响应面法优化丹参中抗无乳链球菌活性成分的提取工艺

在单因素提取工艺优化的基础上,选取液料比、浸润时间、提取时间和提取温度进行四因素三水平的Box-behnken实验设计,并结合响应面分析法进一步优化丹参中抗无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,SA)活性成分提取工艺。优化所得最佳提取工艺为液料比37.8:1.0(ml:g)、浸润时间104 min、提取温度86.7℃、提取时间182 min。响应面模型预测在该提取工艺下抗SA活性成分提取得率极值为25.95%,经4次平行验证实验的实际提取得率为(25.87±0.03)%,为优化前的2.59倍,表明优化方法高效可靠。     

苦参抗水产病原哈氏弧菌活性物质的提取、鉴定及作用机制

利用单因素实验、Box-Behnken试验设计结合响应面分析法，从提取溶剂（蒸馏水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇）、乙醇浓度（60%～100%）、提取温度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、提取时间（60 min、90 min、120min、150 min、180 min）和液料比等对抑菌活性的影响几方面优化苦参抗水产病原哈氏弧菌（Vibrio harveyi）活性物质（ASSF）的提取工艺；采用高效液相色谱和标准品比对技术，鉴定ASSF的抗菌活性化合物；从对哈氏弧菌的生长、细胞膜的完整性和通透性、细胞壁的通透性等方面探讨ASSF的作用机理。结果表明：ASSF的最佳提取条件是：无水乙醇为溶剂，液料比30∶1 m L/g，提取温度79℃，提取146 min。在此条件下，提取物抑菌圈的实际值为（17.64±0.22）mm，与预测值无显著性差异。固态ASSF的得率为（21.17±0.91）%。鉴定出苦参酮是ASSF中的抗哈氏弧菌活性化合物。ASSF和苦参酮的最小抑菌浓度分别为0.125 mg/m L和0.062 5 mg/m L。ASSF对于哈维氏弧菌的抑制作用主要是通过破坏...     

哈氏弧菌外膜蛋白与溶藻弧菌脂多糖偶联疫苗的效果研究

采用十二烷基肌氨酸钠法提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)SpGY020601株的外膜蛋白(OMPC),采用酚水法提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)EpGS021001株的脂多糖(LPS).通过碳化二亚铵(EDC)介导的缩合反应,将哈氏弧菌的OMPC与溶藻弧菌的LPS偶联.OMPC-LPS偶联物、未偶联的哈氏弧菌OMPC、溶藻弧菌LPS、哈氏弧菌OMPC和溶藻弧菌LPS的简单混合物以及生理盐水按相同程序免疫卵形鲳鲹(Trachinotus cvatus).检测血清溶菌酶活性、血清抗体微量凝集反应结果显示,卵型鲳鲹经OMPC-LPS偶联物、OMPC、LPS以及二者的简单混合物免疫后,各免疫组间血清溶菌酶活性没有显著差异(P＞0.05),但均显著高于生理盐水对照组(P＜0.05);OMPC-LPS偶联物免疫组的血清抗溶藻弧菌EpGS021001抗体效价较单纯溶藻弧菌LPS免疫组、简单混合物免疫组出现得早,抗体滴度高;与此类似,OMPC-LPS偶联组中抗哈氏弧菌SpGY020601的血清抗体效价较单纯哈氏弧菌OMPC组、简单混合组出现得早,抗体滴度高,且持续时间长;对EpGS021001、SpGY020601的攻击,OMPC-LPS偶联物免疫组的保护率分别为85%和95%,高于单纯溶藻弧菌LPS免疫组的70%、单纯哈氏弧菌OMPC免疫组的75%,也高于简单混合物免疫组的80%和82.5%.     

