中国对虾精子做载体将生长激素基因导入受精卵的研究

本实验采用卡介苗注射器将羊生长激素基因溶液注射到亲虾纳精囊中，以精子为载体，携带基因导入对虾受精卵，而达到转基因对虾的目的。经ＰＣＲ检测表明：１．经ＳＴＥ（ｐＨ８．０）第一次洗涤精子的洗涤液呈阳性信号；第２－４次的洗涤液呈阴性；２．多次洗涤后的精子抽提的ＤＮＡ呈阳性；３．检测１０个样品１００尾仔虾中有一个样品呈阳性结果，转基因比率在１％以上。同时斑点杂交结果也印证了上述结果。     

中国对虾的精子介导外源基因转移的初步研究

用中国对虾的精子作载体,成功地将羊生长激素基因导入中国对虾的受精卵,并获得转基因虾个体。用两种不同的基因溶液处理,即30％的NaCl基因溶液和30％NaCl—40％PEG基因溶液。斑点杂交的结果表明,30％的NaCl基因溶液处理的精子,能够将羊生长激素基因导入中国对虾的卵子中,基因转移比率在1％以上。在另一实验组的个体中,用斑点杂交未检测到阳性信号。经比较,处理后的精子的受精能力未受影响。     

长毛对虾仔虾对不饱和脂肪酸需求量的初步研究

用正交法对不饱和脂肪酸进行６因素２水平的饲料含量设计，并在对虾营养试验系统中进行饲养实验。结果表明；长毛对虾仔虾的生长率，存活率受不２饱和脂肪酸种类与含量的影响。在本实验条件下，长毛对虾仔虾期Ｃ１６：ｎ，Ｃ１８：ｎ，Ｃ１８；２ｎ，Ｃ１８；３ｎ，Ｃ２０：１－５ｎ和Ｃ２２－２４的最适宜含量分别上饲料的０．２４％，１．４０％，１．８５％，０．４３％，０．７６％和２．２５％。     

刀额新对虾暴发性疾病初报

刀额新对虾，又叫基围虾，沙虾，泥虾，隶属于对虾科、新对虾属。它具有生长快，抗病力强，尤对低盐、高水温和低氧有较强的忍耐能力。离水后可较长时间不死，很适于活虾上市。近年来各地不断进行淡化养殖，但其暴发疾病尚未见报道。一、养殖经过及虾病特征１．池塘条件：塘２口，共计３３、３亩。１＃塘为２７．３亩，１９９７年曾是中国对虾养殖塘，平均水深１．５ｍ；２＃塘６亩，为鱼池改造塘，水深１.２ｍ。池塘用水为外围养鱼用水。池水常年比重１.００２～１.００３。２．清塘：１＃塘因进水较匆忙，没有进行药塘；２＃塘每亩用生石…     

聚合酶链反应（PCR）检测养殖对虾的白斑病病毒（WSSV）感染

对虾ＷＳＳＶ病是亚洲对虾养殖业中的一个棘手问题。本研究采用Ｋｉｍｕｒａ引物，用ＰＣＲ技术对不同生长期的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）进行了ＷＳＳＶ的检测，同时也检测了对虾发病时养殖池中多见的野生厚蟹（Ｈｅｌｉｃｐ ｓｐ．）和柔尾棘虾虎鱼（Ａｃａｎｔｈｏｇｏｂｉｕｓ ｈａｓｔａ）。检测结果表明：分别在检测的５尾亲虾中的１尾，６尾仔虾中的１尾，５尾稚虾中的３尾及所检测的５尾病虾和２只厚     

用虾黄质改变斑节对虾体色

用虾黄质改变斑节对虾体色用人工饵料喂养斑节对虾幼虾２个月后，体色由通常的绿褐色转为淡蓝色，这是因饵料中缺乏类胡萝卜素引起的。为改变这种情况，．ｇｇ一在饵料中添加５０Ｘ１０－’的虾黄质，定为１号饵料；添加５％褐藻定为２号饵料。喂养４个星期后发现，用ｌ号...     

