新型蛋白源在水产动物饲料中的应用研究进展

<正>目前，对传统蛋白源的研究进入瓶颈期，学者们除了保持对传统蛋白源(豆粕、花生粕、棉籽粕等)的纵向研究(传统植物蛋白加工、添加剂补充)外，还进一步利用日益先进的原料生产工艺横向寻找许多新型的蛋白源，并进行研究，其中应用价值高的新型蛋白源主要包括以下几类：(1)藻类蛋白，如小球藻蛋白、螺旋藻蛋白、雨生红球藻蛋白等；(2)昆虫蛋白，如黑水虻蛋白、黄粉虫蛋白等；(3)细菌蛋白，如甲烷菌体蛋白、乙醇梭菌蛋白等。本文综述新型可持续蛋白源的应用研究进展，以期为水产养殖业高质量可持续发展提供支持，以及为未来饲料蛋白质来源的研发提供参考。     

复合动物蛋白饲料（FDD）养鱼效果的研究报告

动物蛋白在养鱼饲料中作为蛋白补充饲料的作用是十分重要的。动物蛋白与植物蛋白比较，不仅动物蛋白的氨基酸组成平衡，生物价高，而且不会有许多植物蛋白中含有的一些有害物质。在以植物蛋白为主的鱼饲料中添加适量的动物蛋白，可以大大提高饲料效率，降低饵料系数，即使是典型的植物食性的鱼类饲料亦是如此。然而，我省地处内陆，动物蛋白资源十分缺乏，     

中国鲎血蓝蛋白提纯及其纯化物的液相色谱串联质谱分析

为了获得高纯度的中国鲎血蓝蛋白并探究其潜在的应用价值，本研究从中国鲎血淋巴中提取了血蓝蛋白并用AKTA蛋白纯化系统进行纯化，使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术对纯化后的血蓝蛋白进行定性分析，最后从uniprot蛋白数据库下载了22条分属5个物种的血蓝蛋白的氨基酸序列并构建了N-J系统进化树。结果表明，制备的血蓝蛋白纯度较高，从纯化后的中国鲎血蓝蛋白中鉴定到了12种血蓝蛋白的亚基，包括Hemocyanin subunit I、Hemocyanin subunit II、Hemocyanin subunit IIIa、Hemocyanin subunit IIIb、Hemocyanin subunit IV、Hemocyanin subunit V、Hemocyanin subunit VI等，uniprot数据库显示，这些亚基最早在圆尾鲎和美洲鲎体内被发现。N-J系统进化树显示中国鲎血蓝蛋白与圆尾鲎和美洲鲎血蓝蛋白具有高度的同源性，并且鲎科动物血蓝蛋白与凡纳滨对虾、锯缘青蟹的血蓝蛋白有较近的进化关系，这意味着可根据虾蟹血蓝蛋白的功能推测中国鲎血蓝蛋白的功能。本研究结果有助于中国鲎血蓝蛋白的功能预测和应用研究。     

藻胆蛋白提取方法研究进展

藻胆蛋白（Phycobiliprotein）是红藻和蓝藻特有的捕光色素蛋白，包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白3类。藻胆蛋白本身为亮丽的天蓝色，在蓝紫光激发下能发出强烈的荧光，它含有人体必需的氨基酸，因此，藻胆蛋白用途极为广泛，既可以作为天然色素应用于食品、化妆品、染料等工业，又可制成荧光试剂，用于临床医学诊断和免疫化学等研究领域中，同时还是一种重要的生理活性物质，可制成保健品及药品等。     

南美白对虾血蓝蛋白对酚氧化酶活性的影响

以采自厦门的南美白对虾(Penaeus vannamei)为研究对象，运用病原菌人工感染、血蓝蛋白浓度和酚氧化酶(phenoloxidase，PO)活性测定等方法探索南美白对虾血蓝蛋白在体内、外对其血清酚氧化酶活性的影响。结果表明，南美白对虾人工感染副溶血弧菌后，其血淋巴中血蓝蛋白浓度和PO活性的变化趋势基本一致。在体外实验中将一定量的血蓝蛋白重组蛋白添加至血清中，其PO活性可明显升高；但同时添加血蓝蛋白重组蛋白和E．coli K12超声破碎液后，其PO活力反而降低。研究提示，血蓝蛋白在一定范围内确实可以正反馈调节PO活性，但在细菌等干扰之下，其又可表现出一定的负反馈抑制活性。     