一株短小芽孢杆菌B1的筛选鉴定及其抗菌特性研究

为筛选抗水产弧菌的益生菌株,自西沙海域采集的珊瑚和海水样品共分离到125株细菌,从中筛选出1株无溶血性且对多株病原菌具有拮抗作用的海洋细菌B1。基于生理生化及16SrDNA序列鉴定海洋细菌B1为短小芽孢杆菌。以副溶血弧菌13150为病原指示菌,用琼脂扩散法测定发酵液抑菌活性,并通过卤虫浸泡方式和药敏试验方法检测短小芽孢杆菌B1的安全性,同时进行温度、酸碱度、盐度的发酵条件优化研究。试验结果显示,短小芽孢杆菌B1对副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等有显著的拮抗作用;共培养试验显示,加入等量短小芽孢杆菌B1无菌上清液可显著抑制副溶血弧菌的生长;安全性试验发现,短小芽孢杆菌B1对卤虫的72h半致死密度为108cfu/mL,副溶血弧菌13150的72h半致死密度为105cfu/mL。此外,药敏试验表明,短小芽孢杆菌B1只对20种常规抗生素中的5种产生抗性;优化后的短小芽孢杆菌B1发酵条件为:温度30℃,pH 7.0,NaCl质量分数为2%。研究表明,短小芽孢杆菌B1具有防治水产养殖病原弧菌的应用潜力。     

基于toxR基因病原哈氏弧菌PCR检测方法的建立

基于toxR基因序列设计检测哈氏弧菌的1对特异性引物,通过PCR反应条件优化、PCR反应特异性及敏感性检测,建立一种哈氏弧菌的特异性分子检测方法.试验结果表明,该引物可使哈氏弧菌扩增出大小为390 bp的toxR基因片段,3种水产动物病原弧菌未扩增出任何条带,敏感性检测结果为该PCR反应最低能检测出0.375 ng/μ...     

5种海洋致病弧菌对34种中草药敏感性的测定

采用纸片扩散(K-B)法,测试了溶藻弧菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、麦氏弧菌对34种中草药的敏感性,结果表明:试验菌株对中草药乌梅、黄连、木瓜、五味子、五倍子、马齿苋、白头翁、地榆、公丁香、大黄具有较高的敏感性。采用倍比稀释法,测定10种敏感性较好的中草药对5种海洋致病弧菌的抑菌试验,并测定了最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果表明:五倍子抑菌和杀菌能力最强,五倍子对溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、麦氏弧菌的MIC和MBC均为1.56 mg/ml,对哈氏弧菌的MIC和MBC为3.125 mg/ml;其次是黄连,对溶藻弧菌、河流弧菌、麦氏弧菌的MIC和MBC分别为3.125 mg/ml和6.25 mg/ml,对哈氏弧菌、副溶血弧菌的MIC和MBC分别为6.25 mg/ml和12.5 mg/ml;乌梅对5种弧菌有相同的抑菌和杀菌作用,其MIC和MBC均为12.5 mg/ml。最终确定五倍子和黄连可以作为防治水产养殖动物弧菌病的首选中草药药物。     

海萝中抗紫外辐射物质的提取工艺优化研究

类菌胞素氨基酸(MAAs)是具有抗紫外辐射功能的小分子水溶性活性化合物。为了最大程度提取海萝(Gloiopeltis furcata)中MAAs成分,采用甲醇溶剂超声提取法,通过单因素实验确定超声温度、超声时间、液料比、甲醇体积分数、提取次数的最佳范围,并用响应面法进一步优化提取海萝中MAAs的工艺参数。经Box-Behnken实验设计优化出最佳提取工艺条件为超声温度为41℃,超声时间为81 min,液料比为67 m L·g-1,甲醇体积分数为12%。在此条件下预测MAAs的提取率为1.311 5 mg·g-1,实际提取率为1.306 4 mg·g-1。     

