码区为1046 bp,编码序列为2706 bp,共编码901个氨基酸,所编码的氨基酸在末端具有典型的Poly-Q结构;Clock基因在异齿裂腹鱼雌、雄个体的肝脏、脾脏、心脏、脑、性腺和肌肉中均有表达,且以性腺中的相对表达量最高,肌肉次之,脾脏最低;Clock基因除在心脏组织中的相对表达量雄鱼高于雌鱼,在其他组织的相对表达量均表现为雌鱼高于雄鱼。异齿裂腹鱼雌、雄个体的Clock基因在性腺组织中均高表达,表...     

七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi) OTX2基因克隆及其表达分析

为探讨otx2基因在七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi)亲代抚育过程中的作用,本试验采用RT-PCR法克隆得到了七彩神仙鱼otx2基因,otx2基因的cDNA序列的CDS区序列长度为873 bp,共编码290个氨基酸,预测分子质量为31 771.55 Da,理论等电点为9.40。运用SMART、Swiss-model和MEGA软件对基因的结构及物种进化关系进行分析。氨基酸序列预测显示,该基因具有otx保守结构域,在进化关系上与尼罗罗非鱼和白边锯鳞鱼亲缘关系相近,同源性分析发现,其氨基酸序列与尼罗罗非鱼、长■、西瓜刨、牙鲆和白边锯鳞鱼的同源性都在75%以上。荧光定量PCR分析显示,otx2基因在雌性七彩神仙鱼的脑、心脏、肝脏、肾脏等组织中都有表达,并且在脑组织中显著高表达。荧光原位杂交结果显示,otx2基因在七彩神仙鱼脑组织中的小球周灰质带、纵枕、顶盖室等区域均有表达。     

中国大鲵Cyp51基因特征与性腺表达分析

采用RT-PCR法从大鲵(Andrias davidianus)性腺中分离获得Cyp51基因全长cDNA 1 975 bp, 5′端非编码区135 bp, 3′端非编码区331 bp,开放阅读框(ORF)1 509 bp,编码503氨基酸。生物信息学分析显示,Cyp51基因编码蛋白的二级结构含有50.20%的α-螺旋,9.96%的延伸链,3.59%的β-转角,36.25%的无规则卷曲。系统进化树显示,大鲵与两栖类中的热带爪蟾和非洲爪蟾同源性最高,与其它物种也有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示,Cyp51基因在卵巢、肝、肾等组织表达水平显著性高于其它各组织;性腺发育不同时期表达结果显示,Cyp51基因在1-5Y卵巢中表达显著性高于精巢,在6Y时无显著性差异;在雌性与伪雌性性腺中表达水平显著高于雄性及伪雄性性腺。结果表明Cyp51基因对大鲵的性腺分化,尤其是卵巢发育有着重要作用。     

虎皮鱼热激蛋白PtHsp70基因序列与低温表达分析

通过同源克隆和cDNA末端快速克隆技术扩增获得狭温热带鱼类虎皮鱼热激蛋白70(PtHsp70)基因的cDNA序列,BLAST比对分析基因序列同源性,预测其编码氨基酸序列和结构,实时荧光定量PCR技术分析虎皮鱼PtHsp70基因组织特异性表达谱和低温胁迫下PtHsp70基因的表达模式。研究结果表明,PtHsp70基因cDNA序列全长2317 bp,其中5′非编码区120 bp,3′非编码区266 bp,编码区1932 bp,对应的开放阅读框为121～2052 bp,预测编码643个氨基酸。PtHsp70基因mRNA在成年虎皮鱼不同组织中表达水平依次为肝脏肌肉鳃脑,其中肝脏PtHsp70基因本底表达水平显著高于其他组织(P0.01),表明其在肝脏中具有重要的生物学功能。而随温度降低,肝脏PtHsp70基因表达水平呈先降后升的趋势,表明肝脏PtHsp70基因参与虎皮鱼应对低温胁迫的过程;随温度降低,虎皮鱼脑、鳃和肌肉组织PtHsp70基因mRNA水平显著上调(P0.01),说明低温胁迫诱导PtHsp70基因mRNA表达。本研究克隆并鉴定了PtHsp70基因序列和组织表达谱,分析了低温胁迫下PtHsp70基因表达模式,研究结果显示,狭温热带鱼类虎皮鱼的PtHsp70基因具有组织特异性和温度诱导型表达特征。研究发现,PtHsp70基因在响应低温胁迫过程中具有重要作用,具有作为虎皮鱼低温胁迫分子标志物的潜能。     

