贝类派琴虫PCR检测方法的建立及初步应用

根据派琴虫的基因保守序列设计了特异性引物,对派琴虫的DNA进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序.结果表明,扩增大小为596bp,与预期扩增序列同源性为99.8%.该PCR方法检测灵敏度高,最低可检测1pg的派琴虫DNA;特异性强,对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、副溶血孤菌、沙门氏菌、诺瓦克样病毒等贝类病原体的扩增均为阴性.用该PCR技术对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,阳性率分别为14.6%、10.6%和15.0%.结果显示,派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可用于贝类派琴虫的临床快速检测.     

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。     

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列,用Primer Express 2.0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针.对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法.该方法对单孢子虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测到这两个原虫.该方法对派琴虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果全为阴性.研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测.     

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列,用Primer Express2.0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测到这两个原虫。该方法对派琴虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测。     

对虾IHHNV荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)保守基因序列(AF218226),设计合成了1对引物和1条TaqMan探针,建立了检测IHHNV的荧光定量PCR技术.将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR对比.结果显示,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达2个拷贝,比常规PCR灵敏度高1 000倍.对保存的15份经常规PCR检测为IHHNV阳性的DNA样品进行荧光定量PCR检测,结果都为阳性,检测的病毒含量为2.15×107～4.21×104拷贝/μL.用该方法对不同浓度的样品进行了重复检测,表明该方法具有良好的重复性,可满足IHHNV的临床诊断需要.     

基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用

为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普通PCR检测仅2份显示阳性。本研究建立了针对基因Ⅰ型GCRV的荧光定量检测方法,具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点,适合于目前基因Ⅰ型GCRV的临床快速检测和病毒定量分析。     

牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立牡蛎疱疹病毒魁蚶株快速、灵敏、准确和操作简便的检测方法,实验根据已测序完成的OsHV-1-SB全基因组序列,选择其保守区域,建立了交叉引物等温扩增检测方法,并对反应温度、dNTPs、Mg2+浓度和反应时间进行了优化.结果显示,最佳温度为63℃,反应时间为60 min,dNTPs浓度为1.4 mmol/L,Mg2+浓度为6 mmol/L.该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA,并且特异性较强,与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应.使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、辽宁大连共计22份OsHV-1-SB感染情况未知的魁蚶样品进行了检测.研究表明,实验所建立的OsHV-1-SB的CPA检测方法简单、快速、灵敏且特异性强.由于其检测结果可通过简单离心或者向反应管中加入核酸荧光染料GeneFinderTM进行肉眼观察,所以可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用,具有较好的应用前景.     

广东近岸海域贝类寄生派琴虫流行病学调查研究

贝类一般在开放式海域养殖,这使得贝类病害防控工作很难开展,因此调查病原流行感染规律对贝类病原的发生、发展和防治尤为重要.文章采用常规PCR技术,调查了广东近岸6个养殖海域5种重要养殖贝类寄生派琴虫的感染情况,分析了贝类寄生派琴虫感染的时空变化情况.结果显示,共检测到2种派琴虫,其中北海派琴虫(Perkinus beih...     

梭子蟹肌孢虫SYBR Green I实时定量PCR检测方法的建立与应用

梭子蟹肌孢虫(Ameson portunus)是感染三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的常见病原之一,该研究以其SSU rRNA基因为靶标建立了SYBR Green I实时定量PCR检测方法。结果显示:该方法扩增效率为101.45%,检测灵敏度下限可达2.0×10~1拷贝·μL~(-1),特异性、组内重复性和组间重复性均好。利用该荧光定量PCR方法对一批来自"牙膏病"流行区的养殖三疣梭子蟹样品进行检测,梭子蟹肌孢虫检出率为82.35%。检测结果显示,活蟹的每毫克肌肉平均带虫量大幅低于死蟹,表明该地区梭子蟹的死亡与肌孢虫的感染密切相关,而且,当梭子蟹肌孢虫载量达到1.0×10~9拷贝·mg~(-1)时三疣梭子蟹存在暴发疾病甚至死亡的风险。另外,通过对比检测发现,梭子蟹肌孢虫套式PCR方法对这批样品的检出率为64.71%,表明该研究建立的荧光定量PCR方法具有更高的灵敏度。     

对虾IHHNV荧光定量PCR检测方法的建立

根据G enBank中对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒( IHHNV) 保守基因序列( AF218226), 设计合成了1对引物和1条TaqM an探针, 建立了检测IHHNV的荧光定量PCR技术。将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR对比。结果显示, 所建立的荧光定量PCR 方法灵敏度可达2个拷贝, 比常规PCR 灵敏度高1 000倍。对保存的15份经常规PCR检测为IHHNV 阳性的DNA 样品进行荧光定量PCR检测, 结果都为阳性, 检测的病毒含量为2. 15 @ 107 ~ 4. 21 @ 104 拷贝/LL。用该方法对不同浓度的样品进行了重复检测, 表明该方法具有良好的重复性, 可满足IHHNV的临床诊断需要。     

