养殖澳洲宝石鱼迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及致病基因的检测

从患病澳洲宝石鱼体内分离到一株致病菌(编号Et4),对该菌的生化特性及致病基因进行检测,并进行了药敏和人工感染实验。结果显示:菌株Et4的生化鉴定结果与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)标准菌株(AY77513)一致;其16S rRNA序列,经同源性比对与迟缓爱德华氏菌核苷酸相似度最高,达99%;根据迟缓爱德华氏菌的致病基因Ⅲ型分泌系统装置蛋白esaV基因序列设计引物,进行PCR扩增,得到708 bp序列,该序列与迟缓爱德华氏菌的esaV基因序列相似性达99.3%,说明菌株Et4具有esaV基因。菌株Et4对环丙沙星等较敏感,对其它药物中度或不敏感,具有较强的致病力(LD50=3.74×104CFU/mL),从病鱼中可以重新分离出此菌。综合形态学、生化特性、16S rDNA序列及致病基因序列鉴定其为迟缓爱德华氏菌。     

黄颡鱼暴发性流行病病原的分离鉴定及其3种毒力基因检测

为查明黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)暴发性流行病的病原菌及其3种毒力基因的携带情况,以常规方法进行细菌分离,人工感染试验确定病原菌的致病性,API 20NE和16S rRNA基因序列分析进行细菌鉴定,PCR扩增法检测病原菌的3种毒力基因。结果显示,从发病症状典型的黄颡鱼肝脏中分离到1株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)GXGP1,与嗜水气单胞菌标准株ATCC 7966T的同源性为99.9%,对黄颡鱼有很强致病力,是引起黄颡鱼暴发性流行病的病原菌,该菌携带有Aer、hly和ahp 3种毒力基因。     

抗黄颡鱼“红头病”功能性蛋粉的制备及其应用

为了评价抗爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)的特异性Ig Y的功能性蛋粉在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)"红头病"预防及治疗中的应用效果,采用灭活的爱德华氏菌(菌种保藏号:CCTCCNO:M2012024)免疫蛋鸡,通过微包膜及高速离心喷雾干燥技术制备抗爱德华氏菌的特异性Ig Y的功能性蛋粉,采用泼洒和口服两种方式检测该功能性蛋粉对黄颡鱼的免疫保护率。结果显示,所制备的功能性蛋粉抗体效价达到1∶5120;以剂量为2 mg/L功能性蛋粉连续泼洒水体3 d或以饲料重量0.2%的剂量口服14 d后,再用浓度为2.0×107CFU/m L的致病性爱德华氏菌对健康黄颡鱼进行攻毒,泼洒和口服功能性蛋粉对黄颡鱼的免疫保护率分别为85.5%和70.0%;对人工感染爱德华氏菌后患病的黄颡鱼养殖水体连续泼洒5 d或投喂14 d功能性蛋粉,其对黄颡鱼的免疫保护率分别为67.2%和40.7%,表明制备的功能性蛋粉对黄颡鱼"红头病"有很好的预防和治疗效果。     

泗洪地区克氏原螯虾病原维氏气单胞菌鉴定及致病性分析

为了探究江苏省泗洪县多家养殖场克氏原螯虾(Procambarus clarkii)出现暴发性死亡的病因，本研究以濒死的克氏原螯虾进行病原检测分析，从濒死虾肝胰腺中分离到优势生长菌(菌株编号CPA2020),经对分离菌进行致病性、形态与生理生化特征及gyrB基因同源性与系统发育分析，结果表明引起克氏原螯虾暴发性死亡的病原为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),人工感染实验结果表明分离菌CPA2020对克氏原螯虾具有较强的致病性，LD₅₀为6.31×10⁵ CFU/mL。组织病理学观察发现克氏原螯虾的肝胰腺与肠道组织出现严重的病理损伤，肝细胞裂解，空泡化严重，部分肝细胞坏死，肠壁结缔组织萎缩，皱嵴减少，肠上皮细胞坏死，与自然患病虾的病理变化相同。毒力基因检测表明分离菌CPA2020携带lip、hly、flgN、ompA、flgM、flaH、aha和flgA 8种毒力基因。此外分离菌CPA2020可分泌卵磷脂酶、明胶酶和溶血素。耐药谱测定结果显示，该菌对链霉素、万古霉素、环丙沙星等12种药物耐药，对头孢唑林、克拉霉素等9种药物中介，对...     