梭鲈ghrh基因序列特征及其在大小个体间差异表达分析

为了探究生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone,ghrh)基因对梭鲈(Sander lucioperca)生长调控的作用,本研究利用RACE技术克隆获得了ghrh cDNA基因全长序列,并利用实时荧光定量PCR技术对其组织表达模式和大小个体间表达模式进行了分析。结果显示：ghrh基因cDNA全长为1 100 bp,包含494 bp的5′非编码区、180 bp的3′非编码区和编码141个氨基酸的开放阅读框。氨基酸多重比对发现,梭鲈ghrh与河鲈(Perca fluviatilis)、黄金鲈(P.flavescens)的ghrh氨基酸序列相似性分别为95.04%和94.33%,ghrh基因在鱼类和哺乳动物中都存在一个GLUCA保守结构域(65～91 aa)。ghrh基因在梭鲈各组织均有表达,脑组织中相对表达量最高,垂体次之,与其他组织相比差异显著。ghrh基因表达量与梭鲈体质量呈正相关,脑、肝和肌肉组织中ghrh基因表达量均为体质量极大组高于极小组,其中,脑组织中差异显著。因此,ghrh基因可以作为梭鲈生长候选基因用于分子选择育种。     

三倍体雌性虹鳟性腺发育阶段细胞色素相关基因的表达

Cyp19a1b、Cyp11a1、Cyp11b2、Cyp17a1、Hsd3b1等细胞色素相关基因能够调节硬骨鱼类性类固醇的合成,对性腺发育和性别决定产生影响。本研究以全雌三倍体虹鳟(Oncorhynchus mykiss)为研究对象,正常雌性二倍体虹鳟为对照,选取31~68 dpf(days post fertilization)时间段的虹鳟仔鱼脑组织,采用q RT-PCR和酶联免疫的方法研究以上几种基因的表达状况和脑芳香化酶的活性变化,以期探明导致三倍体雌性虹鳟性腺发育异常的关键原因。q RTPCR结果显示,二倍体中Cyp19a1b在30~50 dpf时表达量上调并且维持在较稳定水平,但50~56 dpf时表达量逐渐下调,之后56~68 dpf表达量持续上调;三倍体中Cyp19a1b表达量在30~35 dpf开始上调,35~47 dpf逐渐下调,47~55 dpf开始第二次上调,之后维持在较稳定水平直至68 dpf,但三倍体Cyp19a1b的表达量显著(P0.05)低于同期二倍体的。二倍体Cyp11a1表达量在34 dpf出现峰值,三倍体Cyp11a1在38 dpf时出现峰值。二倍体Hsd3b1表达量在33~42 dpf时维持在较高水平,在38 dpf时出现高峰;三倍体Hsd3b1表达量在47~59 dpf时较高,在49 dpf出现高峰。二倍体中Cyp11b2在37 dpf出现峰值,之后开始下调;三倍体在40 dpf出现峰值,之后逐渐下调,但三倍体Cyp11b2表达量显著低于同期二倍体。二倍体Cyp17a1的表达量在35~46 dpf时逐渐上升,在45 dpf时达到高峰之后直至69 dpf逐渐下降,并且维持在较为平稳的水平上;但是在相同的实验条件下未检测到同一时期三倍体Cyp17a1的表达量。酶联免疫结果显示,在40 dpf时二者的脑芳香化酶活性到达高峰,但在40~60 dpf时期,二倍体虹鳟脑芳香化酶活性显著(P0.05)高于三倍体虹鳟,尤其在45~50 dpf时,该酶活性分别较三倍体的高1.15倍和1.12倍。以上结果表明三倍体虹鳟早期性腺发育迟缓的原因之一是Cyp19a1b、Cyp11a1、Cyp11b2、Cyp17a1、Hsd3b1等基因的表达晚于二倍体,且表达量低于二倍体,造成雌二醇不能正常合成,最终导致性腺发育迟缓。