南极磷虾粗酶液中蛋白酶的基础酶学性质研究及抑制剂的开发

本研究探讨了反应温度、pH、金属离子(Zn~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Al~(3+)和Ca~(2+))对南极磷虾粗酶液中蛋白酶活性的影响,研究了苯甲基磺酰氟(PMSF)、EDTA·2Na、碘乙酰胺(IAM)和甲苯磺酰–苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)对蛋白酶活性的抑制效果。结果显示,南极磷虾粗酶液中蛋白酶的最适反应温度为40℃;最适反应pH值为8.0;当金属离子浓度为0.5 mmol/L时,Zn~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)金属离子对蛋白酶酶活的抑制率分别为55.02%、55.02%、35.39%、20.67%和41.12%,而Ca~(2+)离子对蛋白酶活有明显的促进作用;PMSF和EDTA·2Na对蛋白酶酶活具有较为显著的抑制作用,PMSF的浓度为8.0 mmol/L时,抑制率为60%;EDTA·2Na浓度为0.6 mmol/L时,抑制率为86.67%;IAM在低浓度时有一定的抑制作用;TPCK低浓度时抑制效果不明显,浓度升高时有一定的抑制作用。在5~30℃的温度范围内,随着温度升高,EDTA·2Na对蛋白酶酶活的抑制效果逐渐增加。本研究阐明了影响南极磷虾粗酶液蛋白酶酶活的因素,开发了针对南极磷虾粗酶液中蛋白酶活性的抑制剂,为南极磷虾在食品领域的开发利用提供了基础理论数据。     

大豆胰蛋白酶抑制剂对南极磷虾类胰蛋白酶的抑制动力学

为了探讨大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对南极磷虾(Euphausia superba)类胰蛋白酶的抑制动力学,采用邹氏不可逆抑制动力学法,测定了STI对该酶的微观速度常数。结果表明:南极磷虾类胰蛋白酶的Km和Vmax分别为0.155 mmol/L,8.44μmol/(L.min)。酶活力随着STI溶液浓度增大而减小,其IC50约为2.8μg/mL;低浓度的STI溶液对酶的抑制作用为竞争性慢可逆抑制。正向微观速度常数k+0为0.184 mmol/(L.min),逆向微观速度常数k-0为0.039 4 min-1,随着STI溶液浓度的逐渐增大,该酶最终将完全失活。本研究旨为该酶的抑制技术研究提供实验数据。     

热处理条件对南极磷虾酶活性的影响

为探索南极磷虾(Antarctic krill)虾粉加工过程中热处理条件与南极磷虾酶活性的对应关系及变化规律,探究有效降低南极磷虾酶活性的热处理加工工艺。通过正交试验设计的方法对比不同加热温度、加热时间、颗粒大小(指圆柱形颗粒纵长)对多酚氧化酶、蛋白酶、脂肪酶活性的影响。结果显示:热处理对多酚氧化酶的影响最为显著,其因素影响程度依次为加热时间、颗粒大小和加热温度;热处理对蛋白酶活性的影响次之,其各因素影响程度依次为颗粒大小、加热时间和加热温度;对脂肪酶影响不显著。研究表明:综合分析南极磷虾酶的热处理影响因素,得出最佳灭酶条件为加热温度85℃、加热时间2.5 min、颗粒规格0.4 cm。采用此热处理条件,可有效避免虾粉制品蒸煮阶段因酶的影响而造成品质问题,为南极磷虾粉船载加工装备提供参考。     

