半滑舌鳎髓样分化因子的克隆和表达分析

髓样分化因子(Myeloid differentiation factor88,MyD88)是Toll/IL-lR家族成员,是TLR信号通路中的一个关键接头分子,在天然免疫系统中具有重要作用。迄今,在重要海水养殖鱼类半滑舌鳎中尚未见有关MyD88的研究报道。本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)MyD88基因,并对其表达模式进行了初步研究。半滑舌鳎MyD88基因的cDNA全长为1612bp,其中包括132bp的5′非翻译区(UTR),590bp的3′UTR和编码285个氨基酸残基的858bp的开放阅读框(ORF)。MyD88蛋白在N端具有死亡结构域(Death Domain,DD),C端具有TIR结构域(Toll/IL-1Receptor Domain,TIR),MyD88基因组全长为2923bp,包括5个外显子和4个内含子。系统进化树分析表明,半滑舌鳎MyD88和牙鲆聚在一起,具有最近的亲缘关系。实时定量PCR结果显示,MyD88基因几乎在所有组织中都有表达,在血液、脾脏、头肾、肝脏等免疫组织和精巢、卵巢生殖腺中具有较高水平的表达。利用LPS(lipopolysaccharide)、PGN(peptidoglycan)和poly I∶C作为免疫刺激源感染半滑舌鳎外周血淋巴细胞的结果显示,三者均可诱导MyD88基因的表达上调。鳗弧菌(Vibrio angaillarum)感染实验表明,注射鳗弧菌96h后MyD88基因在脾脏中表达量升高了近180倍、在肝脏中的表达量升高了60多倍;在注射鳗弧菌48h后,头肾中表达量升高了近5倍。上述实验暗示,MyD88基因在半滑舌鳎天然免疫防御系统中具有重要作用。     

厚壳贻贝MyD88-4基因的生物学特性及其对沙氏弧菌的免疫应答

为理解髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)基因的生物学特性以及对细菌胁迫的响应,本研究克隆了厚壳贻贝MyD88基因(命名为McMyD88-4)cDNA全长序列,其全长3 930 bp,开放阅读框2 607 bp,编码868个氨基酸。其中,13～109位的氨基酸序列为死亡结构域(death domain,DD),347～481位的氨基酸序列为TIR(toll/interleukin-1 receptor)结构域,TIR结构域包含3个高度保守的区域Box 1、Box 2和Box3;McMyD88-4蛋白的空间结构包含6个α螺旋(α-helix)和4个β折叠(β-sheet)。同源性分析显示,McMyD88-4蛋白序列与长牡蛎MyD88最相似,其一致性和相似性分别为60%和77%;其次,与虾夷扇贝、海湾扇贝和菲律宾蛤仔相似度较高,其一致性和相似性分别为40%～51%和58%～67%。系统进化树结果显示,McMyD88-4先与长牡蛎和扇贝聚为一支,然后与黑腹果蝇聚为一支,脊椎动物单独聚为一支。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现,McMyD88-4基因在厚壳贻贝各组织和器官中均有表达,其中在外套膜和鳃中的表达量最高,而血细胞中表达量最低。厚壳贻贝经沙氏弧菌感染后,McMyD88-4基因表达量在免疫相关组织中急剧上升,分别在感染后3和6 h达到峰值,且在消化腺中的上调水平显著高于鳃和外套膜。研究表明,McMyD88-4在厚壳贻贝抵御外界病原体侵染过程中,尤其是弧菌感染方面发挥重要作用。     

