哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条的制备

用18~20nm胶体金标记抗哈维氏弧菌Vibrio harveyi抗体并制备金标垫,分别将羊抗兔Ig G和纯化后的抗哈维氏弧菌抗体包被于NC膜上作为质控线和检测线,组装制作了哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条,优化了该试纸条的制作条件,测试了其性能。结果表明:所制备的哈维氏弧菌免疫层析试纸条具有较好的特异性,与费尼斯弧菌Vibrio furnissii、维氏气单胞菌Aeromonas veronii、美人鱼发光杆菌Photobacterium damselae、类志贺邻单胞菌Plesiomonas Shigelloides、鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri、鳗利斯顿氏菌Listonella anguillarum、迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、海豚链球菌Streptococcus iniae、嗜水气单胞菌Aeromonas Hydrophila等9种常见水产病原菌无明显交叉反应,检测灵敏度为3×105CFU/m L,5~10min即可得出检测结果,具有快速、简便、特异性强和适应基层推广应用等优点,可用于养殖鱼类病原哈维氏弧菌的现场检测。     

鱼肠道弧菌胶体金快速检测试纸研制

鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)可引起多种养殖鱼类发病死亡, 给鱼类养殖业带来严重经济损失。为解决养殖过程中鱼肠道弧菌的现场快速检测问题, 本研究研制了鱼肠道弧菌胶体金快速检测试纸。通过制备兔抗鱼肠道弧菌多克隆抗体, 间接ELISA分析发现其与鱼肠道弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物及全菌破碎蛋白发生阳性免疫反应, 与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的4种抗原蛋白发生程度不等的免疫交叉反应。制备胶体金标记鱼肠道弧菌抗体, 确定了鱼肠道弧菌4种抗原蛋白的划线浓度, 以4种抗原蛋白作为4条检测线, 羊抗兔IgG作为质控线, 基于竞争法免疫层析技术研制出鱼肠道弧菌快速检测试纸。对鱼肠道弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌的检测结果显示, 该试纸可以准确鉴别出鱼肠道弧菌, 并能判别其他病原菌的交叉反应。该试纸对鱼肠道弧菌的最低检测限为5×10⁵ CFU/mL, 检测耗时为10 min。对患病牙鲆组织的检测结果显示, 该试纸与ELISA结果一致, 表明具有较好的检测准确性。本研究为水产养殖现场的鱼肠道弧菌快速、准确检测提供了有力工具。     

类志贺邻单胞菌间接ELISA检测方法的建立

自患病草鱼分离的类志贺邻单胞菌菌株LCCiL90625NA经甲醛灭活后注射新西兰大白兔,制备兔抗血清,Protein A亲和层析柱分离纯化抗体,通过优化反应条件,建立类志贺邻单胞菌间接ELISA检测方法.结果表明,制备的兔抗类志贺邻单胞菌多克隆抗体效价为1∶1.28×105,建立的ELISA检测方法可特异性地检测类志贺邻单胞菌,纯化后的多克隆抗体与副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、非O-1霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、易损气单胞菌和杀鲑气单胞菌等细菌均无交叉反应,检测灵敏度为1.0×104 CFU·mL-1.该方法的建立为类志贺邻单胞菌的快速检测和该病的早期诊断及防控提供基础.     

天津观赏鱼疾病病原快速检测产品进入试用

<正>近日,天津市水产技术推广站承担的"天津市养殖观赏鱼主要病害的现场快速诊断技术研究"的成果已进入试用阶段。项目研发的观赏鱼疾病病原快速检测技术产品——胶体金免疫层析试纸条及快速检测试剂盒可检测嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌、海豚链球菌、无乳链球菌、维氏气单胞菌、美人鱼发光杆菌等6种观赏鱼常见病原菌,实现了现场检测,操作简便,快速高效。胶体金免疫层析试纸条只需5~10分钟即可得到检测结果,检测灵敏度更高的快速检测试剂盒在90分钟内即可得到肉眼可见的检测结果。目前快速检测产品已开始在天津地区9个观赏鱼养殖基地进行试用。为证明产品的准确性,技术人员     