黑棘鲷内脏结节病病原的分离、鉴定及致病性研究

2017年4月,浙江台州某海水养殖公司跑道式养殖池黑棘鲷大量发病,病鱼活力下降、食欲减退、体表溃疡,剖检可见肝脏、脾脏、肾脏肿大且有不同程度的白色结节,同时伴随大量腹水。用胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)从典型结节病濒死黑棘鲷器官分离到革兰阴性短杆菌。分离病原菌AS15对健康黑棘鲷的致病力结果显示,AS15腹腔注射可使健康黑棘鲷发病死亡,死亡黑棘鲷可出现自然发病症状,在(24±1)°C的条件下,(25±2) g黑棘鲷的半数致死浓度(LD_(50))为6.5×10~4 CFU/尾。经API 20E鉴定,分离菌株AS15生理生化特性与类杀鱼爱德华氏菌LADL05-105和迟缓爱德华氏菌典型菌ATCC15947相似度为86.2%,与杀鱼爱德华氏菌ET~T883的相似度为82.8%;AS15的16S rDNA与杀鱼爱德华氏菌ET~T883同源性达99%,gyrB与类杀鱼爱德华氏菌LADL05-105和杀鱼爱德华氏菌ETT883同源性分别为100%和98%;16S rDNA进化树显示,AS15与ETT883、LADL05-105聚为一簇,gyrB进化树与LADL05-105、NCIM2056聚为一簇;采用4种爱德华氏菌属种特异性引物对AS15进行PCR分析,结果显示,AS15可扩增出类杀鱼爱德华氏菌的种特异性片段,不能扩增出迟缓爱德华氏菌、鲇鱼爱德华氏菌、杀鱼爱德华氏菌的种特异性片段,表明AS15属类杀鱼爱德华氏菌成员。分析了AS15的菌毛基因、sodB等毒力基因,发现AS15具有fimA、fimB、fimC、fimD等4种菌毛基因和sodB、citC、esrB、mukF、katB等毒力基因。本实验首次从黑棘鲷上检出致病性类杀鱼爱德华氏菌,该菌对黑棘鲷的发病机制和毒力机理还需进一步研究。     

迟钝爱德华氏菌耐药表型及4种耐药基因检测

从7起牙鲆迟钝爱德华氏菌感染病例中分离到130株致病菌,每个病例挑选5株共计35株,用K-B纸片扩散法检测其耐药表型;用PCR方法检测!-内酰胺类TEM基因、氨基糖苷类ant(3")-Ⅰ基因、磺胺类Sul3基因和四环素类tet(A)基因,分析耐药基因与耐药表型间的关系,以查明牙鲆源致病性迟钝爱德华氏菌不同类型常见耐药基因的携带状况,探讨耐药基因与耐药表型之间的相关性。结果显示,所检的35株迟钝爱德华氏菌均携带TEM基因和ant(3")-Ⅰ基因,62.9%(22/35)携带Sul3基因,未检出tet(A)基因;所有菌株均具有多重耐药性,大部分菌株耐抗菌类药物达7~9种;耐药基因的携带与耐药表型间存在较密切的相关性,但并非完全对应。     