欧洲鳗鲡MyD88基因的克隆及其免疫功能分析

髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,My D88)是TLR(toll-like receptor)信号通路的关键接头蛋白,在先天性免疫中发挥重要作用。实验首次克隆了欧洲鳗鲡My D88基因c DNA全长序列,命名为Aa My D88,其全长为1 539 bp,开放阅读框为846 bp,编码282个氨基酸。该蛋白三维丝带空间结构图与人类的My D88十分相似,具有My D88家族典型的死亡结构域和TIR(toll-like/IL-1 receptor)结构域,其中TIR结构域中含有3个序列高度保守的box1、box2和box3。同源性分析显示,欧洲鳗鲡My D88氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为76.3%,与其他鱼类相似性为67.5%~73.2%,与哺乳动物相似性较低,为61.6%~62.6%。欧洲鳗鲡My D88在系统进化树中与其他鱼类My D88聚为一支,哺乳类以及两栖类My D88分别聚为一支。实时荧光定量PCR检测发现,Aa My D88基因在欧洲鳗鲡各组织器官中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,心脏、肠、脾脏以及肾脏中也有较高的表达,而肌肉和鳃中的表达水平较低;欧洲鳗鲡经山羊Ig G肌肉注射后,肾脏Aa My D88基因在第7天表达量有显著性提高,14 d后恢复至正常水平,而脾脏Aa My D88基因表达水平从第7~21天持续显著上调,于第7天达到峰值,其表达量为肾脏的1.7倍;欧洲鳗鲡鳍细胞系经poly I:C处理后,Aa My D88基因表达水平在3 h显著降低,6~48 h均有显著升高,于12 h达到峰值。LPS处理后的欧洲鳗鲡鳍细胞系Aa My D88基因表达水平在3 h显著降低,6和12 h显著升高,于12 h达到峰值,24 h后恢复至正常水平。poly I:C处理组My D88基因表达水平在12~48 h均显著高于LPS处理组。研究表明,My D88在欧洲鳗鲡抵御外源微生物的免疫应答反应中发挥重要作用。     

仿刺参SARM基因的克隆、表达和功能研究

采用RACE方法克隆了仿刺参TLR信号通路MyD88非依赖途径接头分子SARM,命名为AjSARM。AjSARM基因的序列全长3874 bp,开放阅读框为2412 bp,编码803个氨基酸。通过SMART软件对AjSARM蛋白进行蛋白结构预测,发现AjSARM蛋白由2个SAM结构域和1个C端TIR结构域组成。采用实时荧光定量PCR的方法检测AjSARM基因在仿刺参发育不同时期的表达量,发现在小耳幼虫期开始高表达,神经发育也是从这一时期开始的,表明AjSARM蛋白在仿刺参的发育过程中发挥了重要作用。仿刺参体腔细胞经过4种病原菌(灿烂弧菌、假交替单胞菌、希瓦氏菌和蜡样芽孢杆菌)刺激后,在灿烂弧菌、假交替单胞菌和希瓦氏菌刺激组,AjSARM基因在4 h和24 h的表达均受到抑制,然而在蜡样芽孢杆菌组,24 h表达上调。除了希瓦氏菌组外,其他3个组的AjSARM基因在96 h表达量达到最高。AjSARM在应对不同病原菌刺激后不同时间点所表现出的动态表达模式表明,它参与了仿刺参体腔细胞免疫应答的过程。通过对AjSARM的结构以及在不同发育阶段和不同病原菌刺激后的表达模式进行分析,探索仿刺参MyD88非依赖途径接头分子SARM的功能,可以为棘皮动物的发育和免疫系统进化研究提供参考。     

稀有鮈鲫MHCⅡβ基因克隆及鲁氏耶尔森菌感染后的表达分析

为探究稀有鲫MHCⅡβ基因的分子特征及其表达特点,采用PCR扩增技术获得了稀有鲫MHCⅡβ cDNA序列810 bp,包括开放阅读框(ORF)759 bp,编码252个氨基酸。生物信息分析表明,MHCⅡβ氨基酸序列存在4个保守的半胱氨酸残基和GXXGXXXGXXXXXXG结构,与其他亲缘鱼类的一致性为51.78%～80.56%,其编码的蛋白质分子包括1个信号肽、1个MHCⅡβ (β-1)结构域、1个IGc1 (β-2)结构域和1个跨膜螺旋区域。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,MHCⅡβ在脾脏表达量最高,头肾、鳃、皮肤表达量较高。人工感染鲁氏耶尔森菌后,6 h时在头肾表达呈显著上调,肝脏中在12 h开始出现极显著上调,皮肤中在24 h和48 h表达极显著,鳃中在6～24 h表达极显著,脾脏中则是在6 h出现极显著下调,于96 h接近对照组表达水平。初步研究表明,MHCⅡβ在鱼类抵御细菌感染的免疫反应中发挥着重要作用,为进一步揭示稀有鲫MHC家族的功能提供了参考依据。     

