中国七种水生动物源无乳链球菌的分子特征及其对斑马鱼的致病性

为了解中国水生动物源无乳链球菌的分子流行特征,揭示其传播和流行规律,本实验对分离得到并鉴定的10株7种水生动物源无乳链球菌通过分子血清型、多位点序列分型(MLST)分型、毒力基因型和前噬菌体分型等方法进行分子分型;其次,通过斑马鱼评价7种水生动物源无乳链球菌的致病性。分子血清型分析结果表明,10株无乳链球菌可分为3种血清型,即Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型;MLST分型结果表明,Ⅰa型无乳链球菌均为ST7型,Ⅰb无乳链球菌均是ST261型,只有Ⅲ型无乳链球菌是ST739型。进一步分型结果表明,10株无乳链球菌可分为3种毒力基因型和4种前噬菌体基因型。根据4种分型结果可知,10株水生动物源无乳链球菌可分为4种类型,其中虎纹蛙源无乳链球菌具有独立的分子血清型、MLST型、毒力基因型和前噬菌体基因型,即Ⅲ-ST739-V1-P3;罗非鱼源无乳链球菌的基因型有3种,即Ⅰa-ST7-V2-P1、Ⅰa-ST7-V2-P2和Ⅰa-ST7-V3-P4;红尾皇冠鱼、鳙和罗非鱼源无乳链球菌的基因型相同:Ⅰa-ST7-V2-P2;卵形鲳鲹、宝石鲈和罗非鱼源无乳链球菌具有相同的基因型:Ⅰa-ST7-V2-P1;鲮和罗非鱼源无乳链球菌的基因型相同,即Ⅰb-ST261-V3-P4。致病性研究表明,7种水生动物源无乳链球菌对斑马鱼均有强致病性。研究表明,两栖类虎纹蛙源无乳链球菌和鱼源无乳链球菌的基因型明显不同,它们之间遗传变异较大,因此,无乳链球菌在两栖类和鱼类之间相互传播的可能性较小。鱼源无乳链球菌有3种基因型,且这3种基因型均在罗非鱼中流行,这表明无乳链球菌在鱼类中相互传播的可能性较大,尤其是在罗非鱼与其他鱼类之间。     

我国罗非鱼源新型无乳链球菌的分离、鉴定及其分子特征

2014年海南省文昌市多个养殖场的罗非鱼出现暴发性疾病,患病罗非鱼表现出体色发黑、打转游动、眼球突出或混浊等典型的链球菌病症状。从患病罗非鱼的肝、肾、脾、眼球和脑等组织中分离到19株病原菌,即TC-1、TC-2、BL1441~BL1448和WT1451~WT1459。通过形态观察、生理生化特征和16S r RNA基因序列分析等方法对病原菌进行鉴定,结果表明,这些病原菌均为无乳链球菌。溶血试验结果表明,TC-1、TC-2和BL1441~BL1448菌株为β-溶血性无乳链球菌,而WT1451~WT1459菌株为不溶血无乳链球菌。进一步通过MLST、分子血清型和毒力相关基因检测等技术对这些分离菌株进行遗传特征分析,结果表明TC-1、TC-2和BL1441~BL1448菌株是常见的Ia-ST7型,其毒力基因型为bac+-bca+-bib A+-cfb+-hyl B+-iag A+-fbs B+-lmb–-scp B–-cyl E+-gbs20186–。而WT1451~WT1459菌株则是Ib-ST261型,其毒力基因型为bac–-bca–-bib A+-cfb+-hyl B+-iag A+-fbs B+-lmb–-scp B–-cyl E–-gbs20186+。将分离菌株BL1441和WT1451分别对罗非鱼进行攻毒试验,结果表明,WT1451菌株是强毒株,当其攻毒剂量为4.5×103CFU/m L时,罗非鱼累积死亡率可达85%。本研究将为我国罗非鱼无乳链球菌的流行病学、疫苗研制以及疾病防控等研究奠定基础。     