黄颡鱼鲇爱德华氏菌的分离鉴定及其致病性研究

从患头顶溃疡症的黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)内脏组织中分离出致病力强的菌株JZ086,对该菌进行了形态学、生理生化特性的测定,并进行了Biolog全自动微生物分析系统及16S rDNA序列鉴定。结果显示:人工感染实验证实该菌为黄颡鱼的病原菌,其半数致死量(LD50)为1.7×105CFU。Biolog全自动微生物分析系统鉴定结果显示该菌为鲇爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)。16S rDNA序列分析显示该菌与鲇爱德华氏菌的亲缘关系最近,同源性高达99%;系统进化树中与鲇爱德华氏菌(AB050826)自然聚为一支,二者遗传距离约为0.002。鉴定结果确认JZ086为鲇爱德华氏菌。药物敏感性试验结果显示,该菌对所测试的15种药物都敏感,其中对氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星、妥布霉素等尤其敏感。     

一株血鹦鹉迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及药敏试验

为确定天津市某养殖场血鹦鹉(Cichlasoma var.)发病死亡的原因,并对其进行有效的预防与治疗,本试验对患病的血鹦鹉进行病原的分离鉴定、回归感染及药敏试验。从病灶处分离出一株疑似病原菌命名为XYW-1,经人工感染后具有致病性,临床症状与自然发病症状一致,半致死浓度为4.75×10 ~5 CFU/mL;经生化鉴定和16S rDNA序列分析,XYW-1为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda);以18种抗生素对迟缓爱德华氏菌进行了药物敏感性测定,结果显示迟缓爱德华氏菌仅对头孢噻肟、头孢吡肟、阿莫西林、氨曲南、多西环素、氟苯尼考、氯霉素7种药物敏感。     

中华鳖爱德华菌病病原菌的分离鉴定及致病因子研究

采用API 20E系列生化鉴定及16S rDNA和gyrB基因序列同源性分析方法,对从患病中华鳖(Trionyx sinen-sis)肝脏中分离到的一株细菌TL5m进行了鉴定,并通过人工感染试验,对该菌株进行了毒力检测;此外分别提取该TL5m株的主要致病因子外膜蛋白、脂多糖和胞外产物,对中华鳖进行毒力和免疫保护率试验。结果显示:菌株TL5m的API 20E鉴定编码为4544000,99.9%为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda);其16SrDNA序列和gyrB基因序列(GenBank登录号分别:EF121756和GU563803)与迟钝爱德华氏菌的同源性最高(分别为94%和98%);菌株TL5m对中华鳖的半数致死量LD50为2.45×106 CFU/ind。药敏感结果显示菌株对磷霉素、菌必治、头孢孟多、头孢噻吩、壮观霉素高度敏感。外膜蛋白攻毒剂量60μg/ind和脂多糖攻毒剂量400μg/ind时,对中华鳖的致死率都为33.3%,胞外产物对中华鳖的LD50为31.73μg/ind;全菌灭活苗、胞外产物、外膜蛋白和脂多糖的免疫保护率分别为75%、62.5%、25%和87.5%。结果表明,发病中华鳖的病原菌为迟钝爱德华氏菌,其分泌的胞外产物对中华鳖具有较高毒力;提取的脂多糖对中华鳖遭受迟钝爱德华氏菌攻击具有较高免疫保护率。     

养殖大菱鲆病原菌迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其疫苗研制

2006年9月山东胶南某养殖场大菱鲆(Scophthalmus maximus)发生病害,从患病大菱鲆脾脏分离出优势菌株WY28,人工感染试验证实WY28菌株对大菱鲆和斑马鱼(Danio rerio)有较强的致病性,其对大菱鲆和斑马鱼的半数致死剂量(LD50)分别为39cfu/g(Bw)(3.3×102cfu/ind)和2.1×104cfu/g(Bw)(6.4×103cfu/ind).综合该菌在形态与生理生化特征及16S rDNA同源性等方面的实验结果,确定WY28菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda).该菌对先锋霉素V、庆大霉素、氟哌酸、痢特灵等抗生素敏感.WY28菌株经福尔马林灭活制成灭活疫苗,对大菱鲆进行腹腔注射免疫,免疫后第4周测得免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价平均为1:1 280.免疫后第6周.免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价达到更高水平(平均值为1:3 289.6).攻毒试验表明,受免鱼的相对存活率明显高于对照组.由此可见,利用从病鱼体内分离的迟缓爱德华氏菌菌株制备的灭活疫苗能使大菱鲆较有效抵御迟缓爱德华氏菌强毒株的攻击.     