A real‐time PCR for the detection of hepatopancreatic parvovirus (HPV) of penaeid shrimp

Hepatopancreatic parvovirus (HPV) causes a common shrimp disease that occurs in many shrimp farming regions, especially in the Indo Pacific, and infects most of the cultured penaeid species. There are seven geographic HPV isolates known, so a method to detect different HPV types is needed. We developed a sensitive and generic real‐time PCR assay for the detection of HPV. A pair of primers and TaqMan probe based on an HPV sequence obtained from samples of Fenneropenaeus chinensis from Korea were selected, and they were used to amplify a 92 bp DNA fragment. This real‐time PCR was found to be specific to HPV and did not react with other shrimp viruses. A plasmid (pHPV‐2) containing the target HPV sequence was constructed and used for determination of the sensitivity of this assay. The assay could detect a single copy of plasmid DNA, and it was used successfully in finding HPV in shrimp samples from the China‐Yellow Sea region, Taiwan, Korea, Thailand, Madagascar, New Caledonia and Tanzania.     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

奥尔森帕金虫环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

奥尔森帕金虫是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、灵敏、准确和使用简便的检测方法,实验根据奥尔森帕金虫5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)序列,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应温度、反应体系中Mg2+浓度和反应时间进行了优化。该方法的检测灵敏度约为30拷贝质粒DNA,并且特异性较强,与海水帕金虫、包纳米虫、波豆虫及急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)等病原均无交叉反应。使用LAMP法对两批菲律宾蛤仔样品进行检测,结果表明,LAMP检测与传统PCR检测相比,灵敏度更高,检测结果更准确。实验所建立的奥尔森帕金虫LAMP检测方法简单、快速、灵敏且特异性强,可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。     

牡蛎中副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180CFU/mL.同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%.结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PcR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测.     

套式PCR在中华绒螯蟹颤抖病病原螺原体检测中的应用

提取人工分离、培养的中华绒螯蟹颤抖病病原螺原体的基因组DNA,并进行梯度稀释作为PCR模板,根据GenBank已有螺原体16S rRNA基因序列设计出套式PCR外部引物,将螺原体特异性引物作为内部引物,利用套式PCR对梯度稀释的模板进行扩增,得到271 bp产物,对照已有的一步PCR检测法,检测灵敏度提高100倍,最小检测达15.5 fg数量级螺原体DNA,从而建立更为灵敏的中华绒螯蟹颤抖病病原螺原体的检测方法。     

中国牡蛎帕金虫的检测与鉴定

对中国沿海23个地点的太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）、近江牡蛎（Crassostrea ariakensis）、褶牡蛎（Ostrea plicatula）进行样品采集。利用液体巯基醋酸盐培养基培养法、组织切片法、聚合酶链反应法,对样品进行帕金虫含量检测。结果表明在三种牡蛎体内春、夏、冬季都有帕金虫寄生,夏季帕金虫感染率最高可达100%,其他季节感染率较低。利用分子生物学方法鉴定帕金虫种类,结果表明,在中国沿海的三种牡蛎体内主要寄生两种帕金虫：Perkinsus.sp.n（EU068107）与Perkinsus olseni,这两种帕金虫在中国沿海分布具有一定地域性,Perkinsus.sp.n（EU068107）主要分布在中国南海的海南省、广西壮族自治区、广东省沿岸,而Perkinsus olseni分布在中国东海的浙江省沿岸。     

基于环境DNA的岩原鲤检测及生物量评估

为建立岩原鲤基于环境DNA （eDNA）的实时荧光定量PCR （qPCR）检测方法,准确鉴别岩原鲤并探讨e DNA浓度与其生物量的定量关系,实验根据岩原鲤mtDNA中12S rRNA基因序列设计eDNA引物和TaqMan探针,利用PCR扩增出岩原鲤12S rRNA基因的序列,克隆入pMD19-T载体,构建重组质粒作为qPCR标准;使用梯度稀释质粒标准品作为模板,进行qPCR扩增,制作标准曲线,建立岩原鲤qPCR检测方法,并评价其特异性、灵敏性和应用效果。结果显示,引物和TaqMan探针对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线,显示阳性扩增,而其他鱼类和空白对照均未得到扩增信号,表现为阴性;qPCR的阈值循环数（C_t）与标准品拷贝数的线性关系好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数（R²）达到0.999,检测限位DNA浓度为5×10^-6 ng/μL,扩增效率为94.7%;检测养殖不同数量岩原鲤的水体中eDNA浓度,目标DNA浓度和岩原鲤数量存在线性正相关性（R²=0.957）,得到岩原鲤DNA浓度与其个体数...