广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为获知近年广西罗非鱼链球菌病流行菌种及其基因型变化信息,采用特异PCR方法对2006-2012年从广西发病罗非鱼分离获得的77株临床菌株进行鉴定,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2006-2011年分离获得的37株流行菌株进行基因型分析.结果显示,其中20株鉴定为海豚链球菌其余57株鉴定为无乳链球菌.2006-2007年获得的19株流行菌株中有18株为海豚链球菌(94.7％),仅1株无乳链球菌;2009-2012年分离的58株流行菌株中56株为无乳链球菌(96.6％),仅2株海豚链球菌.PFGE图谱聚类显示,海豚和无乳链球菌分别聚类为两个大分支,20株海豚链球菌共产生4种PFGE带型,带型相似度为83.9％～100％;17株无乳链球菌共产生5种PFGE带型,带型相似度为47.4％～100％.研究表明,广西罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前)以海豚链球菌为主转变为现在(2009-2012年)以无乳链球菌为主;流行菌株PFGE基因型存在多样性.     

广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为获知近年广西罗非鱼链球菌病流行菌种及其基因型变化信息,采用特异PCR方法对2006~2012年从广西发病罗非鱼分离获得的77株临床菌株进行鉴定,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2006~2011年分离获得的37株流行菌株进行基因型分析。结果显示,其中20株鉴定为海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)其余57株鉴定为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)。2006~2007年获得的19株流行菌株中有18株为海豚链球菌(94.7%),仅1株无乳链球菌;2009~2012年分离的58株流行菌株中56株为无乳链球菌(96.6%),仅2株海豚链球菌。PFGE图谱聚类显示,海豚和无乳链球菌分别聚类为两个大分支,20株海豚链球菌共产生4种PFGE带型,带型相似度在83.9%~100%之间;17株无乳链球菌共产生5种PFGE带型,带型相似度在47.4%~100%之间。研究表明,广西罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前)以海豚链球菌为主转变为现在(2009~2012年)以无乳链球菌为主;流行菌株PFGE基因型存在多样性。     

中国南方地区罗非鱼无乳链球菌的分子流行病学研究

从广东省以及海南省等地区养殖的患病罗非鱼体内分离、收集到多株致病菌,经生化分析和分子生物学鉴定,均为无乳链球菌。对这些菌株分别进行了耐药谱测定、分子分型试验以及分子血清型分析。药敏试验结果表明,2007—2010年分离到的无乳链球菌耐药谱基本相似;多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)试验中,选择5个高变异指数的可变数目重复位点(VNTR)进行分子分型,结果表明,所有鱼源无乳链球菌菌株为同一MLVA型,而作为对照的牛源无乳链球菌则明显不同;为了对这些菌株进一步分型,分别进行了分子血清型和表面蛋白抗原基因的检测,结果表明,鱼源无乳链球菌的分子血清型均为Ⅰa型,表面蛋白抗原均为alpha-C蛋白。这进一步说明了不同年份和不同地区的鱼源无乳链球菌在基因水平上为同一分子类型,具有相同的起源或传染源。同时也说明,我国南方地区罗非鱼无乳链球菌在这几年中未发生明显的遗传变异。这些结果为罗非鱼无乳链球菌病疫苗研制,疫病监测及药物防治的研究提供理论依据。     