马氏珠母贝TLR6基因的克隆、序列分析与表达

为了探究TLR6(Toll like receptor 6)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝TLR6基因(Pm-TLR6)c DNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了Pm-TLR6在马氏珠母贝各组织中的表达情况、哈维氏弧菌刺激后和植核移植后血淋巴中的表达模式。结果显示:Pm-TLR6c DNA全长2295 bp,其中5′非编码区(UTR)长94 bp,3′UTR长89 bp,开放阅读框(ORF)长2112 bp,编码703个氨基酸;多序列比对结果表明物种间TLR6具有较高的保守性;PmTLR6具有跨膜域、富含亮氨酸的重复序列(LRRs)和TIR域,符合TLRs家族特征。q RTPCR数据分析表明,Pm-TLR6在马氏珠母贝肝胰脏、血细胞、鳃、性腺、闭壳肌、外套膜中均有表达,其中肝胰脏中表达量最高;哈维氏弧菌刺激后,Pm-TLR6在2 h表达上调,约为对照组(0 h)的9倍,随后的6 h恢复至正常水平,直至16 h表达水平开始回升并于24 h达到最大表达量,是对照组的29.4倍,具有显著性差异;植核移植实验结果显示PmTLR6在植核后5和10 d表达水平没有显著性变化,15和20 d表达量出现上升趋势,但差异不显著,最后于30 d达到最大值,约为空白对照组(0 d)的5倍,具有显著性差异。研究表明,Pm-TLR6可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。     

仿刺参MyD88依赖途径基因的序列比较和表达分析

为探索仿刺参体内免疫调控机制,对TLR信号通路MyD88依赖途径中Toll、MyD88、IRAK4、TRAF6、P105和Rel的氨基酸序列保守结构域进行了比较分析,找到上下游基因之间可能的互作位点。采用实时荧光定量PCR的方法检测仿刺参体腔细胞中这6个基因在灿烂弧菌刺激后4个时间点的表达模式。试验结果显示,Toll在12 h表达小幅上调,在其他时间点都处于被抑制的状态;MyD88和TRAF6的表达模式基本一致,在12 h表达水平最高;IRAK4在12 h表达上调,在48 h恢复到初始状态;P105和Rel是NFκB的两个同源物,具有相似的结构域,并且这两个基因表达模式一致。通过基因序列和表达模式的对比分析发现,仿刺参体内存在一条高度保守的TLR信号通路。在应对灿烂弧菌入侵时,该通路上的6个基因协同合作参与了机体信号转导和免疫应答的过程。     

中华鳖MHCⅡα基因cDNA的克隆及组织表达分析

为了探究中华鳖(Pelodiscus sinensis)的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)的结构和功能,本研究利用RACE技术成功克隆获得中华鳖MHCⅡα基因的cDNA全长序列,其长度为1296 bp,开放阅读框(ORF)为807 bp,共编码268个氨基酸,分为信号肽序列、Ⅱ类组织相容性抗原α结构域、IGc1结构域及跨膜结构域4个功能结构域。通过NJ法构建的系统进化树分析显示,中华鳖与西部锦龟(Chrysemys picta bellii)亲缘较近,而与哺乳类、鸟类及鱼类亲缘关系较远。荧光定量PCR结果显示,MHCⅡα mRNA在中华鳖8个组织中均有表达,在脾、心、肝及肠组织中表达水平较高,在肌肉组织中表达量最低。感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) 12 h后,中华鳖MHCⅡα mRNA在肝和肠组织中的表达显著上调;感染1 d时,在脾组织中的表达显著上调;感染1 d及5 d时,在肾组织中的表达显著上调。研究表明,中华鳖MHCⅡα基因参与了中华鳖免疫反应。     

