凡纳滨对虾C型凝集素（LvLc1）的特征和活性分析

C型凝集素是一种依赖于Ca~(2+)而发挥功能的糖蛋白,在一线的固有免疫防御过程中发挥着重要作用。围绕对虾C型凝集素开展深入研究,不仅可以丰富无脊椎动物固有免疫学内容,还有望将其开发为具有免疫增强效果的活性饵料,应用于对虾的健康养殖。本实验根据实验室前期转录组信息提示克隆获得了凡纳滨对虾一种新的C型凝集素基因(LvLc1,Gen Bank注册号:KY937940)。生物信息学分析显示LvLc1基因的开放阅读框全长891 bp,编码296个氨基酸,该基因编码的蛋白质含有一个保守的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD),该结构域中具有潜在的半乳糖结合位点(QPD motif),进化发生分析显示LvLc1与来自节肢动物的甘露糖结合凝集素家族成员聚类在一起。对LvLc1基因的CRD结构域进行了原核重组表达与蛋白活性分析研究,结果显示:重组目的蛋白(rLvLc1)在Ca~(2+)存在的条件下,对多种病原菌(G~+、G~–和真菌)具有凝集作用,其凝集活性可被半乳糖、甘露糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制。研究表明,LvLc1作为C-型凝集素家族一个新成员,可能通过重要的模式识别受体作用,参与机体应答病原微生物侵染的防御过程。     

中国明对虾serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的重组表达及活性分析

Serpin家族成员作为主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性来调节蛋白酶级联反应,进而参与了包括血液凝结、补体激活、纤维蛋白溶解、炎症反应、肿瘤抑制和激素转运等大量的基本生物过程,在调节机体免疫及其它重要生理功能方面发挥着重要作用。我们在前期研究中,从中国明对虾血细胞中克隆得到一个serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（Fc-serpin, GenBank注册号：DQ318857）,初步研究显示它在转录水平参与了病原菌和白斑杆状病毒（WSSV）引发的对虾先天免疫应答反应;本研究利用原核重组表达系统,成功获得了重组的对虾serpin型蛋白酶抑制剂（rFc-serpin）,纯化复性后得率为0.3g/L;活性分析显示,重组目的蛋白（rFc-serpin）对多种病原菌的生长均有一定抑制作用,研究结果进一步证实它参与病原微生物引发的对虾防御应答过程,为探讨甲壳动物先天免疫防御应答机制提供了有价值的参考。     

凡纳滨对虾C-型凝集素基因原核表达与免疫作用的研究

本文利用原核表达系统对凡纳滨对虾C-型凝集素基因的开放阅读框进行了重组表达,并通过纯化分离获得重组目的蛋白,采用血细胞悬浮培养的方法,研究了重组C-型凝集素对凡纳滨对虾血细胞免疫作用的影响。实验梯度设置为：对照组和重组C-型凝集素蛋白（1.0 mg/mL）,分别在0、3、6、9、12、24h取培养的血细胞和培养液进行免疫相关指标的测定。结果表明：重组C-型凝集素经SDS-PAGE分析显示在39KD处有显著诱导条带,与预测的分子量大小基本一致,Western blot分析可以与anti-His抗体特异性结合,从而证明C-型凝集素重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。重组C-型凝集素对大肠杆菌具有明显的凝集作用,对凡纳滨对虾血细胞数量、存活率和吞噬率影响显著（P<0.05）;培养基酚氧化酶活力在培养3-12h内呈峰值变化,于9h时达到最大值（P<0.05）。研究表明,C-型凝集素不仅具有凝集作用,而且还能激活酚氧化酶原系统,具有重要的免疫防御作用。     

三疣梭子蟹C-型凝集素的原核表达和活性检测

通过RT-PCR扩增三疣梭子蟹C-型凝集素（C-type lectin like-domain protein,CTLD）基因序列,将目的基因克隆入质粒pET32a,构建原核表达重组质粒pET32a-CTLD.将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导CTLD的表达,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot 检测.用His GraviTrap Ni亲和层析柱及超滤离心管纯化目的蛋白,并对其进行活性检验.结果表明,构建得到CTLD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;诱导表达出相对分子质量（M） 39 600的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,融合蛋白成功表达;重组C-型凝集素对兔的红细胞没有明显的凝集作用,但对小鼠红细胞的凝集效价是22,而对所选5种细菌的凝集作用存在差异,其中对大肠杆菌具有明显的凝集作用,而对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和金黄色葡萄球菌均无凝集现象.本研究结果为进一步研究C-型凝集素在免疫防御中的作用与地位提供依据.     

