转录组学技术在水产动物研究中的运用

近年来,转录组学技术及其在水产动物中的研究备受研究者的广泛关注.转录组学技术主要有基于杂交技术和测序技术为基础的两大类技术;两类技术在水产动物的转录组学研究中均得到了广泛运用.尤其是二代测序技术的出现使得水产动物的转录组学研究达到了前所未有的热度.本实验综述了近年来水产动物在免疫应答、生长发育、生物进化和毒理学方面的转录组学研究进展.在综述已有成果的基础上,分析了转录组学技术自身存在的局限性和现阶段转录组学在水产动物研究中面临的问题与挑战,并对未来水产动物转录组学研究趋势进行了展望.     

黄喉拟水龟性别调控相关lncRNA和mRNA的筛选及初步分析

性别异形在动物界广泛存在，长期以来一直是生物学中的热门话题。黄喉拟水龟性别分化属温度依赖型，其温度响应分子机制仍不清楚。为了进一步解析龟鳖动物性别分化的分子机制，本研究初步比较分析了黄喉拟水龟转录本中性别差异表达(different expressed, DE)的长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)及其调控的靶基因。首先，运用Illumina深度测序平台，通过转录组测序(RNA-Seqs)对黄喉拟水龟的精巢和卵巢进行了比较转录组学分析并筛选鉴定出雌雄差异转录本，共筛选获得8 237个DE mRNA和9 573个DE lncRNA。通过GO功能注释及 KEGG通路富集分析发现，上述差异转录本主要参与龟鳖动物性别分化和性腺发育等相关信号通路。此外，通过顺式和反式作用分析，筛选获得了一系列与生殖发育相关的(性腺发育和性别分化)受DE lncRNAs调控的靶基因。本研究为进一步阐明黄喉拟水龟温度依赖型性别的分子机制提供了线索，特别是为进一步挖掘利用龟鳖动物性别决定因子，进行龟鳖动物性控育种技术研究奠定了基础。     

牛磺酸对红鳍东方鲀热应激转录调控机制的影响

为探究牛磺酸对红鳍东方鲀的热应激调控的影响，以初始体重为（32.28±0.20）g的红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）作为研究对象，实验随机分为3组，每组设置3个重复，通过在低鱼粉饲料中分别添加3个水平的牛磺酸[0%（T1，对照）、1.0%（T2）和5.0%（T3）]，配制3组实验饲料。养殖56 d后，水温（28±0.3）℃，急性热应激30 min，取肝脏。使用RNA-Seq测序技术对3组红鳍东方鲀肝脏转录组进行分析，并分别对3个转录组测序文库进行两两比较，设置显著差异基因筛选条件为P<0.05，共获得167个差异表达基因，其中上调基因111个，下调基因56个。GO功能分析发现，在T3vsT1组中，差异表达基因（DEGs）显著富集在蛋白质分解过程、丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸水解酶活性、内肽酶活性、L-氨基酸肽的肽酶活性和肽酶活性。KEGG富集分析发现，T2vsT1组中，这些DEGs主要参与细胞黏附分子、神经活性配体-受体相互作用通路；而T3vsT1组中，这些DEGs主要参与神经活性配体受体相互作用和代谢途径。选取3个显著差异表达基因进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证，结果证明，转录组测序分析可靠；饲料中添加牛磺酸后，在急性热胁迫条件下，红鳍东方鲀可通过细胞黏附分子和神经活性配体-受体相互作用通路调控机体对温度的响应；随着牛磺酸添加量的升高，红鳍东方鲀主要通过代谢调节、神经活性配体-受体相互作用通路调控机体对温度的响应。本研究旨为研究牛磺酸对红鳍东方鲀的热应激调控的影响和牛磺酸抗应激功能提供参考数据。     

