凡纳滨对虾肠道内产消化酶益生菌的分离与筛选

为获得具有消化酶活性且安全的益生菌,从凡纳滨对虾肠道中初步分离得到576株细菌,对菌株进行产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力的定性及定量测试,筛选出产酶种类多且产酶能力强的菌株11株。对筛选出的11株菌进行了幼虾浸浴实验、药敏性实验和溶血性实验,以评价其生物安全性。将11株菌的菌悬液添加到凡纳滨对虾幼虾的养殖水体中进行浸浴实验,浸浴结束后用鳗弧菌进行刺激,测定不同浸浴组幼虾相关免疫基因的相对表达量,以确定其对幼虾的保护效果。综合消化酶活性、菌株对幼虾的保护效果及生物安全性,筛选得到4株效果较好的菌株。菌株的16S r DNA分子鉴定结果表明,细菌1号、2号和4号分别与芽孢杆菌(Bacillus sp.PCSAS2-38,GQ284495.1)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus strain N419,JN400121.1)及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis strain EA26.1,KC758847.1)的相似性均为100%,9号菌株与荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus strain PSB-03,FJ866782.1)相似性达到99%,为后续益生菌制剂的开发奠定了前期基础。     

凡纳滨对虾肠道益生菌的分离· 筛选· 鉴定

[目的]获得具有拮抗常见病原菌活性、消化酶活性且具有安全性的凡纳滨对虾肠道内源性益生菌。[方法]从健康凡纳滨对虾肠道中经过初步分离与纯化得到1 220株细菌,对分离的菌株进行拮抗试验,并对产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力进行定量和定性研究。对筛选的13株细菌进行了溶血试验和药敏试验,以评价其生物安全性。[结果]共筛选出13株抑菌活性强、产酶能力强且产酶种类多的菌株,最终确定了2株候选益生菌。菌株的16 S rDNA分子鉴定及Biolog系统鉴定结果表明,细菌3号与霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei strain WW2,JN993998.1)相似性达到98%,细菌6号与乳酸菌(Lactic acid bacterium ZJGS0109,KC748440.1)相似性达100%。[结论]研究结果为今后益生菌制剂的开发和应用奠定了基础。     

半滑舌鳎溃疡病病原菌的分离、鉴定及其致病性分析

采用2216E和TCBS培养基分别从患溃疡病半滑舌鳎的肠道和体表病灶分离获得菌株40株，经血平板检验分离菌株的溶血活性，体外筛选并鉴定出3株潜在致病性菌株，即哈维氏弧菌、溶藻弧菌以及副溶血性弧菌。通过将3株潜在致病菌与健康半滑舌鳎的肠道上皮细胞共培养，检测病原菌刺激后半滑舌鳎肠道上皮细胞相关免疫基因的相对表达量及共培养后肠道上皮细胞的凋亡率，对病原菌的致病性进行细胞水平的筛选。结果显示，经哈维氏弧菌刺激后肠道上皮细胞白介素10基因(IL-10)表达量极显著上调，说明哈维氏弧菌引起的共培养上皮细胞免疫反应最为剧烈，且哈维氏弧菌与肠道上皮细胞共培养后导致细胞的凋亡率高达48.3%，其次为溶藻弧菌(36%)和副溶血性弧菌(34.5%)，推测哈维氏弧菌为半滑舌鳎溃疡病高致病性弧菌。通过对半滑舌鳎进行浸浴回感实验，结果发现，哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌人工回感后第6天半滑舌鳎的累计死亡率分别为100%、95%和75%，与细胞水平检测结果相吻合。实验表明，所筛选到的3株弧菌均具有较强的毒性和致病性，尤其以哈维氏弧菌致病性最强，并由此推测半滑舌鳎溃疡病可能由多种致病菌共同感染所致。     

枯草芽孢杆菌对氨氮胁迫下半滑舌鳎非特异性免疫酶活性、血液生化指标及相关基因表达量的影响

为探究益生菌对氨氮胁迫下半滑舌鳎的非特异性免疫酶活、血液生化指标及相关基因表达是否具有调节作用,实验首先选用枯草芽孢杆菌Y2益生菌对半滑舌鳎进行饲喂,然后对半滑舌鳎进行氨氮胁迫,胁迫过程中持续饲喂Y2并对相关指标进行监测。其中宏观生长指标结果显示,氨氮胁迫组半滑舌鳎体质量、体长低于非氨氮胁迫组,在氨氮胁迫及非氨氮胁迫条件下Y2组舌鳎体质量、体长高于空白对照组。免疫酶活测定结果显示,氨氮胁迫后半滑舌鳎血清过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶(AKP)活性均有所升高;在氨氮胁迫及非氨氮胁迫条件下饲喂Y2菌株的2组ACP、CAT和POD活性均高于其相应对空白照组。血液相关生化指标结果显示,非氨氮胁迫Y2组半滑舌鳎血清中白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)含量略高于空白对照组,白蛋白与球蛋白比值(A/G)较高,甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)含量差异较小;氨氮胁迫对照组舌鳎血清中ALB、CHO含量下降,GLB含量略有升高,血清中总蛋白(TP)及总脂肪呈下降趋势,且A/G降低,而氨氮胁迫Y2组比空白组舌鳎血清中ALB、TG及CHO含量升高,导致A/G升高。...     