中国对虾血细胞凝集素的性能研究↑（*）

对中国对虾(Penaeuschinensis)的血细胞凝集素部分性能的研究结果表明,中国对虾的血淋巴中存在可凝集多种脊椎动物血细胞的因子—血细胞凝集素,凝集活力的大小同中国对虾的健康状况有密切关系,发病对虾体内的凝集素活力明显下降。该凝集素具有较强的热稳定性,100℃处理20min仍具活性;并且具有广泛的pH作用范围,可在pH3～11产生凝集作用;适当增加盐度(18～36)可以提高该凝集素的凝集活性;其活性还会被EDTA强烈抑制;但对Ca2 、Mg2 、Mn2 等离子和多种糖类不敏感。在中国对虾血细胞的细胞膜上未发现有凝集鸡红细胞的活性物质。     

环境胁迫对大菱鲆C-型凝集素功能的影响

大菱鲆C-型凝集素(SmLec1)是一种重要的免疫因子,本实验通过分析其活性特点以及环境胁迫对其表达调控的影响,探讨其在大菱鲆先天免疫应答过程中的潜在功能以及养殖环境中的应用。实验利用原核表达系统进行重组表达,并通过纯化获得19 ku重组目的蛋白;活性分析结果显示,SmLec1对所选6种细菌的凝集作用存在差异,其中对鳗弧菌和爱德华氏菌具有明显的凝集作用;在选取的8种糖类中,木糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘露糖能够抑制SmLec1的凝集活性;在理化因子(pH、温度)中,pH7和温度37°C时对SmLec1的凝集活性产生抑制;鳗弧菌感染实验显示,感染6 h时肝组织的SmLec1表达量明显上升,在12 h时达到最高值,随后有所下降;温度胁迫时肝组织的SmLec1 m RNA表达量受到温度的影响显著,在19°C开始升高,22~27°C呈降低趋势,其他组织变化不显著。盐度胁迫对SmLec1在各盐度的表达量变化不显著。研究表明,SmLec1能够抑制鳗弧菌的感染,其表达受到温度的影响,本研究为进一步明确SmLec1蛋白的抗菌机理和探索对大菱鲆疾病的免疫学防治途径提供科学依据。     

一种凡纳滨对虾新的C型凝集素基因（LvLc2）的克隆及免疫应答特征

为有效地进行凡纳滨对虾病害防治和健康养殖,探究对虾天然免疫机制,为其免疫防控提供新思路,实验根据本课题组前期转录组结果提示,在凡纳滨对虾血细胞中克隆获得了一个新的C型凝集素基因(LvLc2, GenBank登录号KR020738)。生物信息学分析显示,LvLc2的ORF区全长465 bp,编码154个氨基酸(aa),5′-UTR为11 bp,3′-UTR为126 bp;其预测的分子量为17.16 ku,理论等电点为4.54;推断其氨基端含有一个由17个aa组成的信号肽序列,羧基端含有一个保守的糖识别结构域(CRD)。该基因在凡纳滨对虾各种组织中有不同程度的表达,其中在肠道中表达量最高,其次为胃、肝胰腺、血细胞等组织或细胞,在肌肉中表达量最低。利用脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)刺激对虾后,比较分析了LvLc2的表达变化特征,不同类型的病原表面多糖可在刺激后不同时期引发LvLc2基因的应答改变,表明其具有潜在的广谱应答模式,同时针对不同病原又具有不同的表达特征,显示了其识别结合和间接免疫效应的差异。对其作用特征的探讨有助于更好地了解对虾C型凝集素在病原感染过程中的功能和作用机制。研究结果为深入探讨对虾天然免疫调控机制提供了参考,在对虾健康养殖及病害防治方面具有潜在的应用价值。     

基于不同纯化策略的4种对虾血蓝蛋白的凝集活性及分子基础对比分析

既往研究表明,对虾血蓝蛋白(hemocyanin, HMC)是一种具有抗病毒、抗菌等多种免疫学活性的免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)分子,但迄今为止,其功能多样性的分子基础尚不是很清楚。本研究以凡纳滨对虾HMC为研究对象,采用亲和层析、凝集素层析技术获得4种HMC成分:A-HMCs、A-HMCl、AL-HMCs和AL-HMCl,发现其对不同细菌的凝集活性存在较大差异。其中,AL-HMCs和AL-HMCl对大肠杆菌和副溶血弧菌的凝集活性明显强于A-HMCs和A-HMCl,前者约为后者的2～32倍。继而,通过双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和凝集素印迹技术对不同HMC的蛋白质组成和糖基化修饰水平进行对比分析。结果显示,4种HMC在2-DE图谱上表现为6～7个差异明显的蛋白质点,且与伴刀豆凝集素(concanavalin A, ConA)、花生凝集素(peanut agglutinin, PNA)、荆豆凝集素(ulex europaeus agglutinin, UEA)和双花扁豆凝集素(dolichos bifows agglutinin, DBA)等4种凝集素的识别存在显著性差异。其中,A-HMCl 6个蛋白点均可识别4种凝集素,而A-HMCs 6个蛋白点中仅有4、3个点分别与UEA、DBA反应呈阳性,AL-HMCs和AL-HMCl可以与UEA、PNA特异性显色的点分别为其总蛋白点的3/7、2/6。由此推测,对虾血蓝蛋白功能多样性的分子基础可能与其蛋白质组成和糖基化修饰水平的多样性密切相关。     