不同规格黄鳍金枪鱼红肌转录组比较分析

为探究黄鳍金枪鱼(Thunnus albacores)由“变温”型发育为“恒温”型的分子调控过程,基于RNA-Seq技术,对不同发育阶段黄鳍金枪鱼红肌组织RNA进行转录组测序并进行生物信息学分析。结果发现,与“变温”型相比,“恒温”型黄鳍金枪鱼红肌中43个差异表达基因表达量显著上调,79个显著下调。随机选取8个差异表达基因用qRT-PCR方法验证其相对表达量,发现与转录组测序结果相符。通过GO富集分析发现,差异表达基因富集在肌球蛋白复合体、肌动蛋白细胞骨架和横纹肌细丝等与肌肉运动密切相关的GO条目中。通过KEGG富集分析发现,差异表达基因富集在心肌收缩、磷酸戊糖途径和生热等与肌肉运动和能量代谢相关的通路上。结果表明,黄鳍金枪鱼“恒温”发育过程是一个涉及多组织、多基因的复杂过程,能量代谢和肌肉运动在这一过程中可能起到非常重要的作用。研究结果可以为今后深入开展黄鳍金枪鱼发育调控机制研究提供参考。     

lncRNA在水产动物中的研究进展

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类全长超过200个核苷酸的RNA,其转录本缺少开放阅读框和保守密码子,无编码能力。lncRNA能够与RNA、DNA或蛋白质相互作用来介导靶基因的调控,可以在转录水平、转录后水平和表观遗传水平发挥作用。大量研究表明,lncRNA在生殖、胚胎发育、性别分化、免疫和代谢等方面起着关键作用。近年来,关于lncRNA在水产动物上的研究已取得一定成果,但是国内外尚缺乏对其进行全面总结的报道。鉴于此,本文主要对lncRNA的定义及分类、生物学特性、作用机制及在水产动物中的研究进展等方面进行综述,并对其在水产动物中的研究前景进行了展望,以期为以后深入开展lncRNA在水产动物上的功能研究提供参考。     

全同胞家系中生长差异翘嘴鳜肌肉转录组分析

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)是中国重要的经济水产养殖品种,对翘嘴鳜基因表达模式进行研究有助于筛选优势个体,培育生长特性优良的品种。为了解体重明显差异翘嘴鳜个体的差异基因表达信息,为翘嘴鳜培育提供基因指导,本研究从同一家系中挑选体重明显差异的3月龄翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)个体进行肌肉转录组测序,研究不同体型个体间基因表达模式差异。结果显示,来自同一家系的翘嘴鳜个体在相同养殖条件下仍出现明显体重差异,养殖3个月后,极大个体(overweight)平均体重可达到极小个体(underweight)的4倍。分别对极大个体和极小个体的肌肉组织进行转录组测序,共获得73353个非重复序列基因(unigenes),通过基因表达量比较共获得8942个差异基因,对差异表达基因进行定义发现,GHR2、IGFR1、4ebp、Mhc、Mlc、Troponin等基因在极小个体中具有更高的表达水平。通过KEGG通路富集显示,蛋白质生成、蛋白质消化、RNA转运通路富集了大量差异表达基因。本研究发现体重差异明显的翘嘴鳜个体具有不同基因表达模式,转录组测序获得了大量差异表达基因信息,为翘嘴鳜生长研究提供了丰富的基因资源。     

巨须裂腹鱼水霉菌的分离鉴定及其对脾脏转录组的影响

为分析感染水霉菌对巨须裂腹鱼脾脏转录组的影响，探索水霉菌感染巨须裂腹鱼的分子机制，实验随机选取生活在同一水域中的5尾健康和5尾感染水霉菌的巨须裂腹鱼，采用PDA琼脂培养基和分子生物学方法对巨须裂腹鱼水霉菌进行分离鉴定，并采用Illumina HiSeqTM 2000 高通量测序平台，对健康和感染水霉菌的巨须裂腹鱼脾脏组织进行转录组测序，并对测序数据进行拼接、注释和差异表达基因分析。结果显示，从巨须裂腹鱼皮肤上分离鉴定得到3株水霉菌；转录组数据显示，健康组和感染水霉病组分别获得46 619 504 条和43 912 876 条数据，与健康组相比，感染水霉菌组共有1 889 个基因发生差异表达，其中1 414 个基因上调，475 个基因下调，随机选取6个差异表达基因进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)验证，验证结果与转录组测序一致。对健康组和感染水霉菌组的差异表达基因进行GO功能富集发现，上调基因主要富集于241个功能中，下调基因主要富集于60个功能中，上述基因主要涉及分子功能类、细胞组分类和生物过程类等生理功能；KEGG通路富集分析发现，差异表达基因主要富集在免疫疾病、内分泌和代谢疾病、病毒感染性疾病、消化系统及排泄系统等。研究表明，感染水霉菌会影响巨须裂腹鱼脾脏组织多种基因的表达量，实验结果为进一步探索巨须裂腹鱼水霉菌的感染机制奠定了基础。     