鞍带石斑鱼isg15基因cDNA克隆及其在虹彩病毒感染下的表达分析

本研究利用PCR和RACE技术首次获得了鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)干扰素刺激基因15 (interferon stimulated gene 15, isg15)全长序列。isg15基因序列长为910 bp，包含一个468 bp的开放阅读框，可编码155个氨基酸，预测分子量为17.09 kDa，理论等电点为9.33。保守结构域分析显示，鞍带石斑鱼ISG15蛋白包含2个类似泛素结构域，且C末端具有高度保守的“Leu Arg Leu Arg Gly Gly (LRLRGG)”结构域。序列分析和系统发育分析显示，鞍带石斑鱼与斜带石斑鱼(E. coioides) isg15的相似性最高，为88.24%，与大菱鲆(Scophthalmus maximus)和大黄鱼(Larimichthys crocea) isg15的相似性分别为61.18%和60.59%。采用实时荧光定量PCR技术检测了鞍带石斑鱼健康组织中的isg15表达，以及虹彩病毒(iridovirus)感染后不同时间脾脏和肾脏中的isg15表达变化。结果显示，isg15在血液中的表达量最高，在肝脏、肾脏等组织中的表达量较高。经虹彩病毒感染后，isg15在脾脏和肾脏中的表达显著升高，在72 h到达最高水平，说明isg15在鞍带石斑鱼防御虹彩病毒的过程中发挥着重要作用。对鞍带石斑鱼isg15基因的分析和表达模式的研究，有助于进一步了解isg15基因在硬骨鱼体内的抗病毒调控机制，为鞍带石斑鱼抗病分子育种提供基础数据。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道.本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因cDNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp.SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ).经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高.鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12h后表达量达到0h时的13.20倍.使用LPS、PGN、PolyI:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与PolyI:C均下调基因表达.以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用.     

草鱼TLR9基因全长cDNA的克隆及特征分析

采用同源克隆及快速扩增cDNA末端技术,从草鱼鳃组织中克隆了Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)基因的cDNA全长。序列分析表明,草鱼TLR9 cDNA全长3 468 bp,编码1 058个氨基酸,其中包括18个氨基酸组成的信号肽、16个富含亮氨酸重复结构域(leucine rich repeat,LRR)、1个跨膜区和1个TIR结构域(Toll/IL-1 receptor)。该蛋白的分子量为121 921 u,等电点为8.80。氨基酸序列的同源性分析显示,草鱼TLR9与鲤TLR9的同源性最高(85%),依次为斑马鱼(82%)、大西洋鲑(55%)、虹鳟(55%)。在系统发生树上,草鱼TLR9首先与鲤科的鲤和斑马鱼聚类。通过半定量RT-PCR检测可知,草鱼TLR9在被检测的15个组织中都有表达,其中在鳃中的表达最高,其次为血、头肾等。这些结果为进一步深入研究TLR-9的功能及开发草鱼免疫增强剂奠定基础。     

刺参(Apostichopus japonicus)重要经济性状相关SNP标记的验证分析

本研究在前期构建的刺参(Apostichopus japonicus)高密度遗传连锁图谱和QTL分析的基础上，筛选出26个与体长、体重、体宽、棘刺总数、抗病力相关的SNP位点，设计出可用于HRM检测的SNP扩增引物13对。在扩大群体中利用HRM小片段法对这13个刺参重要经济性状相关的候选SNP位点进行分型和多态性检测，并结合扩大群体的相关性状数据进行了QTL位点验证。多态性结果显示，13个位点中有3个单态性位点，其余10个多态性位点中有3个位点为低等位多态性，7个位点为中等位多态性。10个多态性位点的最小等位基因频率(MAF)介于0.016(SNP113)~ 0.332(SNP160)之间，平均值为0.173；各位点的观测杂合度(Ho)介于0.031(SNP113)~0.818(SNP9)之间，平均值为0.433；期望杂合度(He)介于0.031(SNP113)~0.834(SNP9)之间，平均值为0.402；多态信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)~0.393(SNP160)之间，平均为0.248，有6个位点偏离Hardy- Weinberg平衡。QTL验证结果表明，SNP40和SNP160位点为与生长(体长、体重、体宽)相关的位点，各位点的优势基因型分别为SNP40(CC)和SNP160(AA)；SNP88、SNP112和SNP126这3个位点为与抗病力相关的位点，各位点的优势基因型为SNP88(CC)、SNP112(AA)和SNP126(TT)。基于这5个位点构建生长和抗病二倍型，发现二倍型K1(CC AA TT)抗病力最强，S1(CC AA)、S3(CC AC)在生长方面优势显著，相关研究结果可为分子标记辅助育种在生产中应用提供基础数据。     