南极磷虾与鹰爪糙对虾酚氧化酶生化性质对比分析

黑变是南极磷虾(Euphausia superba)贮运流通过程中的突出问题,为探究南极磷虾与普通海捕虾在黑变进程方面的异同,选取南极磷虾和海捕鹰爪糙对虾(Trachypenaeus curvirostris)作为研究对象,对2种虾在(2±1)℃贮藏过程中的黑变进程进行了感官评价,提取其酚氧化酶(PO)并进行了纯化,对2种虾PO的生化性质进行了对比分析。结果显示,冷藏条件下,24 h时南极磷虾的黑变已非常严重,黑变部位主要集中在头胸部、腹部甲壳以及尾节部分。72 h时鹰爪糙对虾的头胸部和尾节部分开始有轻微的黑变,之后逐渐扩散到躯干。南极磷虾和鹰爪糙对虾PO粗酶液经硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤后,酶的纯化倍数分别达到17.22和19.67。2种虾PO的最适温度分别为30℃和40℃,南极磷虾PO在低温下仍具有较高的活力。二者的最适pH均为6.0~7.0之间。焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、4-己基间苯二酚、L-半胱氨酸和抗坏血酸均可较好地抑制2种虾PO活力,其中,4-己基间苯二酚抑制效果最好。研究结果为南极磷虾冷链物流过程中的品质控制提供了依据,同时,为虾死后如何有效抑制其黑变提供了参考。     

南极磷虾(Euphausia superba)起捕后蛋白自溶进程及其影响因素

为了有效保持南极磷虾(Euphausia superba)原料品质,实现其高质化利用,本研究选取冷冻南极磷虾作为研究对象,在实验室条件下以非蛋白氮(NPN)含量、三氯乙酸(TCA)可溶性蛋白含量与氨基酸态氮含量为指标,证实了南极磷虾NPN含量的变化可以表征蛋白自溶进程,且可以实现海上处理样品、运至陆地实验室后进行分析的目的。在此基础上,选取完整的及挤压破损的新鲜南极磷虾作为研究对象,以0~8 h南极磷虾样品的NPN为指标,研究了南极磷虾起捕后蛋白自溶进程以及挤压破损对该过程的影响。结果显示,南极磷虾起捕死亡后的1 h内,NPN无显著变化(P>0.05),1 h后NPN迅速增加,挤压破损加速了南极磷虾的自溶进程,因此,目前的拖网作业方式有待改进。     

南极磷虾(Euphausia superba)起捕后蛋白自溶进程及其影响因素

为了有效保持南极磷虾(Euphausiasuperba)原料品质,实现其高质化利用,本研究选取冷冻南极磷虾作为研究对象,在实验室条件下以非蛋白氮(NPN)含量、三氯乙酸(TCA)可溶性蛋白含量与氨基酸态氮含量为指标,证实了南极磷虾NPN含量的变化可以表征蛋白自溶进程,且可以实现海上处理样品、运至陆地实验室后进行分析的目的。在此基础上,选取完整的及挤压破损的新鲜南极磷虾作为研究对象,以0～8h南极磷虾样品的NPN为指标,研究了南极磷虾起捕后蛋白自溶进程以及挤压破损对该过程的影响。结果显示,南极磷虾起捕死亡后的1h内,NPN无显著变化(P0.05),1 h后NPN迅速增加,挤压破损加速了南极磷虾的自溶进程,因此,目前的拖网作业方式有待改进。     

玻璃化冻存对斑马鱼卵母细胞的影响

采用比色法测定了在不同玻璃化冻存液中冻存1、2、4、8d时斑马鱼卵母细胞中谷胱甘肽含量和三磷酸腺苷酶的活性,以研究玻璃化冻存对卵母细胞谷胱甘肽含量和线粒体三磷酸腺苷酶活性的影响。试验结果显示,V4组斑马鱼(玻璃化液组分是:1.5mol/L甲醇、6.0mol/L乙二醇、0.25mol/L蔗糖)卵母细胞冻存1、2、4、8d后存活率最高[分别为(48.89±2.58)%、(39.35±1.34)%、(24.18±2.32)%和(14.56±1.64)%],显著高于其他组。经玻璃化冻存后,斑马鱼卵母细胞谷胱甘肽含量和线粒体三磷酸腺苷酶活性均随冻存天数的增加而显著下降(P0.05)。V4组的谷胱甘肽含量[(13.37±0.59)mg/g]和线粒体三磷酸腺苷酶活性较高,线粒体Ca~(2+)-三磷酸腺苷酶[(3.823±0.144)U/mg]、Mg~(2+)-三磷酸腺苷酶[(4.503±0.144)U/mg]和Na~+/K~+-三磷酸腺苷酶[(7.520±0.198)U/mg]活性最高。各组细胞的活性随着冻存天数的增加而逐渐下降。试验结果表明,玻璃化冻存不能完全避免低温和冷冻保护剂的毒性和对卵母细胞的损伤。     