天津市周边地区养殖凡纳滨对虾肠道菌株的分离鉴定及耐药性分析

随着抗生素在水产养殖业中的普遍应用,细菌耐药性成为环境和食品安全的主要问题。本文旨在通过对天津地区养殖凡纳滨对虾体内细菌的耐药信息进行分析统计,为凡纳滨对虾养殖业的疾病控制和提高水产品安全性提供理论指导。本研究对天津市津南区、汉沽区及西青区等对虾养殖基地取样的凡纳滨对虾进行肠道微生物的分离培养,抗生素药敏实验以及抗生素抗性基因的检测。共获得菌株1 219株,选取其中有代表性的215株菌株进行鉴定,结果显示,所鉴定菌株属于56种不同种属,主要以芽孢杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、席罗弧菌、溶藻弧菌、格氏乳球菌、希瓦氏菌、霍氏肠杆菌、库特氏菌、施氏假单胞菌、荚膜红细菌、液化沙雷氏菌、不动杆菌、假单胞菌、假交替单胞菌及霍乱弧菌等为主。所鉴定菌株的抗生素药敏实验分析结果发现,凡纳滨对虾肠道微生物普遍存在抗生素抗性,其中β-内酰胺类的氨苄西林、糖肽类的杆菌肽、喹诺酮类的罗美沙星和磺胺类的磺胺抗药性最为明显。因此本文进一步对其中耐药种类较多且耐药性较强的82株细菌对四大类抗生素(链霉素类、磺胺类、四环素类和青霉素类)的抗性基因(str A-str B,sul II,sul II,sul III,tet A,tet C,tet G,blao XA-1,bla PSE-1,bla TEM)以及整合子(in T1和in T2)携带情况进行检测。研究结果表明,所检测耐药菌株均携带抗性基因,其中磺胺类抗性基因的检出率最高,可达63%,其次是青霉素类抗性基因,检出率为61.4%,整合子基因平均检出率为42.1%,四环素类相对较少为35.4%,且四环素类只检测出tet A抗性基因,其中67.1%的菌株存在多种耐药基因。     

高通量测序法分析两株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

为分析荚膜红细菌和蜡样芽孢杆菌2株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响，本实验对凡纳滨对虾进行为期30 d的养殖饲喂实验，饲喂后期利用高通量测序凡纳滨对虾肠道微生物的16S rDNA V4区，来分析不同益生菌饲喂后凡纳滨对虾肠道菌群的结构特征，并结合对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的宏观指标来进行分析。结果显示：①空白组（CK）、荚膜红细菌组（Rc）和蜡样芽孢杆菌组（Bc）样品OTU范围为374~506，其中CK组对虾肠道菌群OTU数量最低，饲喂益生菌后的2组对虾肠道菌群中OTU数量相对较高；②在门分类水平上，3组的变形菌门数均为最多，CK组主要为变形菌门和少量拟杆菌门，Bc组主要有变形菌门、拟杆菌门、无壁细菌门、厚壁细菌门和假单胞菌，Rc组主要是变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、放线细菌、梭杆菌门和蓝细菌；③稀释曲线和Shannon指数结果可见，CK组样品物种丰度和复杂度最低，且Bc组样品丰度和复杂度相对较高；④PCA分析发现，Rc组和CK组样品微生物组成较为接近，结合宏观对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的结果分析，可见相较于荚膜红细菌，蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群影响更显著，且益生效果更佳。研究表明，饲喂益生菌可以扩增对虾肠道微生物菌群丰度，并能抑制弧菌属等有害菌群的生长，提高对虾体质量增加率并降低死亡率，从而达到益生效果，其中以饲喂蜡样芽孢杆菌菌株效果更佳。     

Biolog-ECO方法探究饲喂益生菌对凡纳滨对虾肠道微生物代谢及有效作用时间的影响

以霍氏肠杆菌(E3)和乳酸菌(R3)2株益生菌对凡纳滨对虾进行为期4周的养殖饲喂实验，饲喂后期利用Biolog-ECO方法对实验组及空白组的凡纳滨对虾肠道微生物菌群多样性的差异进行比较分析，以评价益生菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群代谢功能的影响。结果显示，添加霍氏肠杆菌(E3)或乳酸菌(R3)的实验组，与空白组相比较，平均每孔颜色变化率显著上升，表明益生菌增强了肠道微生物活性；凡纳滨对虾肠道微生物利用各类碳源的整体能力显著增强，表明益生菌可以促进水产动物的代谢功能；肠道微生物多样性指数(包括Shannon、Simpson和McIntosh指数)有明显差异，表明饲喂2株益生菌可以提高凡纳滨对虾肠道菌群的丰富度。其中，停喂霍氏肠杆菌后第1天和第5天取样结果表明，Shannon指数显著降低，Simpson和McIntosh指数显著升高；停喂乳酸菌后的第1天和第5天取样结果表明，Shannon指数无显著差异，Simpson和McIntosh指数显著升高；二者在第10天取样的结果中均无显著差异，表明饲料中添加益生菌可以改变凡纳滨对虾肠道内原有菌群的数量和结构，促进对虾肠道内微生物群落间复杂的相互作用，进而在维持或者促进对虾健康方面发挥着重要的作用，同时也表明此两株益生菌在凡纳滨对虾肠道中停留时间最少为5 d。