草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。     

中华绒螯蟹代谢蛋白互作网络构建及分子功能、亚细胞定位和途径分析

为了构建中华绒螯蟹代谢过程研究的系统工具，实验在已经构建的中华绒螯蟹蛋白互作网络的基础上，首先采用邻接节点注释法对未知蛋白的分子功能进行预测。随后采用GO回溯法，构建了代谢蛋白网络并对网络中蛋白分子功能、亚细胞定位和途径分布进行了分析。分子功能注释中，确定了932个蛋白的分子功能，占所有未知分子功能蛋白的97%。最终构建的代谢蛋白互作网络包含2 045个蛋白及这些蛋白之间的15 927条互作关系。网络中94.2%(1 926/2 045)的蛋白具有亚细胞定位信息，大多分布于有膜细胞器中；96.1%的蛋白(1 966/2 045)具有分子功能信息，大多具有催化活性和结合活性。进一步对确定了分子功能和亚细胞定位的蛋白在40个KEGG子系统中的分布进行分析，发现参与翻译和氨基酸代谢过程的蛋白较多，也有一部分参与免疫和运输过程。本实验结果可为中华绒螯蟹代谢相关的蛋白功能、定位的研究提供重要的数据参考，对系统研究中华绒螯蟹代谢过程及代谢相关疾病具有重要价值。     

凡纳滨对虾28.5D血蓝蛋白的降解新片段

血蓝蛋白是一种具有多种非特异性免疫学活性且可以产生免疫学活性降解片段的多功能蛋白。为了探索血蓝蛋白新的降解片段，本研究以凡纳滨对虾旺itopenaeus vannamei）为研究对象，采用比较蛋白质学技术分析对虾感染病原菌后血清蛋白质组的变化。结果发现，对虾感染副溶血弧菌（Hbrio parahaemolyticus）12h后，血清中新增一种28．5kD的蛋白（命名为p28．5）。经MALDI-TOF／MS分析，其与凡纳滨对虾血蓝蛋白75kD亚基具有高度同源性。进一步研究显示，p28．5蛋白不仅可与抗血蓝蛋白抗体发生特异性结合，而且还与对虾抗感染能力呈正相关。由此推测，p28．5蛋白应该是对虾感染病原菌后产生的一种28．5kD血蓝蛋白降解新片段，其可能是血蓝蛋白发挥免疫学功能的一种新方式的产物。[中国水产科学，2008，15（3）：425-430]     

鳗弧菌、溶藻胶弧菌外膜蛋白的分离及特性

分别用SDS、Sarkosyl及PMSF法分离制备鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、溶藻胶弧菌（Vibrio alginolyticus）主要外膜蛋白（MOMP），通过SDS-PAGE分析比较2种弧菌主要外膜蛋白的组成结构。结果表明，SDS、Sarkosyl和PMSF法分离提取的鳗弧菌和溶藻胶弧菌外膜蛋白中，SDS-PAGE电泳图谱不同，鳗弧菌外膜蛋白分子量为27-138kD；溶藻胶弧菌外膜蛋白分子量为27-104kD，其中，45kD、30kD和27kD外膜蛋白为鳗弧菌和溶藻胶弧菌所共有。经比较，Sarkosyl法对2种弧菌外膜蛋白的提取效果较好。对3种方法提取的2种弧菌的主要外膜蛋白进行SDS PAGE后，分别与吸附后的兔抗鳗弧菌、抗溶藻胶弧菌血清的Western-blotting印迹显示，兔抗鳗弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有3条免疫反应带，其分子量分别为97kD、51kD和30kD，说明其可能与鳗弧菌抗原的特异性有关；兔抗溶藻胶弧菌血清与其菌株的外膜蛋白主要有2条免疫反应带，其分子量分别为51kD和27kD，说明可能与溶藻胶弧菌抗原的特异性有关，而51kD外膜蛋白可能是2种弧菌共有的特异性抗原。     