菲律宾蛤仔二种I型溶菌酶的重组表达和抑菌活性

为研究病原微生物刺激后，菲律宾蛤仔I型溶菌酶的免疫应答反应，实验采用重组表达技术，从菲律宾蛤仔中得到2种I型溶菌酶的重组蛋白rVpILYZ-1和rVpILYZ-2，发现其均具有较为广谱的抑菌活性；其中，rVpILYZ-1对副溶血弧菌、灿烂弧菌和藤黄微球菌等具较强的抑菌活性，而rVpILYZ-2对副溶血弧菌抑菌活性较强，且二者均通过非酶抑菌活性和胞壁酸酶活性来发挥抑菌作用。结果显示，rVpILYZ-1最适pH和温度分别为6.5和20 ℃，而rVpILYZ-2最适pH和温度则分别为4.5和10 ℃。此外，rVpILYZ-1和rVpILYZ-2均具免疫调理活性，能够促进血细胞对病原菌的吞噬作用。研究表明，VpILYZ-1和VpILYZ-2在菲律宾蛤仔清除病原微生物的免疫应答反应中发挥重要作用。     

鱼类C-型凝集素结构特征及其免疫功能

正凝集素是一类不具有酶催化活性的蛋白或糖蛋白,能特异性地识别并结合微生物表面的糖蛋白或糖基复合物而启动先天免疫反应[1-3]。根据糖的结合特性和钙离子依赖性,鱼类凝集素可分为C-型凝集素、F-型凝集素、半乳糖凝集素和鼠李糖结合凝集素等[4]。其中C-型凝集素在鱼体感染致病微生物的过程中发挥重要的免疫功能[2,5]。各种类型的C-型凝集素在诸多鱼类中已被发现[6-25],如斑马     

中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal)的重组表达及活性分析

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过精确调控丝氨酸蛋白酶的活力,在生物体的防御应答等众多生物过程中发挥重要作用。以前期克隆的中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal, GenBank注册号为DQ318856)为基础,对其功能结构域进行序列比对和进化分析;组织表达分析结果表明,该基因在血细胞、鳃和淋巴器官等组织中高水平表达,而在眼柄、神经和肌肉中无表达;利用原核表达系统对该基因成熟肽区域成功进行了重组表达,纯化后的目的蛋白最终得率为0.4 g/L培养液;活性分析结果显示,复性后的rFc-Kazal对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、杀鲑气单胞菌、苏云金芽孢杆菌有明显的抑菌作用。     

中国明对虾眼柄微结构与其生长的关系

观察了采集于江苏南通近海的69只中国明对虾的眼柄微结构，分析了其体长和体质量的生长。结果显示，眼柄由表层、色素层、钙化层和膜层4个部分组成。眼柄内存在明显的生长宽带和细纹，其中宽带数0~1个，细纹数27~37个。最小AIC法拟合分析显示，中国明对虾体长、体质量的生长与眼柄细纹数都呈显著的Logistic关系。研究表明，中国明对虾眼柄中的宽带与其年龄相关，细纹可用来分析中国明对虾的生长，而细纹的形成周期是否与个体差异、生长环境差异等相关还需要进一步验证。     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。     

Immune responses of whiteleg shrimp,Litopenaeus vannamei (Boone, 1931), to bacterially expressed dsRNA specific to VP28 gene of white spot syndrome virus