二温式聚合酶链反应鉴别诊断迟缓爱德华氏菌病

根据迟缓爱德华氏菌株23S rDNA基因,设计合成一对引物XZE15、XZE16,建立了二温式聚合酶链反应(PER)鉴别诊断迟缓爱德华氏菌株的技术.特异性试验表明,对3株迟钝爱德华氏菌株进行PCR扩增出与预期大小相一致的284 bp的特异性片段,但对3株钻鱼爱德华氏菌及其他对照鱼病病原体核酸模板的PCR扩增不出现任何条带;敏感性试验结果显示,该二温式PCR可以检测到10 Pg的迟钝爱德华氏菌DNA.     

杂交鲟源温和气单胞菌的分离鉴定及生物学特性的研究

为探明引起彭水县某鲟养殖场杂交鲟(Acipenser baerii♀×A.schrencki♂)患病的病原，本研究从患病杂交鲟的腹水中分离出一株细菌(A20)。通过菌落形态观察、革兰氏染色、溶血性实验、生理生化特征、16S rDNA基因和gyrB基因序列分析对菌株A20进行鉴定，同时探究菌株A20的耐受性、毒力基因、半致死浓度和药物敏感性等生物学特性。结果显示：菌株A20鉴定为气单胞菌属(Aeromonas spp.)短杆状革兰氏阴性菌温和气单胞菌(A.sobria);菌株A20生长的最适pH为7,对温度和盐度的耐受力较强；该菌携带hlyA、ompA、alt、aer 4种毒力基因；人工回归感染实验结果表明菌株A20为导致杂交鲟患病的病原菌，LD₅₀为1.37×10⁷ CFU/mL;药敏结果表明，该菌对氟苯尼考、恩诺沙星等15种抗菌药物敏感。     

爱德华氏菌灭活疫苗对黄颡鱼免疫相关基因表达及过氧化氢酶、超氧化歧化酶和补体C3活性的影响

为评价爱德华氏菌灭活疫苗对黄颡鱼的免疫效果,分析了灭活爱德华氏菌疫苗对黄颡鱼非特异性免疫应答相关的免疫基因表达和酶活性的影响。结果显示,黄颡鱼鳃组织中抗菌肽基因和肝组织中长型肽聚糖识别蛋白基因在免疫7、14、21、28d后的表达均显著上调,肠道中抗菌肽基因和脾脏组织中长型肽聚糖识别蛋白基因的表达在免疫7、14、21d亦显著上升。血清中过氧化氢酶、超氧化歧化酶和补体C3活性出现不同程度的提高,其中,黄颡鱼过氧化氢酶活力在免疫14、21d后显著高于对照组,超氧化歧化酶活力在免疫14、21、28d后显著高于对照组,在21d达到峰值,补体C3在免疫7、14、21、28d后均显著上升(P0.05),在免疫7d后血清中补体C3的含量达到高峰。试验结果表明,爱德华氏菌灭活疫苗可显著提高黄颡鱼免疫基因抗菌肽和长型肽聚糖识别蛋白的表达以及酶的活性,进一步揭示爱德华氏菌灭活疫苗可提高黄颡鱼的非特异性免疫能力。     

