抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

为了获得稳定、高效分泌抗软骨藻酸(DA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用活泼酯法制备软骨藻酸免疫抗原(DA-KLH)和包被抗原(DA-BSA),以DA-KLH免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备大量单抗,捕获EL ISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型,间接ELISA法测定腹水效价;用G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果显示,成功构建2株能稳定分泌DA单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株2B1和4C2,抗体亚类分别为IgG1和IgG2a,间接EL ISA检测小鼠腹水的抗体效价达1∶64 000,腹水纯化后蛋白浓度为1.27和0.675 mg/mL。研究结果表明,成功制备的抗DA单克隆抗体杂交瘤细胞株稳定、高效,为利用该单抗研制快速检测软骨藻酸的胶体金免疫层析试纸条打下基础。     

番茄褪绿病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法

根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3μmol·L~(-1)。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。     

番茄褪绿病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法

 根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green I实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3 μmol·L^-1。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。     

酸雨胁迫下镧对冬小麦种子萌发的影响

为了探索酸雨胁迫下稀土元素镧对冬小麦种子萌发的影响,采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的模拟酸雨条件和稀土元素镧(10 mg/L)处理培养皿中的冬小麦(Triticum aestivum L.)种子,置于常温状态下萌发,测定不同酸雨胁迫强度下镧对种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、过氧化物酶(POD)活性及丙二醛(MDA)含量的影响.结果表明,高强度酸雨(pH 2.0)胁迫下,经镧处理及未经处理的冬小麦种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数都为0,POD活性较对照显著降低,MDA含量达到最高.随着酸雨胁迫强度逐渐减弱(pH≥2.5),POD活性逐渐升高,MDA含量逐渐降低,说明经镧处理后,酸雨胁迫强度过高时(pH 2.0),冬小麦种子萌发完全受到抑制,镧对种子的防护作用没有明显表现出来;在pH为2.5～5.0的酸雨强度下,镧对种子的萌发具有一定的防护效应,减轻了酸雨对萌发期间种子的伤害程度,增强了种子抗酸雨的能力.     

山东省芋花叶病毒病的田间调查及鉴定

为明确芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,Ds MV)在山东芋种植区的发生和遗传进化,在山东潍坊、青岛、烟台、日照和临沂等5个芋主栽区进行调查,对采集样品进行病毒病病原鉴定、序列分析和遗传进化分析。结果显示,芋花叶病毒的检出率为55.9%,在5个地区皆有分布。5个Ds MV分离物cp基因的核苷酸序列相似性为88.5%~91.9%,氨基酸序列相似性为93.4%~97.5%;与国内外已报道代表性Ds MV分离物cp基因的核苷酸与氨基酸的序列相似性分别为74.8%~99.4%、79.7%~99.1%。遗传进化分析显示,Ds MV山东分离物与日本分离物(Ds23)、中国分离物(ND和ZAN)和美国分离物(Ds MV-U2)亲缘关系较近,聚在同一分支。综上,Ds MV在山东省芋主栽区发生普遍,其cp基因序列之间变异相对较大。     

天津地区番茄褪绿病毒的分子检测和鉴定

为明确2014年夏天在天津番茄种植区采集到疑似感染番茄褪绿病毒的番茄样品的侵染病原,利用To CV外壳蛋白和热激蛋白的特异引物进行反转录PCR(RT-PCR)检测,分别扩增得到特异核苷酸片段。序列分析表明,HSP70核苷酸序列与已登录的番茄褪绿病毒日本分离物Tochigi(AB513442)相似性为99.5%,CP氨基酸和核苷酸序列与已登录的番茄褪绿病毒日本分离物Tochigi(AB513443)相似性分别为99.2%和99.3%,表明天津地区的番茄受到To CV侵染,且天津与日本To CV分离物序列相似性最高。由于调查地区番茄黄化曲叶病毒发生普遍,针对To CV阳性样品利用TYLCV特异性引物进行了分子检测,扩增产物序列与TYLCV以色列株系分离物的相似性均在99.0%以上,表明2种病毒在田间发生复合侵染,该研究首次明确天津地区的番茄受到To CV侵染和To CV与TYLCV的复合侵染。     

软骨藻酸快速检测方法技术研究

为比较研究海产品中软骨藻酸日常分析的快速检测技术,筛选出适合不同检测目的的检测技术。本文通过对直接ELISA法、间接ELISA法、胶体金免疫层析法和高效液相色谱法的检测时间、检出限、保质期等进行研究,并对贝类样品中软骨藻酸含量进行测定。结果表明,间接ELISA法的检出限为18ng/L,检测时间为2.5h,在4℃条件下可保存7d;直接ELISA法的检出限为3.58ng/L,检测时间为1.5h,在4℃条件下可保存7d;免疫胶体金试纸条检出限为20ng/L,检测时间15min,在4℃条件下可保存6个月;高效液相色谱法(HPLC)检出限为0.25ng/L,检测时间为6min。从而可以推断这4种检测技术均能达到各国水产品条例软骨藻酸20μg/g限值的要求,而高效液相色谱法检出限最低,免疫胶体金试纸条具有更短的检测时间和较强的稳定性。     

番茄褪绿病毒RT-PCR检测技术的优化及河南分离物的鉴定

为获得高效、灵敏和稳定的番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)RT-PCR检测体系,选取文献报道的和重新设计的共9套ToCV的RT-PCR引物,经过一系列测试和比较,筛选出了灵敏度、特异性均较高的引物组合,并对反应条件、参数进行了优化,确定了最优反应条件。应用优化的ToCV RT-PCR检测体系对从河南设施蔬菜生产区采集的疑似感病番茄样品进行检测,扩增产物测序后经BLAST比对发现,河南分离物的CP和HSP70基因序列与GenBank上注册的ToCV典型分离物序列的相似性均达94%以上,通过对ToCV病毒粒子的电镜观察而进一步确定ToCV已在河南侵染设施番茄。     

记忆缺失性贝毒软骨藻酸的污染现状及检测技术

阐述软骨藻酸的主要检测技术——小白鼠生物检测法、高效液相色谱（HPLC）检测法、毛细管电泳检测法、酶联免疫吸附法等方法,对国内外前沿研究技术和优化过程进行详细说明,总结各种方法的利弊,并对未来软骨藻酸的毒理研究和检测分析进行展望。     

河北省设施番茄褪绿病毒分子检测和鉴定研究

以2014年夏季在河北7个县市设施番茄种植区田间采集的疑似番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)感病植株为试材,采用RT-PCR检测、BLAST比对和MEGA 5.0系统树分析等方法,研究河北设施番茄上ToCV的发生和分子鉴定以及ToCV与另一种严重发生的番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLC)复合侵染情况。结果表明:以ToCV外壳蛋白(Coat Protein,CP)和热激蛋白(Heat Shock Protein 70,HSP70)共3对特异引物对其中4个典型地区ToCV疑似样品进行检测,分别扩增到约1 032、943、911bp的特异条带,同时针对ToCV阳性样品利用TYLCV特异引物从部分样品中扩增得到约833bp的核苷酸序列,4个样品均确定为ToCV阳性,样品与ToCV北京分离物(KC887999)CP基因序列一致性最高,为99.7%,同时确定田间存在ToCV和TYLCV复合侵染。