饲料中益生菌对凡纳滨对虾生长、肠道菌群及部分免疫指标的影响

以初体质量为(0.11±0.00)g的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,在室外水泥池进行10周饲喂实验,研究饲料中添加单一益生菌和复合益生菌对凡纳滨对虾生长、消化酶、肠道和粪便菌群及部分免疫指标的影响.以基础饲料为对照组,在基础饲料中分别添加地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、虾乐333(复合益生菌)、地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌(1:1)、虾乐333+地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌(1:1:1)各1 g/kg,配制5种实验饲料.实验结果显示,复合益生菌饲喂组对虾的特定生长率显著高于对照组(P<0.05),而单一益生菌饲喂组与对照组差异不显著(P<0.05).饲料中添加益生菌能使凡纳滨对虾肠道蛋白酶和淀粉酶活力升高,其中复合益生菌饲喂组淀粉酶活力显著高于对照组(P<0.05).与对照组比,饲料中添加益生菌显著降低了肠道及粪便弧菌数(P<0.05),不同程度提高了凡纳滨对虾血清蛋白浓度、酚氧化酶活力、溶菌酶活力和总抗氧化力,其中添加复合益生菌能使血清蛋白浓度及溶菌酶活力较对照组显著提高(P<0.05).上述结果表明,与饲喂单一益生菌相比,复合益生菌对凡纳滨对虾的生长、免疫力具有更好的促进作用.     

养殖水体中添加蜡样芽孢杆菌PC465 对凡纳滨对虾抗病力的影响

将蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)PC465添加到凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖水体中至终浓度分别为10~4、10~5和10~6 CFU/mL,以无益生菌添加的养殖组为对照组,定期检测实验对虾肠道和养殖水体中的细菌总数、弧菌总数以及水体中氨氮含量和亚硝酸氮含量。实验结果表明,水体中添加益生菌能降低凡纳滨对虾肠道内细菌数量,且与对照组相比差异显著(P0.05);高浓度的益生菌处理组可以明显降低养殖水体内弧菌数量(P0.05),但是益生菌并没有显著影响水体中的氨氮含量和亚硝酸氮含量。养殖4周后进行WSSV投喂感染实验,感染实验表明,实验组H组(益生菌浓度为10~6 CFU/mL)和M组(益生菌浓度为10~5 CFU/mL)凡纳滨对虾的累计死亡率分别为63.9%和74.6%,显著低于对照组100%的累计死亡率(P0.05)。感染实验期间采用荧光定量PCR方法测定了凡纳滨对虾3种免疫相关基因的表达情况,统计数据显示,益生菌处理组的脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(lipopolysaccharide-β-1,3-glucan-binding protein,LGBP)、β-1,3-葡聚糖结合蛋白-脂蛋白(beta-1,3-glucan-binding protein-lipoprotein,βGBP-HDL)、热激蛋白70(heat shock proteins,Hsp70)mRNA的表达量在WSSV感染后呈显著上调趋势。实验结果提示,水体中添加蜡样芽孢杆菌PC465可以提高凡纳滨对虾抗WSSV感染能力,其作用机制可能是降低对虾肠道和水体中的细菌和弧菌数量,或调节免疫相关基因的表达水平。     

高通量测序法分析两株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

为分析荚膜红细菌和蜡样芽孢杆菌2株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响,本实验对凡纳滨对虾进行为期30 d的养殖饲喂实验,饲喂后期利用高通量测序凡纳滨对虾肠道微生物的16S rDNA V4区,来分析不同益生菌饲喂后凡纳滨对虾肠道菌群的结构特征,并结合对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的宏观指标来进行分析。结果显示：①空白组（CK）、荚膜红细菌组（Rc）和蜡样芽孢杆菌组（Bc）样品OTU范围为374~506,其中CK组对虾肠道菌群OTU数量最低,饲喂益生菌后的2组对虾肠道菌群中OTU数量相对较高;②在门分类水平上,3组的变形菌门数均为最多,CK组主要为变形菌门和少量拟杆菌门,Bc组主要有变形菌门、拟杆菌门、无壁细菌门、厚壁细菌门和假单胞菌,Rc组主要是变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、放线细菌、梭杆菌门和蓝细菌;③稀释曲线和Shannon指数结果可见,CK组样品物种丰度和复杂度最低,且Bc组样品丰度和复杂度相对较高;④PCA分析发现,Rc组和CK组样品微生物组成较为接近,结合宏观对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的结果分析,可见相较于荚膜红细菌,蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群影响更显著,且益生效果更佳。研究表明,饲喂益生菌可以扩增对虾肠道微生物菌群丰度,并能抑制弧菌属等有害菌群的生长,提高对虾体质量增加率并降低死亡率,从而达到益生效果,其中以饲喂蜡样芽孢杆菌菌株效果更佳。     