现场模拟光照条件对南极大磷虾冬季耗氧率的影响研究

为探究海上现场光照条件对冬季南极大磷虾(Euphausia superba)代谢的影响,基于海上暂养实验,采用黑暗组和光照组两种不同的实验条件,对9尾南极大磷虾个体进行了连续11 d的耗氧率研究。结果表明,光照条件下南极大磷虾的单位体质量耗氧率平均为(0.2704±0.0740)μL·(mg·h)^-1,黑暗条件下的单位体质量耗氧率平均为(0.2673±0.0840)μL·(mg·h)^-1。在光照与黑暗条件下南极大磷虾呼吸率无显著差异。通过对比发现,冬季南极大磷虾的耗氧率明显低于夏季的耗氧率[0.63~0.88μL·(mg·h)^-1],且改变一个自然日的光照条件对南极大磷虾耗氧率无显著影响,但会在一定程度上影响南极大磷虾呼吸率的稳定性。研究验证了冬季南极大磷虾处于一种低代谢模式状况,并证明了该模式的稳定性。相关结果可为揭示南极大磷虾越冬机制提供基础数据。     

驼海燕内脏中蛋白酶的提取及其酶学性质的研究

以驼海燕为原料,用丙酮沉淀法制备蛋白酶粗酶,并对其酶学性质进行研究。试验结果表明,提取蛋白粗酶的最佳条件为:原酶液与丙酮的体积比为1∶1.6;蛋白酶反应的最适温度为45℃,最适pH值为8.1;pH为7～9时可保持较高的酶活力;蛋白酶的酶活力在20～50℃基本稳定。酶促反应结果表明,Na+、K+、Li+、Mg2+对蛋白酶活力具有促进作用,而Zn2+、Cu2+、Hg2+能抑制蛋白酶的活力,EDTA对蛋白酶活力的影响甚微。酶动力学方程表明,最大反应速度vmax=5.99U/mL,米氏常数Km=0.69g/mL。     

南极磷虾冻藏温度下的品质变化及其货架期分析

以出肉率及化学变化(pH、TVB-N、TBARS、Ca² -ATPase活性)为指标,结合感官评价,探讨了南极磷虾冻藏温度下(-8、-18和-28 ℃)的品质变化及货架期。实验结果显示,南极磷虾感官评分与冻藏时间和冻藏温度均有显著的相关性(r=0.982和0.981),-8 ℃条件下20 d后南极磷虾感官不可接受,-18和-28 ℃条件下南极磷虾分别在75和120 d时感官不可接受;出肉率与冻藏时间有显著的相关性(r=0.953),在-8、-18和-28 ℃条件下南极磷虾出肉率在货架期终点分别达到31.62%、31.21%、34.52%;pH与冻藏时间和冻藏温度相关性不明显,不适宜用作反映南极磷虾冻藏条件下的品质指标,但随时间的延长pH仍呈增长趋势,在货架期终点3种冻藏温度下南极磷虾pH分别达到7.94、7.99、7.84;TVB-N和TBARS分别与冻藏时间有显著相关性(r=0.944和0.935),但TVB-N只与-8 ℃条件下的温度有显著相关性,TBARS只与-18和-28 ℃冻藏温度有显著相关性,在货架期终点时(感官不能接受)3种冻藏温度下南极磷虾TVB-N和TBARS分别为21.43、20.49、19.74 mg/100 g和0.88、0.78、0.66 mg MA/kg,均低于腐败水平阈值;Ca² -ATPase活性下降显著,与冻藏时间呈显著相关性(r=-0.929)。南极磷虾感官指标、出肉率、TVB-N、TBARS、Ca² -ATPase活性均在冻藏期间有明显变化,且与冻藏时间有明显的相关性,可以考虑用作反映冻藏条件下南极磷虾品质变化指标。因此,综合各项指标并结合感官评价,可以判断实验过程中3种冻藏温度下南极磷虾货架期终点分别为20、75、120 d。     