广西卵形鲳鲹海豚链球菌基因分型、耐药谱型以及毒力基因检测

为了解近年来广西卵形鲳鲹海豚链球菌流行菌株的基因型信息以及菌株间的差异,对2015—2016年从广西地区7个养殖场的患病卵形鲳鲹体内分离得到的17株海豚链球菌菌株分别进行了基因型分析、耐药谱测定以及毒力基因检测。采用随机扩增多态性DNA标记技术(RAPD)和基因组重复序列PCR(rep-PCR)分析其基因型。结果显示,RAPD和rep-PCR指纹图谱结果一致,17株海豚链球菌可分为2种基因型。对海豚链球菌7种主要的毒力相关基因特异PCR检测,所有菌株均为sim A+scp I+pdi+sag A+cps D+pgm A+cfi+毒力基因型,表明这2种基因型的海豚链球菌似乎均为毒力较强的菌株。采用K-B法进行了20种抗生素敏感实验分析其耐药谱,结果表明归于基因1型的菌株耐药谱为AZT,基因2型菌株则出现3种相似的耐药谱,分别为SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/PB、SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/CRO和SIZ/T/S/PEN/AZT/SPE/CAZ/PB/RIF,证实基因型相同的菌株耐药谱型也相似,2种基因型的菌株耐药谱型差异显著,因此基因型和耐药谱型存在相关性。此结果为卵形鲳鲹海豚链球菌病流行病学研究、疫苗研制以及疫病监测提供理论依据。     

一株梭鲈源无乳链球菌的分离、鉴定及分子分型分析

为查明梭鲈(Lucioperca lucioperca)凸眼病病原,从患病梭鲈病灶眼、肝、脾和肾分离纯化病原菌,进行了生理生化特性测定及16S rRNA基因序列分析,并开展人工感染试验,测定其血清型及MLST分型,并利用纸片扩散法进行药敏特性分析。结果显示:分离菌株(命名为SL1701株)为本次引发梭鲈病害的致病菌,Ib-ST261型。回归感染实验证实,分离得到的细菌SL1701对健康梭鲈具有非常强的致病性,4.5×105CFU/m L时可使80%受感染梭鲈死亡,并可复制出自然发病鱼的症状。菌株SL1701革兰氏染色为阳性链球菌,γ溶血,生理生化特性与普通无乳链球菌基本一致,16S rRNA基因序列与无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)同源性最高,综合判定分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。药敏试验结果显示:分离菌株SL1701对氟苯尼考、氟罗沙星等17种抗生素高度敏感,对青霉素、磷霉素等8种抗生素耐药。结果表明,分离菌株SL1701为Ib-ST261型无乳链球菌,养殖时可选用氟苯尼考及氟罗沙星等药物进行防控。     

BALB/c小鼠用于评价尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力的研究

实验采用BALB/c小鼠作为实验动物,旨在建立尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力测定的BALB/c小鼠模型。BALB/c小鼠经腹腔注射尼罗罗非鱼源无乳链球菌建立感染模型,比较了尼罗罗非鱼源无乳链球菌分别感染尼罗罗非鱼和小鼠的LD_(50)差异,分别测定了不同毒力尼罗罗非鱼无乳链球菌对尼罗罗非鱼和小鼠的毒力。结果显示,小鼠经腹腔注射无乳链球菌,在24 h内出现死亡现象,且对小鼠脑、肝脏、脾脏、肾脏等组织造成损伤。3次测定尼罗罗非鱼无乳链球菌TFJ0901对尼罗罗非鱼和小鼠LD_(50)分别为7.7×10~7、2.2×10~8、3.5×10~9 CFU/mL和405、361、419 CFU/只。将无乳链球菌TFJ0901和THN0901感染尼罗罗非鱼(1.0×10~7 CFU/mL)和小鼠(100 CFU/只),尼罗罗非鱼和小鼠存活率分别为100%、6.7%±5.8%和100%、0,其存活率都具有显著性差异。将无乳链球菌TFJ0901和TFJ-F感染尼罗罗非鱼(3.0×10~8 CFU/mL)和小鼠(2 500 CFU/只),尼罗罗非鱼的存活率分别为73.3%±11.5%和80.0%±10.0%,存活率差异不显著,小鼠存活率分别为13.3%±11.5%和100.0%,存活率具有显著性差异。研究表明,本实验成功建立了BALB/c小鼠作为尼罗罗非鱼源无乳链球菌毒力测定的稳定模型,测定不同毒力的尼罗罗非鱼源无乳链球菌对小鼠毒力与对尼罗罗非鱼毒力一致,且该模型能够区分尼罗罗非鱼模型难以区分的毒力相近的无乳链球菌。     