河川沙塘鳢病原杀鲑气单胞菌致病性及感染后宿主免疫相关基因差异表达分析

为探明2021年3月常熟某养殖场河川沙塘鳢(Odontobutis potamophilus)疾病暴发的原因,本研究从患病鱼体内分离到优势菌株,通过形态观察、理化特性测定及gyrB基因同源性分析鉴定优势菌,同时通过人工感染试验、组织病理观察、毒力因子及毒力基因检测确定其致病性,并测定分离菌的耐药性和感染后河川沙塘鳢免疫相关基因表达变化。结果显示：引起河川沙塘鳢大量死亡的病原菌为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。代表菌株G2-4-1对河川沙塘鳢的LD₅₀为1.8×10⁶ CFU/mL;该病原菌感染可引起河川沙塘鳢肝脏、脾脏、肾脏和鳃组织出现明显的变性、坏死和炎性细胞浸润;该菌株携带aer、hly、exu等毒力基因,且具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明胶酶和溶血素活性,但不具有DNA酶活性;耐药性分析发现,分离菌G2-4-1对青霉素G、氨苄西林、苯唑西林等8种药物耐药,对克拉霉素和大观霉素2种药物中介,对恩诺沙星、氟苯尼考等24类药物敏感;免疫相关基因表达分析显示,在感染初期MHCⅡB、MyD88、TLR和SOD在鳃...     

3种黄颡鱼SOCSs基因分子特性及致病菌胁迫下的表达模式

细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)是JAK/STAT信号通路中细胞因子信号受体的重要抑制因子。为探究SOCS在鱼类免疫应答过程中的作用，本研究以杂交黄颡鱼“黄优1号”及其母本黄颡鱼和父本瓦氏黄颡鱼为研究对象，克隆了杂交黄颡鱼“黄优1号”3个免疫相关基因(SOCS1、SOCS2和SOCS3)，并对其生物信息学进行了比较分析；采用qRT-PCR技术研究了SOCS1、SOCS2和SOCS3基因分别在3种黄颡鱼感染嗜水气单胞菌和鮰爱德华氏菌后的表达模式。结果显示，杂交黄颡鱼“黄优1号”SOCS1、SOCS2和SOCS3基因的全长分别为561、735和672 bp，分别编码186、244和223个氨基酸，其预测的蛋白结构均含有保守的SH2结构域和SOCS盒。黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼“黄优1号”SOCS1、SOCS2和SOCS3基因的表达在被检的8个不同组织中呈现组织特异性。在两种致病菌感染后，杂交黄颡鱼“黄优1号”及其双亲的SOCS1、SOCS2和SOCS3基因在肝、鳃和头肾组织的表达量均在前24 h显著升高，随后逐渐恢复至正常水平。此外，鮰爱德华氏菌感染后，杂交黄颡鱼“黄优1号” SOCS1、SOCS2和SOCS3基因的表达量显著高于双亲，表现出较双亲更强的免疫调节能力且具有病原特异性。该结果为进一步解析黄颡鱼SOCS家族免疫防御调控机制提供了参考依据。     

中国对虾糠虾幼体病原哈氏弧菌的鉴定及毒力基因检测

2011年春季对江苏连云港某对虾育苗场中国对虾Fenneropenaeus chinensis病死糠虾幼体分离到优势生长菌,对分离菌进行致病性、形态与生理生化特征及16S rRNA和gyrB基因同源性与系统发育分析。结果显示,引起糠虾幼体大量死亡的病原为哈氏弧菌Vibrio harveyi,菌株kx1对中国对虾仔虾和日本对虾仔虾的半数致死量LD50分别为2.0×106CFU/ml和7.0×105CFU/ml。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,进行了分离鉴定的4株病原菌对群体效应调节基因(luxR)、毒力调控基因(toxR)、溶血素基因(vhhA和vhhB)、金属蛋白酶基因(vhpA和vhpB)、毒力相关基因(toxS)、鞭毛结构基因(flaA)及锌金属蛋白酶基因(pap6)共9种毒力基因的检测,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA、vhhB和pap6毒力基因,扩增片段大小分别为679、390、1324、216和355 bp,其他4种毒力基因未检测到。分离鉴定的4株病原哈氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈氏弧菌的生物学标记。     

