2013年广西沿海地区南美白对虾WSSV的流行性调查

为了解广西沿海地区南美白对虾白斑综合症病毒(WSSV)的感染情况,本文采用野外采样和PCR检测方法调查钦州市、钦南区、港口区、防城区、东兴市、北海市、铁山港区和合浦县等8个监测区的南美白对虾WSSV感染情况.2013年共检测南美白对虾样本317份,WSSV总阳性率为19.6%.其中,虾苗和成虾的WSSV阳性率分别为1.5%和32.1%.在8个监测区中,北海市虾苗和成虾WSSV检出率均为最高,分别为5.6%和76.5%.总体上,2013年WSSV在广西沿海地区除铁山港外的南美白对虾养殖区均有不同程度的流行,且成虾平均阳性率高于虾苗.     

黄沙鳖β-防御素基因克隆及其表达分析

[目的]明确β-防御素在黄沙鳖先天免疫中的潜在作用,为开展黄沙鳖绿色病害防治及促进其养殖业健康发展打下基础.[方法]运用RACE克隆黄沙鳖β-防御素基因(Hs-BD1)cDNA序列,采用SignalP-5.0、PredictProtein、PSIPRED、Robetta和Clustal X等在线软件进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测Hs-BD1基因在黄沙鳖不同组织中的表达特征及细菌感染前后的表达变化.[结果]Hs-BD1基因cDNA序列全长493 bp,包括72 bp的5'非编码区(5'-UTR)、201 bp的开放阅读框(ORF)及220 bp的3'非编码区(3'-UTR).Hs-BD1基因编码66个氨基酸残基,包括22个氨基酸残基组成的信号肽区、3个氨基酸残基组成的前肽区和41个氨基酸组成的成熟肽区.其中,成熟肽区具有6个保守的半胱氨酸残基(31Cys、58Cys、38Cys、52Cys、42Cys和59Cys)及位于C1和C2间的甘氨酸残基(Gly),即Hs-BD1基因属于β-防御素家族.Hs-BD1氨基酸序列与中华鳖β-防御素16的相似性最高(93.9%),基于β-防御素序列相似性构建的系统发育进化树也显示黄沙鳖与中华鳖和西部锦龟聚为一支,其亲缘关系相对较近.6个保守的半胱氨酸残基分别以C1-C5、C2-C4和C3-C6的连接方式形成3个二硫键;Hs-BD1成熟蛋白三级结构是由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成.Hs-BD1基因在黄沙鳖肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,在心脏、肠道、肌肉、脑组织和表皮中的相对表达量均较低;以温和气单胞菌攻毒后,Hs-BD1基因在黄沙鳖脾脏中的相对表达量呈上升—下降—上升—下降的变化趋势,在攻毒后第3和36 h共出现2个表达峰值,对应的相对表达量分别是攻毒前(0 h)的20.8和10.6倍,差异均极显著(P<0.01).[结论]Hs-BD1基因在黄沙鳖的多个组织中均有表达,尤其在肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,且可被温和气单胞菌感染诱导表达,说明Hs-BD1基因在黄沙鳖抵抗病原感染的过程中发挥调控作用.     

我国耐喹诺酮类嗜水气单胞菌毒力基因及耐药基因检出情况的系统评价

【目的】了解我国耐喹诺酮类致病性嗜水气单胞菌主要毒力基因及引起耐药基因的突变情况,为致病性嗜水气单胞菌的防治及毒力基因和耐喹诺酮类药物机制的研究提供参考依据。【方法】通过计算机检索中国知网(CNKI)数据库、万方数据库、维普(VIP)中文科技期刊数据库、读秀知识库等,检索时限均从建库至2016年4月,查找收集有关嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药机制研究及其毒力基因、致病机理的相关文献,采用Cochrane协作网发布的RevMan 5.3进行常规Meta分析,以加拿大卫生药品技术总署编写的ITC软件进行间接比较Meta分析。【结果】最终纳入31篇文献,其中有19篇检测了致病菌株的毒力基因,含457株菌株;11篇检测了致病菌株的耐药基因,共101株菌株;8篇检测了耐药菌株的耐药基因突变位点,共88株菌株。我国致病性嗜水气单胞菌毒力基因的检出率为:astA基因91.30%、altA基因80.42%、aerA基因72.77%、hlyA基因66.85%、actA基因62.13%、ahpA基因56.18%、aha/基因53.04%。淮河以北地区主要以hlyA基因为主,检出率(67.31%)显著高于淮河以南地区(P0.05,下同),且高于全国平均检出率;淮河以南地区主要以actA基因为主,检出率(93.59%)显著高于淮河以北地区,也高于全国平均检出率。质粒介导的耐药基因检出率为:qnrB基因50.00%、qepA基因32.00%、qnrS基因27.91%、qnrA基因6.98%、qnrC和qnrD基因未检出。gyrA83位点单突变检出率显著高于gyrA83、parC87双位点突变检出率[OR=0.49,95%CI(0.08,3.09),P=0.008]。【结论】我国致病性嗜水气单胞菌的分子检测方法为:淮河以南地区以毒力基因actA和aerA为致病性强的判断标准,淮河以北地区以毒力基因hlyA和aerA为致病性强的判断标准。目前我国耐喹诺酮类嗜水气单胞菌的基因突变位点主要是gyrA83单位点突变和gyrA83、parC87双位点突变。     