In this study, dsRNA specific to VP28 gene of white spot syndrome virus (WSSV) of shrimp was synthesized in Escherichia coli in large scale and studied the immune response of shrimp to dsRNA‐VP28. The haematological parameters such as clotting time and total haemocytes counts, and immunological parameters such as prophenoloxidase (proPO), superoxide dismutase (SOD), superoxide anion (SOA) and malondialdehyde content, as well as the mRNA expression of ten immune‐related genes were examined to estimate the effect of dsRNA‐VP28 on the innate immunity of Litopenaeus vannamei. The activities of proPO, SOA and SOD significantly increased in haemocyte after dsRNA‐VP28 treatment, whereas MDA content did not change significantly. Among the ten immune‐related genes examined, only the mRNA expression of proPO, cMnSOD, haemocyanin, crustin, BGBP, lipopolysaccharides (LPs), lectin and lysozyme in haemocytes, gill and hepatopancreas of L. vannamei, was significantly upregulated at 12 h after dsRNA‐VP28 treatment, while no significant expression changes were observed in Toll receptor and tumour receptor genes. The increase of proPO and SOD activities, and SOA level and mRNA expression level of proPO, cMnSOD, haemocyanin, crustin, BGBP, LPs, lectin and lysozyme after dsRNA‐VP28 stimulation indicate that these immune‐related genes were involved in dsRNA‐VP28‐induced innate immunity in shrimp.     

鱼类microRNA在先天免疫中的研究进展

先天免疫是宿主识别病原及消除病原感染的第一道防线。模式识别受体是参与识别病原入侵的主要分子，主要包括Toll样受体、RIG-I样受体、NOD样受体和C型凝集素受体等。模式识别受体在识别病原相关分子模式后，激活机体的先天免疫信号通路，诱导炎症细胞因子和干扰素的产生，从而启动抵抗病原入侵的免疫应答。越来越多的证据表明，免疫应答的激活、维持和终止受到了严格的调节，使机体在保持一定免疫强度的同时避免产生过度的免疫反应。microRNA是一类长度为18～23 nt的微小非编码RNA，是鱼类先天免疫应答网络中的重要调控因子。近年来，microRNA在鱼类免疫学领域已开展了大量的研究，但缺乏对其进行及时地全面性的总结。本文综述了近年来miRNA在鱼类先天免疫反应中的研究进展，以期为鱼类的分子抗病育种及疾病防控研究提供一些思路。     

The role of Toll‐like Receptors in innate immunity and infectious diseases of teleost

The immune defence mechanism depends mainly on germ‐line encoded pattern‐recognition receptors (PRRs). These PRRs respond to many exogenous pathogens and/or endogenous serious signals, by recognizing some highly conserved structures such as pathogen‐associated molecular patterns (PAMPs) and danger/damage associated molecular patterns (DAMPs). Till date, the most studied PRRs are Toll‐like receptors (TLRs). Upon activation of TLRs, there is production of inflammatory cytokines and type I interferons (IFNs) via myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88)‐dependent or ‐independent signalling, respectively, modulating innate and adaptive immunity, as well as inflammatory responses. In fish species studied to date, there are more than 17 TLRs that are identified with some showing homology to mammals, and some are unique for teleost. In the present review, more light are to be shed on the classification, structure and specific ligands of TLRs, with focuses on their signal pathways and different biological activities. Studies of TLRs and their role in the innate immune will potentially have implications for the prevention and treatment of fish diseases.     

Compensatory growth of Chinese shrimp, <Emphasis Type="Italic">Fenneropenaeus chinensis</Emphasis> following hypoxic exposure

Compensatory growth following stress is a strategy aquatic animals use to adjust themselves to a variable environment. Studies on the recovery growth of aquatic animals are not only of theoretical value in ecophysiology and evolution, but also important to applications in aquaculture and fisheries resource management. In this experiment, juvenile Fenneropenaeus chinensis with an initial average body weight of about 3.72 g were exposed to hypoxic water (about 2.08 and 3.11 mg/l of dissolved oxygen (DO) content) for 10 days and then switched to normoxic water (about 5.63 and 5.59 mg/l DO). Compared with juveniles in normoxia, juveniles in the hypoxia period allocated a greater proportion of energy to metabolism and exuviations but allocated less energy to daily metabolism per gram shrimp weight (J/g/day). This reduced feed conversion efficiency and feeding rate. Finally, F. chinensis suffered growth depression. The juveniles completely compensated for hypoxia-induced growth depression in 30 days after being switched into normoxic water and the compensation was achieved mainly by hyperphagia and slightly by improvement of feed conversion efficiency. During the recovery period the hypoxic-stressed shrimp showed higher daily metabolic energy (J/g/day) than controls (P < 0.05). Which means the stressed shrimp had more energy for feeding-related activities. So hyperphagia was observed. Energy analysis indicated that F. chinensis improved feed-conversion efficiency mainly by reducing the percentage of energy lost in feces and exuviations. The results showed that short-term non-lethal hypoxia would not affect the growth of juvenile F. chinensis if there were enough time for the stressed shrimp to recover. This suggested F. chinensis was capable of adapting to DO fluctuation to some extent and short-term non-lethal hypoxia would not have an obvious effect on natural, released, and cultured shrimp stock.