织锦巴非蛤不同颜色斧足的转录组

为探索织锦巴非蛤斧足颜色差异的分子机制，以指导高品质织锦巴非蛤的选育工作，本研究对织锦巴非蛤橘黄色和浅白色的斧足进行二代和三代转录组测序及差异表达分析。二代测序结果显示：6个样品的clean data均达到6.90 Gb，GC含量为35.30 - 38.21 %，Q30碱基百分比在94.43 %及以上；三代测序结果显示，橘黄色斧足组和浅白色斧足组分别得到16 968、21 611条高质量转录本，将其与各数据库进行比对，共获得5 058条有注释信息的全长转录本。以三代全长转录本作为参考序列，将二代数据比对回参考序列，鉴定到57个差异表达转录本，其中，橘黄色斧足组相对于浅白色斧足组有34个差异转录本表达量上调，23个差异转录本表达量下调。使用实时荧光定量PCR对随机挑选的12个差异表达转录本进行验证，其结果与转录组分析结果一致。随后，通过生物信息学分析发现，脂肪酸的生物合成和代谢、肌肉成分、能量代谢等都影响织锦巴非蛤斧足颜色的调控，其中过氧化物酶体增值物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs）调节着脂肪酸的生物合成和代谢，肌钙蛋白（Troponin）是肌肉的重要组成成分，精氨酸激酶（arginine kinase, AK）参与了色素富集过程中的能量供应。由此推测PPARs、肌钙蛋白和AK在织锦巴非蛤色素富集过程中发挥着重要作用。     

高温胁迫条件下大菱鲆肾脏转录组研究

为探索大菱鲆(Scophthalmus maximus)耐高温的分子机制，筛选耐高温相关基因，采用高通量测序平台(IlluminaHiSeq-2500)分别对5个不同高温处理组的大菱鲆肾脏组织开展转录组测序，进行生物信息学分析，包括GO(基因功能注释)、SSR(简单重复序列)分析等。结果显示，通过组装得到Unigenes总数目为68525，长度范围为201~23456 bp，平均长度为1124 bp，N50长度为2316 bp。将Unigenes分别在Nr、Swissprot、KEGG、KOG、GO数据库进行序列比对及功能注释，共注释25498条，其中，Nr数据库注释到的Unigenes最多；按GO功能分类，共分为细胞组分、分子功能及生物学过程3类，包括56个功能组，其中，大量Unigenes与细胞进程、代谢过程、催化活性、生物调节、应激反应相关。将Unigenes进行pathway注释，归属于218条代谢通路，分为5类KEGG途径：代谢途径、遗传信息处理、细胞过程、环境信息和生物系统。进行转录因子分析，共检测到65类转录因子，其中，C2H2锌指蛋白家族的基因数目最多。通过对不同温度胁迫下基因表达谱结果进行分析，不同温度组之间存在着显著差异，在不同温度胁迫组中，20℃组与28℃组存在差异最大，差异基因达到4734个，其中，上调基因3386个，下调基因1348个。本研究建立了大菱鲆热应激肾脏转录组数据库，为大菱鲆高温胁迫分子机理研究提供了参考数据。     