黄颡鱼暴发性流行病病原的分离鉴定及其3种毒力基因检测

为查明黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)暴发性流行病的病原菌及其3种毒力基因的携带情况,以常规方法进行细菌分离,人工感染试验确定病原菌的致病性,API 20NE和16S rRNA基因序列分析进行细菌鉴定,PCR扩增法检测病原菌的3种毒力基因。结果显示,从发病症状典型的黄颡鱼肝脏中分离到1株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)GXGP1,与嗜水气单胞菌标准株ATCC 7966T的同源性为99.9%,对黄颡鱼有很强致病力,是引起黄颡鱼暴发性流行病的病原菌,该菌携带有Aer、hly和ahp 3种毒力基因。     

胡子鲶致病性气单胞菌的分离鉴定及其致病力与毒力基因型相关性

为探讨广西南宁市、浦北县和玉林市暴发性死亡胡子鲶的病原菌及其所携带6种毒力基因对其致病力的影响,用常规方法从病鱼的心脏、肝脏等部位分离细菌,人工感染实验确定病原菌的致病性,以API 20NE生化鉴定和16S r RNA分子鉴定相结合的方法对病原菌进行鉴定,采用PCR扩增法检测病原菌的6种毒力基因携带情况。结果显示,从患病鱼中共分离到5株病原菌,其中嗜水气单胞菌3株,温和气单胞菌2株。3株嗜水气单胞菌与标准菌株Aeromonas hydrophila ATCC 7966(CP000462)的亲缘关系最近,相似性均为99.8%,2株温和气单胞菌与标准菌株Aeromonas sobria NO.106(AB472903.1)的亲缘关系最近,相似性均达99.9%。6种毒力基因在5株病原菌中的阳性检出率分别为Act和Aer基因100%,ahal、hly和Alt基因均为80%,ahp基因仅20%;毒力基因型共3种,在5株气单胞菌中分布情况为Act+ahal+hly+Alt+ahp-Aer+3株,占实验菌株的60%,为主要的毒力基因,Act+ahal+hly+Alt+ahp+Aer+和Act+ahal-hly-Alt-ahp-Aer+各1株,各占20%。携带全部所检6种毒力基因的菌株致病力最强,只携带Act和Aer 2种毒力基因的菌株致病力最弱。ahp基因在菌株的致病力中起重要作用,病原菌的致病力是多种毒力基因协同作用的结果。     