红毛藻中多组分藻胆蛋白及其亚基的分离

采用DEAE-52离子交换柱对红毛藻(Bangia fusco-purpurea Lyngb.)中的藻胆蛋白进行分离，依次洗脱出蓝色、紫色、深红色、红色和浅红色等几种组分的藻胆蛋白；经光谱分析发现蓝色组分为R-藻蓝蛋白，紫色组分为1种三峰型的藻胆蛋白，深红色组分和红色组分为2种不同但又非常相似的藻红蛋白，其中深红色组分可能与某些色素物质结合较为紧密，而最后洗脱出的浅红色组分则为变性的藻红蛋白。尿素洗脱结果表明，蓝色组分的R-藻蓝蛋白是由2种双峰型的亚基构成。本研究旨为揭示藻胆蛋白的能量传递机制提供理论和技术依据。     

关于利用复合氨基酸配合饲料养鱼的效果问题

饲料是养鱼的物质基础，是提高鱼产量的重要因素。但是目前鱼用饲料蛋白源尤其是动物性蛋白源十分缺乏。为此，国内外的饲料研究工作者，都在努力开发新的蛋白源，利用低值无法直接吸收的蛋白质，如毛发、蹄、角、羽等角蛋白的原料，制成复合氨基酸就是其中之一。     

高温胁迫下大黄鱼肝脏的蛋白组学

为探究大黄鱼在高温胁迫条件下的蛋白表达情况，实验应用串联质谱标签tandem mass tag (TMT)标记结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对大黄鱼耐高温组和不耐高温组的肝脏组织进行蛋白组学分析。共鉴定到3 369个蛋白，其中有687个差异表达蛋白，包括281个上调蛋白和406个下调蛋白。用平行反应监测(parallel reaction monitoring, PRM)对随机挑选的13个蛋白进行验证，其结果与TMT标记的蛋白组学分析结果一致。随后，通过生物信息学分析发现，高温胁迫对大黄鱼的蛋白质折叠、能量代谢有显著影响，其中热休克蛋白70 (heat shock proteins 70, HSP70)、钙网蛋白(calreticulin, CRT)和葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein, GRP)参与调节蛋白质的正确折叠，丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)参与高温条件下的能量供给。由此推测HSP70、CRT、GRP和PK在大黄鱼应对高温胁迫时发挥着重要的作用。     

钙离子浓度对日本沼虾感光细胞内可溶性Gq蛋白α亚基含量的影响

研究了钙离子浓度对日本沼虾（Macrobrachium nipponense）感光细胞中可溶性Gq蛋白α亚基含量的影响。以暗适应状态日本沼虾的复眼视网膜为材料，分别用高钙溶液、生理溶液、低钙溶液进行孵育，应用SDS—PAGE及免疫印迹技术对其可溶性蛋白粗提取液进行分离和鉴定，并利用Tanon GIS凝胶图像处理系统对蛋白条带的含量进行分析，结果显示：不同钙离子浓度中孵育的日本沼虾感光细胞蛋白的条带数量和分子量大小基本相同。兔抗Gqcx多克隆抗体在高钙溶液、生理溶液及低钙溶液处理的日本沼虾感光细胞中均识别了可溶性Gq蛋白仅亚基，分子量为42ku，可溶性Gq蛋白α亚基的含量分别是8．6％、8．4％和7．2％。在暗适应条件下，细胞中可溶性Gq蛋白α亚基的含量与钙离子浓度成正比，这表明钙离子浓度的升高可俾刍牛膳结合的Go蛋白α某转化为可溶性的Ga蛋白α亚基。     

不同类型抗菌素对致病性鳗弧菌外膜蛋白表达的影响

摘要：对已分离的1株致病性鳗弧菌W1外膜蛋白图谱进行SDS-PAGE分析，并与8株不同血清型的鳗弧菌外膜蛋白进行比较。结果表明，鳗弧菌W1主要外膜蛋白分别为24kD，38kD，42kD和47kD，主要外膜蛋白图谱与鳗弧菌O1血清型标准菌株VIB1相似。抗生素药敏试验表明该菌对氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶等14种常用药物产生了抗性，只对新生霉素、呋喃妥因、利福平、新霉素等9种药物敏感。研究不同浓度的氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶和庆大霉素对鳗弧菌外膜蛋白表达的影响。结果表明，氨苄青霉素、强力霉素和磺胺嘧啶明显地抑制鳗弧菌42kD的主要外膜蛋白的表达，随着抗菌素浓度的增加，该外膜蛋白的表达量逐渐减少甚至消失，而庆大霉素浓度的变化对其表达没有明显影响。对该42kD主要外膜蛋白进行N末端分析表明，其N末端序列为EAPTAINS，与已发表的细菌其他外膜蛋白序列没有同源性。     