刺参响应灿烂弧菌侵染的基因组DNA甲基化水平和转录组差异及其关联分析

为探讨病原菌胁迫下刺参(Apostichopus japonicus)基因组DNA甲基化水平和转录组表达的差异,本研究采用人工攻毒侵染胁迫,获得刺参化皮体壁组织,并以未攻毒组的健康体壁组织为对照,对刺参2种体壁组织进行全基因组甲基化测序(WGBS)和转录组高通量测序,解析刺参体壁基因组DNA甲基化差异,筛选响应病原胁迫的差异甲基化区域和差异表达基因。同时,通过基因组甲基化和转录组联合分析,筛选负相关关联基因,为解析刺参响应灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染的分子机理提供基础数据。结果显示,刺参对照组和侵染组基因组总甲基化水平分别为(3.59±0.04)%和(3.87±0.27)%,侵染组甲基化水平显著升高;在发生甲基化的位点中,攻毒组和对照组的mCpG占比分别为83.06%和81.91%,mCpG为最主要的甲基化形式。本研究共筛选出差异甲基化区域(DMRs) 626 677个,注释到23 706个功能基因。转录组测序共检测到29 290个基因,筛选到差异表达基因496个,其中,上调基因214个,下调基因282个。在基因组甲基化与转录组的关联分析中,筛选到180个负相关关联基因,其中,差异甲基化区域位于启动子区域的负相关基因为60个。对负相关关联基因的GO和KEGG富集分析,筛选到相关通路和LRR、hsp20和CARD等关键基因。本研究将为解析刺参抗病的表观遗传调控机制提供数据,也为刺参抗病性状选育提供科学参考。     

全州禾花鲤鳞片下层组织的结构及全长转录组分析

为研究全州禾花鲤(Cyprinus carpio var. Quanzhounensis)皮肤组织结构和转录组差异、丰富鲤鱼皮肤转录组信息，选用建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)和全州禾花鲤鳞片下层组织，利用透射电镜观察结构差异，发现禾花鲤与建鲤相比组织缺乏层叠排列的鸟嘌呤结晶且黑色素颗粒增多；利用牛津纳米孔(ONT)测序技术分析了转录组特征，获得高质量数据18.49 Gb，识别为全长序列17 182 183条，检测出可变剪接(AS)事件3 075个、可变多聚腺苷酸化(APA) 57 624个，预测新基因编码区序列15 615个、长链非编码RNA (lncRNA) 771个。其中，可变剪接事件中外显子跳跃、内含子保留数量在种间差异极显著(P<0.01)，具有5个多聚腺苷酸化位点的转录本数量在种间差异极显著(P<0.01)，表明可变剪接和多聚腺苷酸化参与性状形成相关的调控过程；共筛选出差异表达转录本841个，KEGG通路分析表明其在细胞外基质–受体相互作用、粘着斑等通路富集，GO分析发现其在细胞外隙、转录因子复合体、整合素复合物等词条显著富集，且最显著富集的KEGG通路和GO词条均与细胞外基质紧密关联，推测这些转录调控的变化可能导致皮肤细胞外基质的组成、密度和构象变化。后续研究应更多关注鸟嘌呤结晶缺失造成的皮肤性状变化，有助于全州禾花鲤种质资源开发与利用。     

“鱼类种质分子鉴定研究”完善了多种鱼类种质鉴定技术

7月19日，由中国水产科学研究院珠江水产研究所副所长白俊杰研究员主持完成的“鱼类种质分子鉴定研究”通过成果鉴定，该项目进一步扩展和完善了多种鱼类的分子鉴定技术。     

十项麦穗鱼人工繁育及养殖技术发明专利获得授权

<正>安徽省郎溪县水产管理站在省农科院水产研究所、宣城市渔业渔政局等专家指导下,自2010年始,历经4年攻克,系统地研究出麦穗鱼人工繁育和养殖技术,实现了规模化繁育,并进行大面积推广养殖。近日,十项麦穗鱼人工繁育及养殖技术发明专利获得授权。麦穗鱼又名罗汉鱼、麻嫩子、混姑鱼,在淡水中广泛分布。该鱼肉质细嫩鲜美、肌间刺少,蛋白质、钙质含量高,以前被人们视为小型野杂鱼未被重视。近年来,随着人民生活水平的提高,饮食消费的多样化,麦     