1993～1994年山东省中国对虾育苗期病毒感染的流行病学调查

１９９３年和１９９４年育苗期，在山东省十余家育苗场采集了亲虾、受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体和仔虾等样品共５６份。组织病理学切片观察说明，所有样品均未检查出对虾暴发性流行病病原ＨＨＮＢＶ的病理变化；ＨＰＶ的病理变化主要在亲虾、糠虾幼体和仔虾中检出，蚤状幼体有ＨＰＶ感染的可疑情况。１９９４年，５．５％的糠虾幼体和５．１％的仔虾检出有ＨＰＶ的感染。在糠虾和仔虾阶段，海捕亲虾苗种的ＨＰＶ带毒率为４．０％，越冬亲虾苗种的带毒率为６．２％。ＨＰＶ和ＨＨＮＢＶ的单克隆抗体ＥＬＩＳＡ检测方法表明有３个样品为可疑的ＨＨＮＢＶ阳性；有１２．５％～２５％的糠虾期育苗池和７０％的仔虾期育苗池存在有ＨＰＶ的感染。     

饲料中添加凹土对凡纳滨对虾存活和生长的影响

研究了饲料中添加凹土（０．０％、０．５％、１．０％、２．０％、４．０％和８．０％）对凡纳滨对虾（１．０４～１．０６ｇ）存活和生长的影响。实验在淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室进行，凡纳滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）幼虾购自海南某育苗场；实验采用单因子６水平设计，每个水族箱放养１０尾对虾，每个水平设３个重复。实验前停食２４ｈ，称其初始体重。日投饵２次，过量投饵；投饵２．５ｈ后从每个水族箱收集残饵、粪便和虾壳。实验周期３０ｄ。所得数据用单因素方差分析和Ｔｕｒｋｅｙ′ｓ多重比较进行处理。结果表明，饲料中添加凹土显著地影响对虾的特定生长率，而对存活率、摄食量、饲料系数和吸收效率的影响不显著；在２．０％凹土水平，凡纳滨对虾的特定生长率显著高于０．０％凹土水平，但与其它处理差异不显著；总的看来，２．０％凹土添加组对虾的饲料系数低于其它处理，而摄食量高于其它处理。     

刀额新对虾对淡水的适应性观察

刀额新对虾原本生活于海水中，其人工育苗盐度一般为２５‰左右，要放养到淡水中养殖必须先经过一段时间的淡化，使其逐渐适应淡水环境，这是刀额新对虾淡水养殖成功与否的关键。现就该虾对淡水的适应性观察结果报告如下。一、材料与方法１．虾苗来源１９９８年５月１６日从厦门购进３００万尾规格为平均体长０．３ｃｍ的虾苗，测定海水盐度为２４‰。２．不同淡化速度观察经同等盐度暂养一天后，取１５０尾分成３组，１组和２组每６小时降低盐度２‰，３组每６小时降低盐度１‰，每隔２４小时计算一次存活数。每次换水后适量投喂丰年虫无节…     

中国对虾“黄鳃病”病原菌的回接及其药物防治试验研究

从患黄鳃病的中国对虾的血淋巴液中分离到细菌ＡＥ１。经浸染及肌肉注射方法感染的健康对虾，并对发病过程及症状进行观察，证明被感染对虾出现的症状与原发病的虾相同；幼虾死亡率与水体中含菌量密切相关；注射ＡＥ１菌的对虾死亡率达１００％，经专家鉴定病原菌ＡＥ１是鳗弧菌Ⅱ型（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ Ｂｅｒｇｍａｎ Ⅱ）。抗菌药物氯霉素等可有效地抑制病菌的繁殖及病菌对健康虾的感染。     

显微注射生长激素基因导入中国对虾（Penaeus chinensis）受精卵的研究

本实验采用显微微量注射方法，交羊生长激素基因导入中轻地虾受精卵，受精卵发育到蚤状幼体第三期后采样检测。ＰＣＲ检测结果表明：７个样品共９３尾幼体，有３个样品呈出阳性信号，基因转移比率至少在３％以上。同时斑点杂交结果也证明有两个明显阳性斑点。     