温度对中国血蛤、双线血蛤肝脏中水解酶和抗氧化酶活性的影响

在不同的温度下,测定了中国血蛤、双线血蛤肝脏组织中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)和过氧化氢酶酶(CAT)活性的变化.试验结果表明,中国血蛤和双线血蛤肝脏中3种酶的最适温度均为加℃.双线血蛤ACP、ALP和CAT的酶活力分别为(61.5±1.78)U、(21.4±1.23)U、(218.7±5.49)U;中国血蛤ACP、ALP、CAT的酶活力分别为(67.7±1.21)U、(22.4±1.36)U、(267.7±6.23)U.温度为20～40℃,3种酶活力上升,至试验最高温度40℃,酶活力下降.     

金乌贼肌肉中三甲胺脱甲基酶的分离纯化及酶学性质

为了提取纯化金乌贼肌肉中的三甲胺脱甲基酶(TMAOase),本研究采用含有0.1 mol/L NaCl、pH 7.0、浓度为20 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-醋酸缓冲液提取粗酶液,经透析、浓缩处理后,通过DEAE-52阴离子交换柱层析和Sephacryl S-300柱层析得到了纯化的TMAOase,并对其酶学性质进行了研究。结果显示,经Sephacryl S-300柱层析的TMAOase相比粗酶纯化了209.54倍;粗酶和纯化酶的最适温度分别为55和50°C,当温度高于最适温度时,酶活性开始出现显著下降,粗酶在80°C仍残留21.9%的活性;而纯化酶在80°C时,几乎检测不到酶活;粗酶和纯化酶的最适p H均为7.0,中性条件下表现稳定,在酸性和碱性条件下稳定性下降,p H为9.0时,粗酶残留60.7%的活性,而纯化酶的活性仅为20.5%。以双倒数作图法(Lineweaver-Burk法)测得纯化的TMAOase的Km值为22.8 mmol/L;经SDS-PAGE电泳分析,测得其分子量为21.3 ku;在化学物质中,柠檬酸和CaCl_2对酶活性具有显著的促进作用,H_2O_2和Na_2S对TMAOase活性有显著抑制作用。     

盐度对中华绒螯蟹仔蟹渗透压和非特异性免疫酶的影响

设置盐度梯度0、4、8、12、16、20和24,测定不同盐度下中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)仔蟹成活率和组织匀浆上清液离子浓度、Na~+-K~+-ATPase活性、氧合血蓝蛋白含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酚氧化酶(PO)活性,研究盐度对仔蟹成活率、渗透压调节和非特异性免疫酶活性的影响,探讨仔蟹对盐度的适应性。结果表明,盐度8实验组中华绒螯蟹仔蟹成活率和氧合血蓝蛋白含量最高,分别为(90.00±1.00)%和(0.253±0.023)mg/mL,显著高于其他实验组(P0.05);而在淡水组和盐度24组这两个指标值均降至最低。Na~+、Cl~-、K~+浓度,Na~+-K~+-ATPase活性和非特异性免疫酶活性在盐度0～8时呈下降趋势,而在盐度8～12时逐渐上升,当盐度大于12时趋于稳定;这些指标值在盐度8实验组降到最低,Na~+、Cl~-和K~+浓度分别为(40.897±1.700) mmol/mL、(8.340±2.130) mmol/mL和(1.842±0.158) mmol/mL,Na~+-K~+-ATPase酶活性为(3.153±0.735) U/mg,非特异性免疫酶SOD、AKP和PO活性分别为(129.026±3.496) U/mg、(1.326±0.173) U/mg和(16.366±0.065) ng/mL。综合各项实验指标表明,不同盐度对中华绒螯蟹仔蟹渗透压和非特异性免疫酶活性具有一定影响,中华绒螯蟹仔蟹在盐度4～8水体中有较好的生理适应性,淡水和高盐度水体会降低其渗透压调节和免疫防御功能,这为长江口仔蟹资源变动评估和繁育场保护提供了参考。     