罗非鱼无乳链球菌的分子鉴定

对罗非鱼致病菌株TL60829NA及其人工感染后分离菌株TL60829NA1、TL60829NA2应用原核生物16S rRNA基因通用引物进行分子分类学鉴定.对这些菌株进行16srRNA基因的克隆、序列分析,核酸序列同源性分析表明,TL60829NA及其人工感染后分离菌株TL60829NA1、TL60829NA2为同一种细菌.其中,TL60829NA2与GenBank登陆号为DQ303183的无乳链球菌(Streptococcus agalaciate)菌株ATCC13813序列同源性最高(99.8%).同时,通过与常引起罗非鱼链球菌病的S.agalaciate、S.iniae代表菌株16srRNA基因构建的发育进化树表明,该菌株及其人工感染后分离菌株与S.agalaciate代表菌株构成一个进化分枝,而4株S.iniae代表菌株的16srRNA基因则构成另一个分枝.本研究证实了从发病罗非鱼肝脏组织中分离到的致病性链球菌为无乳链球菌.     

自然感染无乳链球菌罗非鱼的比较病理学及毒力基因谱分析

在自然感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的罗非鱼(Oreochromis niloticus)成鱼、稚鱼和自然携带无乳链球菌的罗非鱼体内分别获得14株、4株和2株无乳链球菌。临床和组织病理学分析显示,罗非鱼成鱼出现无规则游动,脑、眼眶、鳃和鳍条充血,眼球突出、白浊,内脏器官肿大、充血,以肾小管玻璃样变性、脑膜炎和心外膜炎等组织病理学变化为特征;罗非鱼稚鱼体表无明显症状,但部分内脏器官呈现肿大、充血现象,以脾脏血管区出血、肾小管上皮细胞变性、脑组织炎症反应较轻为其主要组织病理学特征。此外,罗非鱼胃固有层内及稚鱼肝脏组织中有大量的嗜酸性粒细胞浸润,可观察到无乳链球菌在成鱼的脑、心脏以及稚鱼肝脏中增殖;自然携带无乳链球菌的罗非鱼临床症状和组织学病变均不明显。PCR检测发现,各无乳链球菌毒力基因谱相同,但自然感染无乳链球菌的罗非鱼成鱼、稚鱼和自然携带无乳链球菌的罗非鱼的病理学损伤差异显著。     

海南无乳链球菌的毒力基因与耐药特性分析

无乳链球菌可感染人与其他动物,是一种重要的致病菌。为探明海南地区无乳链球菌的毒力基因携带率及耐药情况,以2017年间实验室所采集鉴定的18株无乳链球菌(人源4株,鱼源14株)为样本,利用PCR技术和抗菌药物药敏纸片进行毒力基因、耐药基因的扩增和药物敏感性的检测,结果发现,常见毒力基因阳性检出率较高,其中有11种毒力基因均100%携带,另外3种基因阳性率也超过66.7%;耐药基因扩增结果显示,除四环素类和氨基糖苷类耐药基因均呈阴性以外,其余耐药基因阳性检出率较高(44.4%~100%);而药敏检测显示,无乳链球菌对β-内酰胺类、大环内酯类、林可胺类抗生素耐药性高,而对于氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类抗生素敏感性高。总体上,药敏情况和耐药基因的检测结果一致。研究结果发现,分离得到的不同来源的无乳链球菌中毒力基因检出频率高,耐药性强,需要引起高度重视,试验结果将为无乳链球菌的防治提供重要的参考。     

Isolation and molecular characterization of streptococcal species recovered from clinical infections in farmed Nile tilapia (Oreochromis niloticus) in the Philippines