In Vivo Transfection of Adult Eastern Oysters Crassostrea virginica

The eastern oyster Crassostrea virginica provides a commercially valuable industry along the eastern and Gulf coasts of the United States. Recently this industry has been damaged by disease problems, creating an interest in the use of gene transfer (transfection) to improve disease resistance. We transfected adult oysters with two genes, red-shifted green fluorescent protein ( rsGFP ), commonly used as a reporter gene, and the lytic peptide cecropin B ( cepB ), known to have antimicrobial properties. Oysters were transfected by injecting DNA mixed with SuperFect™ reagent (Qiagen Inc.) into the adductor muscle sinus. Oysters were assigned to three groups of 15: the first was injected with rsGFP complexed with transfecting reagent: the second was injected with cepB complexed with transfectlng reagent; and the third was injected with saline (control group). Hemolymph was collected at 4 and 10 d after injection. DNA was extracted for analysis by polymerase chain reaction (PCR), and hemocytes were examined by flow cytometry and fluorescence microscopy for detection of green fluorescence due to rsGFP expression. The rsGFP gene was detected by PCR in hemocytes from 14 of 15 oysters at day 4, and in 15 of 15 oysters at day 10. The cepB gene was detected by PCR in 12 of 15 oysters at day 4 and in 14 of 15 oysters at day 10. No oysters from the control group were positive for either gene at days 4 or 10. Green fluorescence was detected by flow cytometry at significantly higher levels ( P < 0.05) in oysters injected with rsGFP than in other oysters at day 4, but not at day 10. This report indicates the ability to introduce DNA into adult eastern oysters with subsequent gene expression. Future work will involve developing these techniques for enhanced disease resistance in oysters.     

鲇细胞 b基因序列变异及遗传多样性分析

从４个种群的鲇（Ｓｉｌｕｒｕｓａｓｏｔｕｓ）线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ，ｍｔＤＮＡ）扩增出约５００ｂｐ的细胞色素ｂ基因，经ＣｌｕｓｔａｌＸ同源排序后得４００ｂｐ序列。用ＰｏｐＧｅｎ３２软件计算遗传距离和遗传一致度。１７个个体间的遗传 距离的变化范围为０～０．０２１１，遗传一致度的变化范围为１～０．９７９１。结果显示，在长江上游的支流中，雅砻江种群在该基因片段上基本不存在变异，在被分析的４个个体中，其细胞色素ｂ基因的序列完全一致；岷江种群和乌江种群在该基因片段上有一定的变异。沅江上游的贘阳河种群在该基因片段上基本不存在变异，在被分析的５个个体中，其细胞色素ｂ基因的序列完全一致。但各个种群间在该基因片段上差异较大。在４个种群的鲇Ｃｙｔｂ基因比较分析的基础上，构建了遗传关系聚类图，雅砻江、岷江、乌江、贘阳河４个种群各聚为一支后，雅砻江和岷江２个种群再聚为一支，乌江和贘阳河２个种群再聚为另一支。     

转生长激素基因中华倒刺鲃的构建及其检测

用从斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)cDNA文库克隆到的生长激素基因,与鲤β肌蛋白启动子、大麻哈鱼生长激素基因的poly(A)终止信号序列等调控元件共同构建了表达重组质粒pFV2 cfGH。提取重组质粒,用精子载体法导入中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)的受精卵中,经孵化培养成转基因成鱼。抽提423尾转基因实验鱼血总DNA,经PCR检测表明:斑点叉尾鮰生长激素基因已导入中华倒刺鲃基因组中,导入率为17.26%。同时通过RT-PCR技术检测阳性中华倒刺鲃中生长激素基因的表达情况。     

显微介导河蟹总DNA导入镜鲤的检测与分析

利用显微介导远缘杂交技术将河蟹总DNA直接导入镜鲤受精卵内,再利用AFLP分子标记技术检测显微介导河蟹基因镜鲤的外源DNA。在30对AFLP引物中,有3对引物扩增出供体基因片段,即在显微介导河蟹基因镜鲤中均有和河蟹基因相同而对照镜鲤没有的条带。对6尾阳性显微介导河蟹基因镜鲤的扩增产物进行回收、克隆和测序验证。结果表明:阳性显微介导河蟹基因在镜鲤中均含有供体基因目的片段。本研究在分子和基因水平上验证了河蟹总DNA可通过显微介导方式整合到镜鲤基因组中,为显微介导外源总DNA转化技术的应用提供新的思路。     