南极磷虾酶解产物中一种含氟多肽的研究

通过酶解法从南极磷虾肌肉酶解产物中分离、纯化含氟多肽,并采用LC-MS/MS和氨基酸序列分析对其结构进行研究。结果表明,采用胰蛋白酶酶解所得南极磷虾多肽粗提物的得率约为20%,其总氟含量为(731.73±1.01)μg·g^-1。粗提物精制后,制备得到纯度较高的6个多肽(分别命名为F1、F2、F3、F4、F5、F6),采用离子色谱法筛选出含氟量最高的多肽F6,测定其结合肽氟含量为(266.11±0.40)μg·g^-1。将F6的氨基酸序列片段通过NCBI-Nucleotide-Euphausiacea蛋白质数据库检索,按匹配值得分高于100分可筛选鉴定得到4种蛋白质[Clock,Tropomyosin,ATP synthase subunit 6(mitochondrion),Arginine kinase],通过对4种蛋白的分析发现,南极磷虾蛋白结合氟通过与Clock蛋白磷酸化结合的可能性最大。研究结果对今后探究南极磷虾中含氟蛋白的安全评价提供了技术支撑,对南极磷虾应用价值的进一步开发具有重要意义。     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

构建了枯草芽孢杆菌CH_2菌株(Bacillus subtilis CH_2)壳聚糖酶基因的真核表达载体p PIC9K-CH2-Cns,在毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)中进行重组表达,获得了有生物学活性的重组壳聚糖酶,对重组壳聚糖酶的酶学特性及酶解产物进行了分析。结果显示,重组壳聚糖酶的分子量为29 k D,粗酶的比酶活达到133.60 U/mg,纯化后重组蛋白的比酶活为338.08 U/mg;该酶的最适作用温度为50℃,最适pH为4.5,酶动力学常数Vmax=24.39(μmol/mg)·min~(-1),Km=5.48 mg/m L;Fe2+、K+等对其酶活力有一定的激活作用,其中Mn~(2+)能使酶活力提升2.4倍,Ag~+、Mg~(2+)、Hg~(2+)、EDTA、EGTA和SDS等存在时则对其酶活力有强烈抑制作用。利用重组壳聚糖酶酶解壳聚糖,酶解产物主要为聚合度2~10的壳寡糖,且分布均匀。以上结果表明,枯草芽孢杆菌CH_2菌株壳聚糖酶基因在毕赤酵母GS115中成功表达,获得了一种内切型的高酶活力重组壳聚糖酶,该重组酶具有反应条件温和、酶解产物均一等特点,可被应用于海洋甲壳质加工应用中。     

复合酶提取牡蛎抗氧化肽的工艺研究

以牡蛎为原料,首先从木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中筛选出胰蛋白酶为内切酶,以水解度为指标,得到最佳的酶解工艺条件:时间4h,温度50℃,pH8.0,料水比1∶2,加酶量3％(7 500 U/g),水解度为49.50％;同时以水解度为指标,得到外切酶风味蛋白酶的最佳酶解工艺:时间5h,温度50℃,pH8.0,料水比1∶2,加酶量3％ (450 U/g),实际水解度50.95％.最后,以清除羟自由基能力和水解度为指标,探讨内切酶(胰蛋白酶)和外切酶(风味蛋白酶)不同复合酶解方式的抗氧化能力.最终确定,复合酶解制备牡蛎抗氧化肽效果最好,其酶解条件为胰蛋白酶为3％(7 500 U/g)、风味蛋白酶加酶量为3％ (450 U/g),pH8.0,时间5h,料水比1∶2,温度50℃时,水解度高达53.94％,体外清除·OH的EC50为0.56 mg/mL.     