Streptococcosis cause severe losses for global tilapia farming, especially in developing countries. The aim of this study was to identify and characterize streptococci recovered from Nile tilapia farmed in the Philippines. Moribund and apparently healthy fish were sampled from grow-out cages, ponds and hatcheries. Clinical signs observed included exophthalmia, eye opacity, ascites, lethargy, erratic swimming and haemorrhages. Results showed that both Streptococcus iniae and Streptococcus agalactiae were associated with disease in these sites. Consistent with global reports, including those from South-East Asia, S. agalactiae was more widespread than S. iniae. Molecular serotyping of the S. agalactiae isolates identified the serotype Ia and serotype Ib. Histopathological findings were meningitis, meningoencephalitis and septicaemia. Identical virulence profiles were found for all strains of S. iniae, while S. agalactiae strains were separated into virulence profile I and profile II. All strains were susceptible to the tested antibiotics and resistant to oxolinic acid. Only S. agalactiae serotype Ib showed resistance to sulphamethoxazole–trimethoprim. This is the first study from the Philippines to characterize the streptococci involved in disease outbreaks in tilapia aquaculture. Outputs from this study will promote the development of efficacious disease control strategies in tilapia farming for the Philippines and South-East Asia.     

罗非鱼海豚链球菌16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

为了从分子水平上对1株致病性罗非鱼链球菌进行分类学鉴定,利用原核生物16SrRNA基因通用引物对分离纯化的罗非鱼致病性链球菌进行16S rRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1.5 kp目的片段,测序得到1条长度为1 447 bp核苷酸序列。核苷酸相似性分析表明,序列与NCB I公布的海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)SCCF5L菌株16SrRNA基因核苷酸序列相似性最高(99.4%),暂称为中国广西株(S.iniae-CGX)。同时,亲源关系较近的S.iniae、S.difficilis和S.agalactiae代表菌株构建的系统发育进化树显示,所得菌株与S.iniae代表菌株组成同一进化分支,与S.agalactiae代表菌株组成的另一进化分支距离较近(95.5%),而与S.difficilis代表菌株组成的进化分支距离较远(92.3%)。上述研究证实,本试验从发病罗非鱼脑组织分离到的致病性链球菌为海豚链球菌。     

Identification and molecular typing of <Emphasis Type="Italic">Streptococcus agalactiae</Emphasis> isolated from pond-cultured tilapia in China

Bacteria strains with strong virulence were isolated from pond-cultured tilapia in China. They were identified as Streptococcus agalactiae by biochemical assays, and confirmed by 16S ribosomal RNA (rRNA) and group B Streptococcus (GBS)-specific gene cfb analyses. Multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay of the alpha C protein (ACP) gene and capsular polysaccharide antigen (cps) gene was employed to identify their molecular serotype (MS). Amplification of the ACP gene produced a 400-bp C alpha protein gene (bca) fragment, suggesting that these isolates belong to MS Ia, Ib or II; amplification of cps produced a 790-bp amplicon, indicating that they belong to MS Ia/III-3. An additional PCR based on nucleotide difference in the cps H–I region of MS Ia and III further suggested that the isolates belong to serotype MS Ia. Moreover, multi-locus sequence typing (MLST) indicated that these strains were of sequence type 7 (ST-7). These results showed that isolates from different regions of China shared the same MS and ST. However, none of the isolated ST-7 GBS corresponded to the capsular serotype, suggesting that these fish GBS possessed specific molecular characteristics not present in human or other animals. Data from this study will facilitate the understanding of epidemiology and nosogenesis of tilapia GBS and the establishment of effective disease prevention methods.     