黄沙鳖源嗜水气单胞菌的致病力与毒力基因型相关性

为探明黄沙鳖(Truogx sinensis)源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)所携带毒力基因种类对其致病力的影响,以从广西各地患病黄沙鳖中分离得到的嗜水气单胞菌为材料,通过对黄沙鳖和小鼠进行人工感染测定试验菌株的致病力,PCR检测供试菌株的hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp 6种毒力基因。结果表明,47株黄沙鳖源嗜水气单胞菌共包含9种毒力基因型,48.94%的菌株携带全部6种毒力基因,基因型为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+,是主要的毒力基因型;95.79%的菌株携带hly基因,均为有毒株;嗜水气单胞菌对黄沙鳖的致病力是多个毒力基因共同作用的结果,hly和Act是重要的毒力基因,Alt和ahal基因对菌株的致病力与其他毒力基因之间存在协同作用,ahp基因缺失对菌株的致病力无影响;将对黄沙鳖的致死率达到和超过50%的菌株判定为强毒株,致死率不足50%判定为弱毒株时,强毒株至少携带4种毒力基因,并同时携带有hly和Act基因,弱毒株只携带包括hly在内的2种或3种毒力基因,本研究首次发现只携带Alt和ahal 2种毒力基因的菌株对黄沙鳖和小鼠均无致病力;在所检测的6种毒力基因中,较易缺失的基因主要有Alt、ahal和ahp;在有毒株中,不同基因型的菌株对黄沙鳖和对小鼠的平均致死率差异均为极显著(P0.01),当存在基因缺失现象时,同一基因型的菌株对黄沙鳖的平均致死率也极显著高于对小鼠的致死率(P0.01),表明黄沙鳖源嗜水气单胞菌对黄沙鳖的致病力显著强于对小鼠的致病力。根据本研究结果,可将hly基因作为嗜水气单胞菌有毒株的鉴定标准,携带hly和Act基因并同时携带Aer、Alt、ahal、ahp中的2种或2种以上毒力基因作为强毒株的鉴定标准。     

一例南方大口鲶烂尾病病原阪崎肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

从患烂尾病南方大口鲶的肝脏和心脏中分离到1株优势菌株DKN01,经API 20NE系统鉴定结果为阪崎肠杆菌。2次人工感染试验结果,DKN01对试验鱼的致死率在60%以上,是南方大口鲶烂尾病病原菌。该菌对复达欣、菌必治等8种药物高度敏感,对青霉素G、复方新诺明等7种药物不敏感。     

广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的分离鉴定及其耐药性

为查明副溶血弧菌( Vibrio parahaemolyticus, Vp)对广西凡纳滨对虾( Litopenaeus vannamei )的危害及耐药情况,用常规方法对凡纳滨对虾病样进行细菌分离,API 20NE和16S rRNA对病原菌进行鉴定,K-B纸片扩散法进行药敏试验。结果显示,从160份发病凡纳滨对虾肝胰腺中共分离到67株副溶血弧菌,总检出率为41.88%。67株副溶血弧菌彼此之间高度同源,其相似度达99.2%~100%,与标准副溶血弧菌ATCC17802(GenBank登录号:NR114632.1)相似度为98.8%~100%。67株副溶血弧菌对28种试验抗生素中的氟苯尼考等12种药物表现出很强的敏感性,敏感率均在80%以上;对青霉素G等5种抗生素表现出很强的耐药性。     

山瑞鳖红底板病病原菌的分离鉴定及药敏试验

[目的]了解山瑞鳖红底板病的病原菌及其对药物的敏感性,为生产中有效防治该病提供科学依据.[方法]以常规方法从患红底板病山瑞鳖的肝脏、心脏和腹水中分离病菌,人工感染确定其致病性,以API 20NE生化鉴定与16S rRNA基因序列分析相结合的方法鉴定病原菌,并采用K-B纸片扩散法进行药敏试验.[结果]从患病山瑞鳖的心脏、肝脏和腹水中分离到3株优势菌株,经鉴定均为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),与标准株ATCC 7966的亲缘关系最近,同源性达99.6％.3株病原菌对舒普深、菌必治、多粘菌素B和先锋必等4种药物均高度敏感,而对先锋霉素Ⅵ、青霉素G和氨苄青霉素等3种药物均不敏感.[结论]引起广西南宁市某养鳖场山瑞鳖红底板病的病原菌是嗜水气单胞菌,可选用舒普深、菌必治、多粘菌素B和先锋必等药物进行治疗.放养密度大、水质条件差和相互咬伤是山瑞鳖在保温越冬期间红底板病暴发性流行的诱发因子.     

半滑舌鳎GAPDH基因开放读码框的克隆及序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)广泛存在于真核生物中,对许多生理活动具有重要作用.参考金头鲷和斑马鱼的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因序列设计一对简并引物,提取半滑舌鳎肌肉组织总RNA,采用RT-PCR技术对GAPDH基因进行克隆测序及序列分析.结果表明,从半滑舌鳎肌肉组织中成功克隆了GAPDH基因的开放读码框(ORF),序列全长1002 bp,编码333个氨基酸,分子量为36.0235 ku,等电点PI为7.75.序列同源性分析显示,该序列与其他鱼类的GAPDH氨基酸序列具有较高的同源性.