水产生物微卫星标记技术研究进展及其应用

微卫星标记的发展和利用极大地扩展了DNA分子标记应用的深度和广度,使探索生物性状遗传本质的研究发生了革命性变化。本文简要介绍了微卫星标记技术的发展及其在水产遗传与育种研究中的应用。首先回顾了微卫星克隆技术的发展,尤其是水产生物微卫星标记及技术的发展过程,以及水产生物微卫星序列的主要来源,并对微卫星标记与其他DNA分子标记在使用范围、难易程度等方面做了比较;其次探讨了微卫星标记在遗传连锁图谱的制备、性状分析及QTL定位、群体遗传学、进化遗传、种质鉴定与亲权分析、品种培育等6个研究领域的应用;本文还对几种DNA分子标记在操作上的难易程度、多态性程度、重复性与可比性等方面进行了比较,同时还分别阐述了微卫星和其他DNA分子标记应用于水产生物研究中的适用性,并对微卫星标记的应用前景做了展望。本文旨在为微卫星标记技术在水产生物中的有效应用提供理论依据。     

大弹涂鱼皮肤黏液的抑菌活性和蛋白质组学

皮肤黏液是鱼类免疫防御的第一道防线。大弹涂鱼皮肤黏液对其免疫防御、渗透压维持以及适应水陆生活等方面具有重要意义。为深入了解大弹涂鱼皮肤黏液的蛋白质分子组成,对其皮肤黏液开展了抑菌活性分析和蛋白质组学分析。通过电刺激法收集大弹涂鱼皮肤黏液,采用打孔法比较了皮肤黏液和血清的抑菌活性差异;进一步利用鳗弧菌对大弹涂鱼进行诱导,采用生长曲线抑制法分析和比较了诱导前后皮肤黏液的抑菌活性差异。利用Shotgun质谱技术,结合大弹涂鱼皮肤转录组数据库,对大弹涂鱼皮肤黏液开展了蛋白质组学分析;进一步利用String软件对所鉴定的蛋白质开展了蛋白质相互作用预测。大弹涂鱼皮肤黏液具有广谱抑菌活性,鳗弧菌诱导后的大弹涂鱼皮肤黏液与诱导前相比,对部分革兰氏阴性菌的抑菌活性明显上升,但对其他菌株的抑菌活性差异不明显。从大弹涂鱼皮肤黏液中共鉴定各类蛋白质分子97种,基本分子组成与其他硬骨鱼类皮肤黏液蛋白相似,但也有少数蛋白如泛素蛋白、胸腺素蛋白等未在其他鱼类皮肤黏液中报道。此外,其他鱼类中所鉴定到的部分蛋白如热休克蛋白、抗菌肽等在大弹涂鱼皮肤黏液中未能鉴定到。大弹涂鱼皮肤黏液中已鉴定的蛋白多数具有与免疫功能相关的结构域,且存在一个以肌动蛋白为核心的相互作用网络。大弹涂鱼皮肤黏液具有明显的广谱抑菌活性,其蛋白质组成与其他鱼类皮肤黏液具有一定的相似性。本研究为深入了解大弹涂鱼皮肤黏液的分子多样性及功能机制奠定了基础。     

水产疫苗——鱼类防疫之星

本文概述了国外商品化鱼用疫苗的历史，比较了我国鱼用疫苗存在的差距，反映出我国水产养殖防疫与消除水产品药物残留隐患对水产疫苗的迫切需求，分析了国内外在分子技术应用于水产疫苗的研制和疫苗实用化施用技术等研究的热点问题，提出了我国需加大科技投入、政策引导疫苗应用、提高从业者素质等发展水产疫苗的建议。     