棕点石斑鱼中草药免疫增强剂的快速筛选

采用离体外周血白细胞与中草药水提液共同孵育法,快速筛选棕点石斑鱼中草药免疫增强剂。39种生药量浓度为100 mg/ml 的中草药水提液及添加5.0 mg/ml 酵母聚糖的中草药水提液分别与棕点石斑鱼外周血白细胞孵育后,采用氮蓝四唑(NBT)还原法检测各种中草药水提液对棕点石斑鱼外周血白细胞氧呼吸爆发活性的影响,再以吞噬乳胶微球法检测具有显著增强白细胞氧呼吸爆发活性效果的中草药对棕点石斑鱼白细胞吞噬活性的影响,筛选中草药免疫增强剂,并将其拌料饲喂棕点石斑鱼,考察其对棕点石斑鱼外周血和头肾白细胞氧呼吸爆发活性的影响。结果显示,39种中草药中有10种对棕点石斑鱼离体白细胞氧呼吸爆发活性显著提高15%以上,3种酵母聚糖添加组对白细胞氧呼吸爆发活性提高70%以上;筛选出可同时提高棕点石斑鱼离体白细胞的氧呼吸爆发活性和吞噬活性的 3种中草药,它们分别为鸡血藤、黄柏和墨旱莲。拌料饲喂实验结果显示,饲喂1%的鸡血藤、黄柏和墨旱莲可显著提高棕点石斑鱼体内外周血和头肾白细胞氧呼吸爆发活性。     

哈氏弧菌胞外产物对红鳍东方鲀的致病性

采用平板玻璃纸覆盖技术提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)H-06091菌株的胞外产物(ECP),通过肌肉和腹腔注射2种方式研究其对红鳍东方鲀(Fugu obscurus)的致病性。采用双层纸片法对其主要酶成份进行初步研究;测定其对绵羊红细胞和红鳍东方鲀红细胞的溶血活性;将哈氏弧菌在不同温度下(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)培养36h和25℃下培养不同时间(12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h)后提取其胞外产物并对其蛋白质含量进行测定;经SDS-PAGE分离粗提胞外产物中蛋白成分,并用Dot-ELISA和Western-blot方法对其成分进行分析。实验结果显示,该胞外产物对红鳍东方鲀具有致病性;具有淀粉酶和酪蛋白酶活性,不具有卵磷脂酶、脂肪酶和明胶酶活性;对红鳍东方鲀红细胞有溶血活性,对绵羊红细胞无溶血活性;胞外产物蛋白质总含量在35℃培养36h后出现高值,与温度变化无明显相关性;25℃下培养24h、36h和48h的粗提胞外产物经SDS-PAGE分离,有3条蛋白质条带最明显,分子量分别约为31kD、38kD、60kD;其中分子量约为60kD蛋白条带,经Dot-ELISA和Western-blot方法证实其为半胱氨酸蛋白酶-1。根据以上结果认为哈氏弧菌H-06091菌株胞外产物含有多种毒力因子,与该菌的致病性密切相关。     

基于核酸适配体的PCR法检测溶藻弧菌及其灭活菌

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)分布广,数量多,发病率高,是水产养殖中常见的条件致病菌,而对溶藻弧菌进行快速准确的识别鉴定是其病害防治的前提和基础。核酸适配体,因为具有较高的亲和特异性,在微生物的识别鉴定方面展现出了巨大的优势。本文利用核酸适配体和适配体筛选产物,通过结合、洗涤、加热分离、PCR扩增以及电泳检测等步骤,对溶藻弧菌进行了检测鉴定。结果表明,适配体和筛选产物都能对溶藻弧菌及其灭活菌进行较好的识别鉴定,适配体筛选产物对溶藻弧菌的检测下限为10~3cfu/mL,而对其灭活菌的检测下限为10~2cfu/mL,适配体对溶藻弧菌及其灭活菌的检测下限都可达到10 cfu/mL。该方法对溶藻弧菌有较好的亲和特异性,并能较好地区分溶藻弧菌与哈维氏弧菌等水产常见病原菌,在水产病害的检测中显示了较好的应用前景。     

海洋酶法利用海产品下脚料制取活性胶原肽的研究

以富含胶原成分的海产品下脚料为原料,经脱除杂蛋白、脂肪后,用海洋碱性蛋白酶水解,以Feton法检测水解产物的羟自由基清除率,提取具有抗氧化活性的胶原肽。通过温度T(℃),pH值,酶料比([E]∶[S]),料水比([S]∶[W]),时间(min)单因素实验,选取合理水平,做L18(37)正交实验,最终优化得到最佳提取条件为:温度45℃、酶料比1∶150、pH8·0、料水比1∶4、反应30min,所得胶原肽的羟自由基清除率为60·42%。与同浓度Vc、谷胱甘肽(GSH)相比,均具有较高的抗氧化活性,有着良好的开发应用前景。     

哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条的制备

用18~20nm胶体金标记抗哈维氏弧菌Vibrio harveyi抗体并制备金标垫,分别将羊抗兔Ig G和纯化后的抗哈维氏弧菌抗体包被于NC膜上作为质控线和检测线,组装制作了哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条,优化了该试纸条的制作条件,测试了其性能。结果表明:所制备的哈维氏弧菌免疫层析试纸条具有较好的特异性,与费尼斯弧菌Vibrio furnissii、维氏气单胞菌Aeromonas veronii、美人鱼发光杆菌Photobacterium damselae、类志贺邻单胞菌Plesiomonas Shigelloides、鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri、鳗利斯顿氏菌Listonella anguillarum、迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、海豚链球菌Streptococcus iniae、嗜水气单胞菌Aeromonas Hydrophila等9种常见水产病原菌无明显交叉反应,检测灵敏度为3×105CFU/m L,5~10min即可得出检测结果,具有快速、简便、特异性强和适应基层推广应用等优点,可用于养殖鱼类病原哈维氏弧菌的现场检测。     

微波辅助碱法提取匙吻鲟软骨蛋白-多糖复合物的工艺

以匙吻鲟软骨为材料,利用微波辅助稀碱法提取软骨中的蛋白-多糖复合物,在对碱浓度、微波功率、微波时间和液料比进行单因素试验的基础上设计正交试验,优化提取条件。结果表明,在液料比为15∶1(V/W),碱浓度为0.9%,微波功率为360 W,微波处理为9 min时,得率达到最优值15.72%。与常规碱法提取相比,微波辅助提取不仅降低了碱用量,更加环保,而且缩短了提取时间,提高了得率。     

基于响应面法分析乌梅和抗生素对哈维氏弧菌的协同抑制作用

为了给哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)疾病防治新手段的开发提供基础实验数据,筛选了协同抗哈维氏弧菌的乌梅(Fructus mume)水提液与抗生素复合物。首先绘制药物浓度对数对抑菌圈直径标准曲线,采用全组合法筛选与乌梅水提液具有协同抗菌活性的抗生素,然后采用中心组合设计法(CCD)结合响应面法(RSM)分析乌梅水提液与筛出抗生素复合后两两药物间的交互作用,并确定最佳复合配比。全组合法筛出的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素分别与乌梅水提液具有协同抗菌作用,RSM分析显示将这4种药物复合后,乌梅水提液与土霉素对哈维氏弧菌存在显著协同抗菌作用;土霉素分别与金霉素和强力霉素存在交互抑制作用;乌梅水提液、土霉素、金霉素和强力霉素最佳复合配比为45∶0.12∶0.00∶0.00 (mg·mL~(–1))。模型预测最优复合物对哈维氏弧菌的抑菌圈直径为18.54 mm,琼脂扩散法平行3次测得该复合物的抑菌圈直径为(19.03±0.07) mm,相对误差为2.6%,表明该方法结果可靠,为考察药物间的交互作用提供了新思路。     

中草药免疫增强剂在甲壳动物病害防控中的应用

中草药免疫增强剂具有来源广泛、价格低廉、环境污染较低等优越性,近年来已较多地应用于甲壳类养殖动物的病害防控,产生了较好的效果.本文介绍了中草药免疫增强剂多糖、甙类、生物碱类、有机酸及挥发性油类等免疫活性成分和作用机理,以及在甲壳动物上的应用.总结和分析了中草药免疫增强剂在甲壳动物病害防控中的应用情况、评价指标及目前在研制和应用中存在的主要问题和发展趋势,以期为甲壳动物免疫增强剂的研究和应用提供参考.     