凡纳滨对虾热休克蛋白70的原核高效表达

将凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）热休克蛋白70基因（heat shock protein 70，HSP70）克隆到原核表达载体pET-3c中，经酶切和DNA测序鉴定后，将重组质粒转入表达宿主BL21（DE3），在不同温度、时间下经IPTG诱导表达。收集菌液，进行SDS-PAGE和Western blot检测，并用软件Bandscan分析蛋白表达水平。结果表明，成功构建含凡纳滨对虾HSP70基因的重组表达载体pET-3c／HSP70，表达的目标蛋白相对分子量约为72kD，并能与小鼠抗人HSP70抗体特异性结合。37℃诱导5h目标蛋白表达量最高；但25℃诱导目标蛋白的可溶性比例达80％，目标蛋白占全菌总蛋白70％以上，均较37℃为高。     

饲料中添加酶蛋白对异育银鲫生长和消化吸收的影响

酶蛋白是以高质量的植物蛋白为原料，经过多种产酶、产维生素的菌种协同发酵而成的酶蛋白制剂，含有α－淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、纤维素酶及β－葡聚糖酶、B族维生素、有机酸等。由于我国鱼粉资源匮乏，主要依赖进口，因此为了降低饲料成本，提高养殖业的经济效益，我们用酶蛋白替代部分鱼粉饲喂异育银鲫，研究酶蛋白对异育银鲫的生长效果及消化吸收率的影响，并确定适宜的添加量。一、材料与方法１．酶蛋白及饲料原料酶蛋白（MDS－５０００，汉宝公司）粗蛋白含量５７．８２％，粗脂肪含量５．５４％，总碳水化合物含量１３．２９％…     

蛋白资源——老话题的新讨论

饲用蛋白资源匮乏一直是制约我国饲料工业和畜牧业持续、健康发展的巨大隐患，据估计，目前我国用于饲料生产的蛋白源缺口量已达1500万t，而按我国中远期食物结构发展规划目标，即人均每日摄人的动物性蛋白达到全世界90年代初期水平，则到2010年和2020年我国饲料蛋白的需求量将分别达到6000万t     

谷氨酸生产菌菌体蛋白在对虾饲料中的应用

在对虾配合饲料中用菌体蛋白取代动物蛋白（5%、10%、15%），通过20d的饲养试验显示，对虾生长与菌体蛋白使用量呈正相关。     

豚链球菌和停乳链球菌类M蛋白及其抗原性分析

分别用热酸抽提法、碱抽提法和胃蛋白酶消化法分离豚链球菌NUF849的类M蛋白，通过SDS-PAGE和Western-blotting印迹法分析比较三种方法所提类M蛋白的组成和抗原性差异。结果表明，热酸抽提法分离制备的类M蛋白得率和纯度都较其它两种方法高，蛋白的抗原性保持较好。采用热酸提取法提取5株豚链球菌NUF633、NUF693、 NUF701、 NUF812、 NUF849和2株停乳链球菌SD、L2的类M蛋白，其SDS-PAGE图谱明显不同，种间差异明显, 豚链球菌主要类M蛋白的分子量分别为60、48、37、30、27、24和15kDa，停乳链球菌主要类M蛋白的分子量分别为68、48、42、37、29、26、23、21、19、17、15、14和11kDa。Western-blotting结果显示，兔抗豚链球菌血清可与豚链球菌的两条类M蛋白带结合，分子量分别为60和37kDa；与停乳链球菌的两条类M蛋白带结合，分子量为68和37 kDa。两种链球菌主要类M蛋白组成及其抗原性差异明显。     

渔用昆虫蛋白质资源的开发利用

昆虫蛋白资源非常丰富，是亟待开发的动物性蛋白资源。从4个方面记述了昆虫蛋白资源的优点，并记述了饲用昆虫资源的开发、利用和研究情况，指出了当前存在的问题，提出了合理化建议。