南极大磷虾0、5和20℃贮藏中的品质变化

以感官、细菌总数、嗜冷菌数、TVB-N和TMA-N为指标,探讨了南极大磷虾在0、5和20℃贮藏中的品质变化,结合三氯乙酸可溶性氮含量和细菌菌相的变化对南极大磷虾腐败作用进行了分析。结果表明,南极大磷虾品质下降很快,0℃和5℃温度下15 h后品质不可接受,20℃温度下8 h后品质不可接受。0、5和20℃贮藏中南极大磷虾细菌总数、嗜冷菌数、TVB-N、TMA-N都有增加,三氯乙酸可溶性氮含量变化明显,细菌菌相变化不大,表明0、5和20℃贮藏中南极大磷虾自溶迅速,酶对其腐败起主要作用。     

超低温冷冻对脊尾白虾精子几种酶活性的影响

研究了超低温冷冻保存(-196℃)对脊尾白虾精子内琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、Na+/K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)与顶体酶活性的影响,以期为提高脊尾白虾精子超低温冷冻效果提供理论依据.设置对照组(未添加抗冻剂)、3个实验组[分别添加DMSO (V/V) 10.0％、12.5％、15.0％],于冷冻0、1、3、5、7、15d取样测定各酶活性.结果表明,经冷冻后,除GR外,其他所测酶活性均出现显著下降(P＜0.05),且以对照组酶活性下降幅度最大.GR活性在冷冻7d内显著升高,且对照组明显高于实验组(P＜0.05),在冷冻15d时又出现下降.添加15.0％ DMSO组所测酶活性均高于同期其它各组,表明15.0％ DMSO对精子内酶的保护作用较好.冷冻15 d后15.0％ DMSO组的SDH、LDH和Na+/K+-ATP酶活性由(28.500±1.453) U/mL、(1290.836±27.603) U/L和(2.605-0.232) μmol/(mg·h)分别降至(15.300±0.950) U/mL、(363.713-13.943) U/L和(0.542-0.186) μmol/(mg.h);SOD和CAT活性由(106.497±7.217) U/mL、(383.632±4.731)U/g分别降至(17.036 ±0.321)U/mL、(166.940±1.910) U/g;顶体酶活性从(3.521±0.010)μIU/106降至(1.212±0.043)μIU/106;而GR活性由(217.042±6.962) U/L上升至(302.787±24.558)U/L.从冷冻后各酶下降幅度来看,超低温冷冻对SOD活性的影响最大,其次是Na+/K+-ATP酶.     

食品添加剂对南极大磷虾蛋白自溶的影响

以氨基态氮、可溶性蛋白质含量和可溶性固形物含量为指标,研究了食品添加剂对南极大磷虾(Euphausia superba)蛋白自溶的影响。结果显示,氯化镁和柠檬酸对南极大磷虾蛋白的自溶有一定的促进作用,两者作用显著的添加量分别为2%和0.2%,结合可溶性蛋白质和可溶性固形物指标,促进作用最显著的为添加0.2%柠檬酸;葡萄糖和氯化钙对南极大磷虾蛋白的自溶影响不大;氯化钾、氯化钠、EDTA-2Na对南极大磷虾蛋白的自溶有一定的抑制作用,氯化钠和EDTA-2Na的抑制作用相近,但优于氯化钾,三者作用显著的添加量分别为2%、4%、0.05%,考虑到可溶性蛋白质含量,抑制作用最显著为添加0.05%EDTA-2Na。     

罗非鱼鳃组织中脂肪氧合酶的性质研究

试验结果表明脂肪氧合酶最适反应温度为30℃,最适pH为10.0和4.0。在pH10.0的条件下,最适底物浓度为2.5×10-4mol/L,Km值为0.073mmol/L,Vmax值为3.08×104U/mgprotein.min。EDTA对该酶有较强的抑制作用。而在pH4.0的条件下,最适底物浓度为5×10-4mol/L,BHA、BHT、TBHQ等抗氧化剂有较强的抑制作用。