低氧胁迫下中华绒螯蟹血淋巴细胞的转录组学

为了探究低氧胁迫对中华绒螯蟹血淋巴细胞影响的分子机制，实验通过使用Nova Seq 6 000测序技术，检测了低氧组(1.5±0.5) mg/L和对照组(6.0±0.5) mg/L分别处理24 h后的中华绒螯蟹血淋巴细胞的转录组数据变化。首先，对测序得到的原始数据进行拼接、注释以及筛选，分析获得的128 614个转录本和128 614条基因，平均长度为2 634 bp (N50),Q30> 92%。其次，以1.2倍为阈值，共筛选出1 687个差异表达基因，其中上调基因899个，下调基因788个。GO和KEGG分析发现，低氧胁迫对中华绒螯蟹血细胞的三羧酸循环、糖酵解途径、ECM-受体相互作用、间隙连接、细胞凋亡、酚氧化酶系统以及其他免疫相关基因等产生了显著影响。最后，随机挑选转录组数据中的10个基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证，结果显示与转录组数据分析相一致，其中包括6个上调的基因：整合素1、铜/锌超氧化物歧化酶、磷酸肌醇3激酶、磷酸甘油酸突变酶2、PDGF/VEGF相关因子1和relish;4个下调的基因：无脊椎连接蛋白7、热休克蛋白90、线粒体ATP合成酶α和天...     

水产动物分子育种研究进展

本文介绍了水产动物分子生物学尤其是分子标记的发展,比较了共显性标记和显性标记用于水产动物育种研究的优缺点.介绍了开展分子标记育种研究的基础研究--连锁图谱和经济性状QTL定位研究进展.同时还对国内外已开展的标记辅助的家系育种和QTL研究为基础的性状选择育种等研究进行了综述.最后,着重探讨了分子育种理论及作者建立的有关鲤的3种分子标记指导的育种技术.通过分子育种技术具有不同发展阶段的理论分析以及分子育种的实例介绍,旨在加快分子选择手段与常规表型选择的结合,从而推进分子育种技术在中国主要水产养殖动物育种研究中的应用.     

栉孔扇贝在镉污染胁迫下消化盲囊组织的转录组分析

镉(Cd)作为生物非必需、毒性极强的蓄积性重金属,易通过食物链进入人体,严重威胁人类健康。扇贝相对于其他贝类具有特异性蓄积镉的能力,成为水产品安全领域关注的焦点。为了阐释扇贝高蓄积镉的分子机制,本研究以镉胁迫的栉孔扇贝(Chlamys farreri)消化盲囊组织为研究对象,通过转录组测序技术进行基因转录水平分析。通过比较转录组拼接获得105071个unigene和3800个差异基因,对所得unigene进行功能注释,发现这些基因集中在蛋白绑定、细胞黏附、免疫应答、细胞凋亡和能量代谢等方面。对这些蛋白的分子功能进行注释,发现该类蛋白主要属结合蛋白(40.45%)、催化活性蛋白(34.27%)和转运蛋白(5.62%)。这些功能基因和预测通路为理解扇贝体内解毒和免疫系统奠定了基础。获得的转录组数据为深入研究双壳贝类应对海洋污染物的分子机制提供了丰富的基因资源。     

科技

<正>中山脆肉鲩肉质爽脆的原因有了科学定论中山脆肉鲩为什么肉质脆爽?珠江水产研究所谢骏研究员团队找到了答案。日前,他们的研究成果于2017年4月3日在Nature子刊《Scientific Reports》(2016年影响因子为5.228)在线发表。据悉,谢骏研究员团队揭示了广东中山脆肉鲩肌肉品质改良的蛋白质调控分子机制,首次发现脆化草鱼品质改变的肌肉生长模式是肌纤维细胞的快速增殖(Hyperplasia),其中肌纤维增殖后有99个蛋白质表达差异2倍以上;并构建出草鱼肌纤维相关蛋白质的关键调控元件及鱼类肌肉运动调控蛋白质作用模式。其次,团队首次构建了鱼类肌肉蛋白质-蛋白质相互作用网络图谱,该图谱包含了56个蛋白质节点,由肌纤维结构蛋