注射中华绒螯蟹及锯缘青蟹促雄性腺提取物对中华绒螯蟹雌蟹雄性化的影响

该论文首次报道了经由促雄性腺提取物的注射而在蟹类中引起的性逆转现象。此前关于蟹类促雄性腺活性研究的报道极少，而且蟹类的雄性化均是由促雄性腺的移植所产生。本实验中将锯缘青蟹和中华绒螯蟹的促雄性腺提取物分别注射到刚刚完成性别分化的中华绒螯蟹雌性幼蟹体内，此时幼蟹处于4至5期，壳宽为5～8 mm。注射之后，幼蟹经过大约1～2次蜕皮，此时在注射锯缘青蟹以及中华绒螯蟹的促雄性腺提取物的两组实验幼蟹中均能观察到雄性化现象，而注射生理盐水的对照组实验幼蟹中未能观察到相同现象。由此本实验可以证明促雄性腺确实是蟹类的一种雄性激素，注射促雄性腺提取物能引起雌性幼蟹发生性逆转；同时根据锯缘青蟹和中华绒螯蟹的促雄性腺提取物均能引起中华绒螯蟹雌性幼蟹发生性逆转的现象推测，锯缘青蟹和中华绒螯蟹两种间可能存在促雄性腺的交叉活性；不仅如此，性逆转还能在极低的注射剂量下获得，相当于中华绒螯蟹0.14促雄性腺当量和锯缘青蟹0.06促雄性腺当量。     

草鱼miR-23a在嗜水气单胞菌感染过程中的调控机制

为探索嗜水气单胞菌感染后草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)中miR-23a的调控机制,实验通过实时荧光定量PCR(qPCR)测定了嗜水气单胞菌感染CIK细胞后miR-23a的表达量变化,使用RNAhybrid软件预测miR-23a的靶基因并用双萤光素酶报告基因检测系统进...     

长江草鱼群体MHC Class ⅡB的多态性和进化分析

克隆及测序草鱼(Ctenopharyngodon idella)长江3个群体的主要组织相容性复合体(MHC)Class II B基因编码β1和β2区的第2和第3个外显子及两个外显子之间的内含子,分析了草鱼MHC的进化模式和种群遗传结构。结果显示:实验共定义了34个等位基因,每条序列包括长为130~136 bp的第2个外显子,长为218 bp的第3个外显子以及长81~371 bp的内含子。序列分析揭示,第2个外显子有106个核苷酸变异位点(78%)和40个氨基酸变异位点(88%),而第3个外显子有100个核苷酸变异位点(45%)和41个氨基酸变异位点(56%),β1变异要大于β2区。用β1和β2区序列分别构建的邻接(NJ)系统树均显示5个具有高支持率的谱系,结合序列变异特点和内含子长度,推测草鱼至少存在5个MHC Class II座位。分别计算β1的肽结合位点(PBR)、非肽结合位点及β2的非同义替换率(dN)和同义替换率(dS),PBR的dN/dS为2.03(P<0.05),非肽结合位点和β2则小于1,表明草鱼MHC受到歧化选择作用。根据等位基因在群体中的分布频率作分子方差分析(AMOVA),得出FST为0.37%,提示长江草鱼MHC没有遗传分化。     

中华鲟ASDIGIRR与ASTRAF6基因的克隆与表达

中华鲟是处在硬骨鱼类与软骨鱼类之间的中国古老的珍稀鱼类之一,但在人工繁殖和养殖过程中,容易受到不同疾病的危害,因此,需要深入研究其免疫调控,为其疾病预防提供理论依据。单个免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关分子(SIGIRR)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是toll样受体(TLR)信号通路的2个重要的信号转导元件。本研究鉴定了中华鲟的SIGIRR和TRAF6的同源物,分别命名为ASDIGIRR (Acipenser sinensis DIGIRR)和ASTRAF6 (A. sinensis TRAF6),并研究它们在正常组织中的表达和Poly(I:C)诱导后的表达模式。结果显示,ASDIGIRR和ASTRAF6在健康鲟的10个组织中均有表达,且分别在肠道和头肾组织中表达量最高;用Poly (I:C)孵育中华鲟脾脏细胞后,ASDIGIRR在3 h时的表达量显著下调,在6 h时恢复至正常水平,后在24 h显著上调达到最高值,随后开始下调,至48 h时仍显著高于对照组,而ASTRAF6在6 h达到最高表达量,维持到24 h后再下调,48 h时下降至最低水平。研究表明,ASDIGIRR和ASTRAF6在中华鲟抵御病原入侵的免疫防御过程中起着重要作用。