罗非鱼无乳链球菌拮抗株的筛选及特性研究

自吉富罗非鱼养殖池塘水体、底泥和鱼体肠道中筛选无乳链球菌拮抗株。对其中1株抑菌能力最强的菌株LT3-1进行溶血性、形态、生理生化、16S rRNA基因序列测定,并进一步对其抑菌活性与发酵时间的关系、抑菌物质对温度的耐受性、产酶性能、降解亚硝酸盐性能、药物敏感性、安全性试验、攻毒试验进行研究。鉴定结果表明,菌株LT3-1为枯草芽孢杆菌,无溶血性。液体发酵16 h时,抑菌活性最强,抑菌圈平均直径为(25.30±0.57) mm。随温度的升高抑菌活性下降,但仍然存在,说明抑菌物质有耐高温特性。枯草芽孢杆菌LT3-1具有水解蛋白、淀粉和纤维素的能力。亚硝酸盐降解试验表明,枯草芽孢杆菌LT3-1菌液密度为10^5 cfu/mL时,6 h即可将亚硝酸盐质量浓度由2.5 mg/L降至0.03 mg/L,降解率达98.8%( P <0.05)。枯草芽孢杆菌LT3-1对检测的9种抗生素均敏感,罗非鱼接种密度为10^7 cfu/mL的枯草芽孢杆菌LT3-1菌液200 μL后,仍然存活且未有异常表现。动物攻毒试验表明,添加0.05%枯草芽孢杆菌LT3-1菌粉的试验组罗非鱼存活率提高20%,显著高于对照组( P < 0.05 )。综上所述,筛选自吉富罗非鱼肠道的枯草芽孢杆菌LT3-1能有效拮抗罗非鱼无乳链球菌,可以作为防治当地罗非鱼无乳链球菌病的良好菌种资源。     

黄河裸裂尻鱼无乳链球菌的分离鉴定与多位点序列分型

2015年10月四川省雅安市某养殖场的黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi Kessler)暴发传染病,临床表现为神经症状,眼球、下颌和鳃盖等出血或无明显临床表现而突然死亡,内脏涂片见革兰氏阳性球菌。从病鱼的肝、脾和肾组织中分离到2株病原菌(ZYW151011,ZYW151012),通过人工感染、无乳链球菌种属特异性cfb基因(GBS-specific gene cfb,CAMP factor)的PCR检测和16S r RNA基因序列分析等方法对病原菌进行鉴定,发现2株病原菌均为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。2株病原菌16S r RNA序列(Gen Bank登录号:KU308396和KU308397)与Gen Bank中无乳链球菌16S r RNA序列同源性达99.8%。药敏试验结果表明,2株病原菌对头孢类和喹诺酮类药物敏感,而对强力霉素、氟苯尼考和阿莫西林等耐药。进一步通过荚膜多糖血清分型和多位点序列分型技术对病原菌进行分子特征分析,结果表明2株病原菌荚膜多糖血清型均为致病性Ia型;2株病原菌多位点序列分型均被鉴定为新的序列型ZST-1,与序列型为ST-261的亲缘关系最近,此新型ZST-1在gln A位点发生变异,提交序列到MLST数据库获得新的等位基因编号81(登录ID:BIGSdb_20151110 081850_13025_35759)。     

吉富罗非鱼家系构建及抗病力检测

文章以吉富罗非鱼（GIFTstrainOreochromisniloticus）为研究对象,按照1雄配1雌原则进行家系配对,待家系鱼生长至50～60g·尾“时人工感染无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）（菌株GD001）。通过对GD001菌株半数致死浓度测定及各家系感染死亡率的统计,研究了GD001无乳链球菌感染对各家系吉富罗非鱼抗病力的影响。结果表明,1）配对成功家系67个,经繁殖性能筛选后留种53个,家系留种率为79．1％;2）GD001菌株的半数致死浓度为4×108cfu·mL－1,感染后2～6d为死亡高峰期;3）GD001菌感染53个家系后有11个家系的成活率在90％以上,15个家系的成活率在70％～89％,19个家系的成活率在30％～69％,8个家系的成活率低于30％,表明不同家系对GD001菌株的抗病力存在着显著的差异（P〈0．05）。