半滑舌鳎溃疡病病原菌的分离、鉴定及其致病性分析

采用2216E和TCBS培养基分别从患溃疡病半滑舌鳎的肠道和体表病灶分离获得菌株40株,经血平板检验分离菌株的溶血活性,体外筛选并鉴定出3株潜在致病性菌株,即哈维氏弧菌、溶藻弧菌以及副溶血性弧菌。通过将3株潜在致病菌与健康半滑舌鳎的肠道上皮细胞共培养,检测病原菌刺激后半滑舌鳎肠道上皮细胞相关免疫基因的相对表达量及共培养后肠道上皮细胞的凋亡率,对病原菌的致病性进行细胞水平的筛选。结果显示,经哈维氏弧菌刺激后肠道上皮细胞白介素10基因(IL-10)表达量极显著上调,说明哈维氏弧菌引起的共培养上皮细胞免疫反应最为剧烈,且哈维氏弧菌与肠道上皮细胞共培养后导致细胞的凋亡率高达48.3%,其次为溶藻弧菌(36%)和副溶血性弧菌(34.5%),推测哈维氏弧菌为半滑舌鳎溃疡病高致病性弧菌。通过对半滑舌鳎进行浸浴回感实验,结果发现,哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌人工回感后第6天半滑舌鳎的累计死亡率分别为100%、95%和75%,与细胞水平检测结果相吻合。实验表明,所筛选到的3株弧菌均具有较强的毒性和致病性,尤其以哈维氏弧菌致病性最强,并由此推测半滑舌鳎溃疡病可能由多种致病菌共同感染所致。     

响应面法优化长茎葡萄蕨藻多糖提取工艺及抗氧化活性

为了探究提取长茎葡萄蕨藻多糖的最优工艺及抗氧化活性，对目前已有的多糖提取方法进行筛选，并采用单因素实验和响应面实验的方法，对料液比、提取温度、提取时间、木瓜蛋白酶添加量和提取次数这5个因素进行优化。结果显示，添加木瓜蛋白酶提取长茎葡萄蕨藻多糖的方法最高效便捷，且当料液比1∶40，提取温度50 ℃，提取时间3 h，提取次数2次，以及木瓜蛋白酶添加量为2.0% 时，长茎葡萄蕨藻多糖提取率相对较高，可达到41.24%±0.09%。进一步的实验结果显示，长茎葡萄蕨藻多糖对DPPH和ABTS自由基均具有良好的清除活性，其IC₅₀值分别为2.32和0.67 mg/mL。研究表明，使用优化后的木瓜蛋白酶酶解法能有效提高长茎葡萄蕨藻多糖的提取率，且长茎葡萄蕨藻多糖具有良好的抗氧化活性。本研究可为长茎葡萄蕨藻多糖的开发利用提供理论基础和参考依据。     

带鱼肠道中芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵液抗菌性质研究

从带鱼肠道中分离筛选到1株具有广谱抗菌活性的菌株JFL15,其发酵液对嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、查氏弧菌均有较强抑菌作用。通过形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系统发育进化分析,菌株JFL15与暹罗芽孢杆菌的同源性最高,达98.05%,初步鉴定为暹罗芽孢杆菌。对暹罗芽孢杆菌JFL15的发酵液进行研究发现,暹罗芽孢杆菌JFL15的发酵液对酶、温度、酸碱度和紫外线均不敏感,且发酵产物储存较长时间后仍具有较强抑菌活性。     

中草药对海水养殖黄鱼病原弧菌抑菌效果研究

采用K-B纸片法、试管法和平皿法,分别测定17种中草药水提取液的单味及其配伍组方对大黄鱼病原体哈氏弧菌的最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）。试验结果表明,试验用药中乌梅、五味子、黄连、石榴皮等4种单味药抑菌杀菌效果明显,其中尤以乌梅抑（杀）菌能力最强,即MIC、MBC均为1.95 g/L;配伍组方不如单味最强药物抑菌作用明显,配伍用甘草能增强其他配伍中草药抑菌活性。     

蜈蚣藻多糖提取工艺优化

以蜈蚣藻粗多糖产率为指标,比较分析了水提、碱提、酶解法及微波辅助提取等提取粗多糖的方法;以蜈蚣藻多糖得率为指标,研究了浸提温度、提取时间及料液比这三个因素对多糖得率的影响,并在单因素实验的基础之上,选取各因素的较优区域,进行三因素三水平的正交试验,确定了蜈蚣藻多糖提取工艺的最优组合.结果表明:热水浸提法提取蜈蚣藻多糖的产率最高,达到55.64％,且其最佳工艺为温度100℃、时间5h、料液比1∶60,按此工艺提取的蜈蚣藻多糖的得率为59.42％.