花鲈源杀鱼爱德华菌耐药谱及毒力相关性分析

从广东省珠海市养殖花鲈（基因鉴定出87株杀鱼爱德华菌（）。耐药谱分析显示,杀鱼爱德华菌对利福平（98.85%）、麦迪霉素（96.55%）、红霉素（95.40%）、青霉素（68.96%）、磺胺异恶唑（58.62%）、复方新诺明（28.73%）、阿莫西林（21.83%）、庆大霉素（13.79%）、新霉素（10.34%）、呋喃唑酮（3.45%）、诺氟沙星（2.29%）、氯霉素（2.29%）、多西环素（2.29%）、土霉素（1.15%）、氟苯尼考（1.14%）、恩诺沙星（0%）耐药。杀鱼爱德华菌共有32种耐药谱型且均为多重耐药菌株,多重耐药指数为0.423。斑马鱼致死率结果发现,杀鱼爱德华菌是一株中高毒力菌株;进一步的相关性分析揭示,杀鱼爱德华菌毒力与庆大霉素抗性呈正相关（<0.01）呈负相关。综上所述,花鲈源杀鱼爱德华菌为高毒、多重耐药的菌种,其毒力与耐药性多呈现负相关,推测是由于细菌因获得外源DNA而产生额外的生物成本所致。     

怀头鲇体表溃烂症病原鉴定及致病性分析

为探讨黑龙江流域怀头鲇体表溃烂症的病因及防控措施,本研究采用常规方法从患病鱼的肝脏、脾脏和肾脏等部位分离病原菌,通过人工感染试验确定分离菌株的致病性,并对菌株的基本形态、理化特性、分子特征、毒力基因携带情况及耐药性等进行了系统研究。结果显示,从患病鱼体内分离得到3株病原菌,分别命名为NY-8、NY-9和NY-12;人工感染试验发现,NY-8和NY-9株对试验鱼有较强的致病力,NY-12株毒力较弱;3株细菌混合感染后,鱼体发病症状与临床自然发病症状一致,试验鱼死亡率高达到100%。综合理化特征和16S r RNA基因序列分析结果,确定NY-8、NY-9和NY-12株分别为气单胞菌属的维氏气单胞菌、杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌。5种毒力基因在3株气单胞菌中的分布表现为两种基因型,h l y+/a e r+/a c t+/a l t+/G C A T+和h l y+/a e r-/act+/alt+/GCAT+,同时携带5种毒力基因的NY-8和NY-9分离株致病性显著高于NY-12株。3株细菌在耐药谱上有一定差异性,NY-8和NY-9株均对4种氟喹诺酮类药物敏感,对氨基糖苷类、呋喃类等药物耐药;NY-12株仅对左氧氟沙星和氟苯尼考等2种药物敏感。     

全雄黄颡鱼红头病病原菌的分离鉴定

以患红头病的全雄黄颡鱼为研究对象,从其病灶处分离纯化得到病原菌,通过形态和生理生化特征、16S rRNA基因序列及特异性PCR扩增检测等鉴定,以及药敏性斑马鱼人工感染试验,分析其药敏性和致病性。结果显示,从患病全雄黄颡鱼病灶处分离获得的优势菌株为■爱德华菌;该菌株具有较强的致病性,LD₅₀为2.3×10⁵CFU,感染该菌株的斑马鱼发病症状与自然发病症状相似。药敏试验结果显示,该菌株对青霉素、氯霉素、四环素等28种抗菌药物高度敏感,对红霉素中度敏感,对苯唑西啉、克拉霉素、万古霉素等6种药物耐药。     

加州鲈迟缓爱德华氏菌病的检测和防治

以江苏省吴江市八坼镇区域养殖场加州鲈鱼病鱼的细菌性病原体为研究对象。通过分离纯化,形态学观察,结合16S rRNA基因序列同源性检索,对该病原菌进行初步判断。同时进行药敏实验,了解该病原菌对各种抗生素的耐药性和敏感程度。研究结果:分离纯化得到2株纯菌株L2F和L2P2,革兰染色均呈红色,阴性杆状菌。16S rDNA序列分析,L2F和L2P2菌株与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的同源性达99%。初步判断该菌为迟缓爱德华氏菌。药敏实验结果,该菌对磺胺异恶唑、链霉素和利福平等药物不敏感或耐药,对左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、强力霉素、氟苯尼考、头孢哌酮相对敏感。