甲壳类水产品主要过敏原原肌球蛋白胶体金免疫层析快速检测方法的建立及应用

为实现甲壳类水产品主要过敏原的快速检测,实验使用凡纳滨对虾原肌球蛋白(TM)作为检测靶标,构建了胶体金免疫层析检测方法。使用天然TM分别免疫SD大鼠和新西兰大白兔制备多克隆抗体,以40 nm胶体金标记的鼠多抗作为检测抗体,以兔多抗为捕获抗体,基于双抗体夹心原理组装免疫层析试纸条,并应用于市售食物样品的检测。结果显示,组建的免疫层析试纸条可在5 min之内显示结果,视觉检出限为10 ng/mL,对虾、蟹、克氏原螯虾及美洲螯龙虾等甲壳类水产品的特异性高,但与蛤蜊、扇贝存在微弱的交叉反应;在不含甲壳类水产品的市售食品中的加标回收率为81%～126%,准确性良好;试纸条的批内、批间变异系数低于15%,市售实际食物样品的检测结果与食物过敏原标签一致。研究表明,该方法具有高灵敏度与检测特异性,可在多种基质与商业化食品中实现甲壳类过敏原的有效检测,具有较强的实际应用价值。     

抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

为了获得稳定、高效分泌抗软骨藻酸(DA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用活泼酯法制备软骨藻酸免疫抗原(DA-KLH)和包被抗原(DA-BSA),以DA-KLH免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备大量单抗,捕获EL ISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型,间接ELISA法测定腹水效价;用G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果显示,成功构建2株能稳定分泌DA单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株2B1和4C2,抗体亚类分别为IgG1和IgG2a,间接EL ISA检测小鼠腹水的抗体效价达1∶64 000,腹水纯化后蛋白浓度为1.27和0.675 mg/mL。研究结果表明,成功制备的抗DA单克隆抗体杂交瘤细胞株稳定、高效,为利用该单抗研制快速检测软骨藻酸的胶体金免疫层析试纸条打下基础。     

豚鼠气单胞菌快速检测间接ELISA法的建立

应用从患败血症的鳗鲡中分离、纯化出的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)菌株AB40511NA1,制备了兔抗血清,建立了快速检测豚鼠气单胞菌的间接ELISA方法.研究结果显示:AB40511NA1兔抗血清的效价为1:16000.该法对AB40511NA1最低检测量为6×104 cfu·mL-1;与水产养殖动物主要致病菌嗜水气单胞菌(A. hydrophila)、温和气单胞菌(A. sobria)、鳗弧菌(V. anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)及非O1-群霍乱弧菌(Non-O1 Vibrio cholerae)均无交叉反应,特异性强;能快速、准确、方便地检测出豚鼠气单胞菌.     

白斑综合证病毒胶体金免疫层析试剂板的研制

将胶体金免疫层析技术应用于对虾白斑综合征的诊断,研制了一种检测对虾中白斑综合征病毒的胶体金免疫层析试剂板.将胶体金标记的抗白斑综合征病毒单克隆抗体包被在金标垫上,将抗白斑综合征病毒多克隆抗体和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上.通过双抗体夹心法检测样品中自斑综合征病毒含量.结果表明,该试剂板对白斑综合征病毒的最低检出限为1.0 mg/kg,特异性好,稳定性高,整个检测所需时间为8～10 min,适合现场快速检测.     

白斑综合征病毒胶体金免疫层析试剂板的研制

将胶体金免疫层析技术应用于对虾白斑综合征的诊断,研制了一种检测对虾中白斑综合征病毒的胶体金免疫层析试剂板。将胶体金标记的抗白斑综合征病毒单克隆抗体包被在金标垫上,将抗白斑综合征病毒多克隆抗体和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上。通过双抗体夹心法检测样品中白斑综合征病毒含量。结果表明,该试剂板对白斑综合征病毒的最低检出限为1.0 mg/kg,特异性好,稳定性高,整个检测所需时间为8~10 min,适合现场快速检测。     

甲基睾酮免疫胶体金试纸条的研制及在水产品中的应用

通过研究胶体金免疫层析技术,建立了一种快速检测水产品中甲基睾酮含量的方法。将待测样品中的甲基睾酮和试纸条检测线上包被的人工抗原(MT-BSA)竞争性结合金标结合垫上包被的胶体金-甲基睾酮单抗聚合物,根据检测线呈现的红色线条深浅来判定样品的阴阳性。结果显示:试纸条上MT-BSA抗原工作浓度为1.0mg/m L,羊抗鼠二抗工作浓度为1.5 mg/m L,试纸条的最低检测限达到10μg/kg,与甲基睾酮类似物的交叉反应率低;使用甲醇提取,4倍PBST稀释,整个检测所需时间仅10~15 min,适用于大规模样品筛选。