几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异免疫力和抗病力的影响

以基础饲料为对照组,在基础饲料中分别添加坚强芽孢杆菌活菌(Bacillus firmus)、坚强芽孢杆菌活菌(1.0×108 CFU/g)+美人鱼发光杆菌(Photobacterium damsela)灭活菌(1％)、坚强芽孢杆菌活菌(1.0×108 CFU/g)+溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)灭活菌(1％)配制3种免疫饲料.每组3个重复,对个体质量为(3.2±0.26)g的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行了为期30d的养殖实验.每5d取样,以血清中的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(UL)活性为免疫指标,探讨了肠道益生菌及其灭活菌体作为免疫制剂对凡纳滨对虾非特异性免疫水平的影响;在投喂免疫饲料后的第16天,按0.9 g/10尾剂量,直接投喂感染白斑综合征病毒(wssV)对虾病料,计算各实验组每天的累计死亡率,分析肠道益生菌及其灭活菌体作为免疫制剂对凡纳滨对虾病毒感染能力的影响.结果显示:添加益生菌的实验组对虾血清中SOD、ACP、AKP和NOS活性明显高于对照组(P＜0.05),特别是显著提高了对虾抗WSSV感染的能力.其中坚强芽孢杆菌活菌(1.0× 108 CFU/g)和美人鱼发光杆菌灭活菌(1％)实验组的抗病毒感染能力最强,感染WSSV 14 d后累计死亡率为10.71％;而对照组为64.28％.结论认为,饲料中添加肠道益生菌及其灭活菌体能提高凡纳滨对虾非特异性免疫水平和抵抗疾病的能力,有望作为新型对虾免疫增强剂应用于对虾养殖业.     

Biolog-ECO方法探究饲喂益生菌对凡纳滨对虾肠道微生物代谢及有效作用时间的影响

以霍氏肠杆菌(E3)和乳酸菌(R3)2株益生菌对凡纳滨对虾进行为期4周的养殖饲喂实验，饲喂后期利用Biolog-ECO方法对实验组及空白组的凡纳滨对虾肠道微生物菌群多样性的差异进行比较分析，以评价益生菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群代谢功能的影响。结果显示，添加霍氏肠杆菌(E3)或乳酸菌(R3)的实验组，与空白组相比较，平均每孔颜色变化率显著上升，表明益生菌增强了肠道微生物活性；凡纳滨对虾肠道微生物利用各类碳源的整体能力显著增强，表明益生菌可以促进水产动物的代谢功能；肠道微生物多样性指数(包括Shannon、Simpson和McIntosh指数)有明显差异，表明饲喂2株益生菌可以提高凡纳滨对虾肠道菌群的丰富度。其中，停喂霍氏肠杆菌后第1天和第5天取样结果表明，Shannon指数显著降低，Simpson和McIntosh指数显著升高；停喂乳酸菌后的第1天和第5天取样结果表明，Shannon指数无显著差异，Simpson和McIntosh指数显著升高；二者在第10天取样的结果中均无显著差异，表明饲料中添加益生菌可以改变凡纳滨对虾肠道内原有菌群的数量和结构，促进对虾肠道内微生物群落间复杂的相互作用，进而在维持或者促进对虾健康方面发挥着重要的作用，同时也表明此两株益生菌在凡纳滨对虾肠道中停留时间最少为5 d。     

健康与患病凡纳滨对虾肠道菌群结构及功能差异研究

为探究病害发生后健康与患病凡纳滨对虾肠道菌群结构和功能的差异,并筛选肠道指示菌群来评估宿主健康状况,评价凡纳滨对虾肠道菌落的功能冗余性。实验采集健康和患病凡纳滨对虾样品,通过Illumina高通量测序技术测定肠道菌群组成,并利用PICRUSt进行功能预测,以此比较健康与患病凡纳滨对虾肠道微生物的群落结构和功能差异,并预测功能与群落组成的相关性。结果显示,病害的发生伴随着肠道菌群结构的显著变化,而多样性无显著差异。与健康凡纳滨对虾肠道细菌组成相比,患病凡纳滨对虾肠道中放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度降低,而γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)增加。同时,筛选出16个指示细菌科,能够很好地指示宿主健康状况。与健康组相比,患病凡纳滨对虾中参与弧菌侵染的过程显著增加,而溶酶体和过氧化物酶等免疫功能代谢过程显著减弱。此外,肠道微生物群落结构与功能组成呈显著正相关,表明凡纳滨对虾肠道菌群组成具有较低的功能冗余性。研究表明,健康与患病凡纳滨对虾肠道菌群结构存在显著差异,并且由细菌介导的功能随之发生改变,能够用指示微生物评估宿主健康状况。     

嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾生长、免疫力和抗病力的影响

水温(29±3)℃下,给体质量约0.5g的凡纳滨对虾投喂在基础饲料中分别添加0%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、1.00%的嗜酸乳杆菌的7种饲料8周。试验结果表明,嗜酸乳杆菌对凡纳滨对虾的存活率无显著影响(P0.05),而添加嗜酸乳杆菌组的凡纳滨对虾体质量增加率均高于对照组,0.10%组的质量增加率显著高于对照组,饲料系数明显低于对照组(P0.05)。0.05%、0.10%、0.20%、0.30%组凡纳滨对虾的血清超氧化物歧化酶活力高于对照组,0.10%组显著高于对照组(P0.05)。各试验组之间过氧化氢酶活力差异显著(P0.05),当嗜酸乳杆菌添加量为0.20%时活力最高。除1.00%添加组外,其他组酚氧化酶活力均高于对照组,当添加量为0.05%时活力明显高于对照组(P0.05)。攻毒试验结果表明,各处理96h对虾存活率无显著差异(P0.05),但嗜酸乳杆菌添加组对虾存活率皆高于对照组,表明添加嗜酸乳杆菌在一定程度上可以提高凡纳滨对虾的抗病力。     

2株消化道优势菌对凡纳滨对虾免疫酶活性和抗白斑综合征病毒感染力的影响

以凡纳滨对虾为研究对象,在基础饲料中分别添加从健康对虾消化道中分离纯化的优势菌菌株——美人鱼发光杆菌PC463和坚强芽孢杆菌PC465(菌含量≥1011CFU/g)的活菌和破碎菌各1 g/kg,观察其对凡纳滨对虾血淋巴免疫酶活性和抗WSSV感染保护率的影响。经过20 d养殖实验后发现,与对照组相比,饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫实验,其凡纳滨对虾血淋巴中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性在不同程度上有所提高,并显著高于对照组(P<0.05)。WSSV感染后饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组存活率(53%±12%)和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫组存活率(49%±15%)显著高于对照组(P<0.05)。结果表明:饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌和美人鱼发光杆菌灭活菌可以在一定程度上提高凡纳滨对虾免疫酶活性和抗WSSV感染能力,上述有防病作用的益生菌株以饲料添加剂的方式应用于对虾养殖生产,可望成为对虾白斑病生物防治的有效途径之一。     

凡纳滨对虾肠道铁载体高产菌株筛选与饲料添加应用效果的研究

本研究筛选了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道铁载体高产菌株,并探究了饲料中添加铁载体高产菌株对凡纳滨对虾的生理功效。结果显示,从凡纳滨对虾肠道中筛选出一株铁载体产量高达74.87%的菌株SDVGH3,经鉴定属于泛菌属(Pantoea sp.),产生的铁载体属于异羟肟酸型,该菌株无溶血性,对大部分抗生素敏感;优化了该菌株铁载体产量的培养条件：最适温度为28℃,pH为7.5,盐度为0,装液量为10 mL,Fe3+浓度为0.01 mmol/L;采用滤纸片扩散法检测了菌株抑制病原菌的特性,显示能抑制5种凡纳滨对虾致病菌。通过在饲料中添加SDVGH3菌液,凡纳滨对虾增重率和饲料利用率明显升高,血细胞数量、吞噬率和血浆酚氧化酶、抗菌活性均有不同程度的升高,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)攻毒后,实验组的死亡率显著低于对照组,1010 CFU/g实验组的死亡率最低,为61.4%;添加107 CFU/g SDVGH3菌液处理组,凡纳滨对虾肠道菌群多样性显著提高,弧菌属(Vibrio sp.)在肠道菌群中所占比例明显下降。研究表明,铁载体高产菌株SDVGH3能明显促进凡纳滨对虾生长、免疫防御能力,增强肠道菌群健康,具有应用于水产养殖中的潜力。     

酵母培养物和芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长、蛋白酶活性和免疫性能的影响

研究了饲料中添加酵母培养物(益康XP)和芽孢杆菌(Bacillus)制剂对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)生长、肌肉成分、蛋白酶活性和免疫功能的影响。在基础饲料(对照组)中分别添加0.075%益康XP、0.100%益康XP、0.200%芽孢杆菌,饲养均重(5.57±0.21)g的凡纳滨对虾45 d。结果表明,添加0.075%益康XP、0.100%益康XP、0.200%芽孢杆菌分别提高凡纳滨对虾增重率17.24%、12.29%、20.18%,降低饲料系数14.28%、9.77%、12.03%,提高蛋白质效率16.49%、10.05%、12.98%(P<0.05);添加酵母培养物和芽孢杆菌对凡纳滨对虾肌肉组成成分没有影响(P>0.05);0.075%益康XP组、0.100%益康XP组、0.200%芽孢杆菌组肝胰脏蛋白酶活性较对照组分别提高25.24%、15.22%、54.92%(P<0.05);各试验组肠蛋白酶活性与对照组相比有所提高,但均未达到显著水平(P>0.05);0.100%益康XP、0.200%芽孢杆菌组凡纳滨对虾血清酚氧化酶活性、溶菌酶活性和超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组(P<0.05);攻毒实验表明,感染溶藻弧菌后,芽孢杆菌组对虾第1、3、4天的累积死亡率均显著低于对照组(P<0.05),第4天时的免疫保护率达到27.1%,而添加益康XP对累积死亡率无显著影响(P>0.05)。综上所述,饲料中添加酵母培养物益康XP和芽孢杆菌均能改善凡纳滨对虾生长性能和消化功能,芽孢杆菌能增强凡纳滨对虾对溶藻弧菌的抗感染功能。