外源基因导入鲤（Cyp rinus carpio）受精卵最佳时期的研究

本研究以鲤鱼受精卵为材料，通过显微注射技术，在受精卵的不同发育时期把鲤鱼ＭＴ启动子基因和大麻哈鱼ＧＨ基因导入受精卵中，按孵出的鱼苗数分别计算成活率，再通过斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ杂交检测整合情况，计算整合率，孵化率最高的为单细胞中期（９０．８３％），整合率最高的为单细胞后期和囊胚期（４０％）。综合研究结果外源基因导入鲤鱼受精卵的最佳时期应选在单细胞后期。     

利用DNA条形码COI基因分析我国重要贝类系统进化关系

DNA条形码旨在通过PCR技术获得一段DNA序列,在物种水平上对现存生物类群和未知生物材料进行识别和鉴定。线粒体细胞色素C氧化酶I(COI)基因是常用DNA条形码基因之一,为研究COI基因作为DNA条形码在贝类系统进化中的评估效果,本文利用PCR技术扩增获得了60个贝类物种的353条COI基因序列,通过聚类法构建了neighbor-joining(NJ)进化树,同时还对7个物种不同地理群体的遗传进化情况进行了分析。结果表明,选用的COI基因引物在大多数贝类中通用性较强,除在珍珠贝目中的扩增效率只有10%以外,在整个研究中扩增效率达到82.7%;60个物种中除太平洋潜泥蛤(Panopea abrupta)、沼蛤(Limnoperna fortunei)和魁蚶(Scapharca broughtoni)等8个物种在进化树中的进化地位与传统系统分类具有一定差别外,其他物种的聚类关系与传统分类基本一致;对7个物种、共26个地理群体的聚类分析发现,COI基因基本能对同一物种的不同地理群体进行聚类,只有极个别群体或群体中的某个个体存在聚类混乱现象。综上所述,COI基因在一定程度上适用于贝类物种鉴别和系统发育研究,丰富了COI基因在物种鉴别应用中的科学数据。     

用显微注射技术导入外源DNA对鲤鱼和虹鳟鱼受精卵孵化率的影响

本报道了利用显微注射技术导入外源基因分别对鲤鱼和虹鳟鱼授精卵孵化率影响的研究。从1993年－1996年4年中，我们用显微注射方法，将全鱼生长激素基因导入虹鳟鱼授精卵（包括囊胚期卵）5，676粒，孵出鱼苗364尾，孵化率为6.4%(4年平均，虹鳟鱼正常孵化率为80％）；而用这种方法，将全鱼生长激素基因导入鲤鱼授精卵12，196粒，孵出鱼苗4，290，孵化率为34．0％（4年平均，鲤鱼正常孵化率为70％左右）。实验结果：显微注射技术在虹鳟鱼和鲤鱼两种受精卵上的效果明显不同，斑点杂交和SouthernBlot杂交结果相近。     

贝类派琴虫实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×10^1～2.6×10^7拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。     

线纹海马尾部溃烂症病原轮虫弧菌的分离鉴定及特性分析

本研究分离了线纹海马(Hippocampus erectus)尾部溃烂症病原并对其理化、胞外酶和药敏特性进行了分析。结果显示,分离于患病海马肝脏的优势菌株HM-10为线纹海马尾部溃烂症病原菌,其对海马的半致死浓度(LD_(50))为1.51×10~6 CFU/g体重。API 20E理化分析显示,该菌精氨酸双水解酶阴性,赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶阳性,L-阿拉伯糖、杏仁苷产酸。基于形态观察、理化指标对比,以及16S rRNA和看家基因(gyrB、rpoD、recA)序列分析结果,确定菌株HM-10为轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)。采用平板玻璃纸覆盖法制备该菌胞外产物(ECP),溶血及胞外酶活性分析结果显示,菌株HM-10的ECP对绵羊血有较强的溶血活性,同时具有蛋白酶、明胶酶、淀粉酶、脲酶活性,但不具有脂肪酶和卵磷脂酶活性。药敏分析结果显示,菌株HM-10对氨基糖苷类、青霉素类、头孢类、酰胺醇类及多肽类等17种药物敏感。本研究确定了线纹海马尾部溃烂症的病原菌为轮虫弧菌,结果对海马养殖中弧菌病的防治提供了参考资料。