蓝耳病毒变异或造成区域流行或大暴发

<正>在去年10月举办的某培训班上,广东省农业科学院兽医研究所猪病研究室主任宋长绪博士在对当前中国猪病概况、猪蓝耳病的预防和控制等问题进行阐述时指出:"预计每3年~5年蓝耳病病毒会发生一次大的变异,造成区域流行或大暴发。我们最近对分离的毒株序列进行分析后证明,蓝耳病病毒的某些关键基因已有较大的变异,与2006年的JXA1株相比在GP5基因和蛋白上已有较大的不同"。     

白斑综合征病毒江苏分离株变异区和缺失区基因的序列比较

为了解白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)在养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中的感染流行情况和分子流行病学特征,以及探讨不同病毒株间的遗传进化差异,2008年7月至2010年6月在江苏各主要克氏原螯虾养殖产区共采集了83份样品,应用环介导等温扩增技术(LAMP)检测42份样品为病毒感染阳性,阳性率达50.6%。在此基础上考虑地理和时间因素选取了兴化、盱眙等地的6份样品,PCR扩增、克隆了样品中所携带病毒的变异区和缺失区基因并对其进行了测序。分析结果显示,在变异区除兴化毒株为1 829 bp之外,其余各分离株间差异微小,均在1 440 bp左右;而在缺失区各毒株大小均为384 bp,且核苷酸序列完全一致。随后将各分离株序列与GenBank已公布的毒株做进一步的序列比较分析,结果表明在江苏境内流行的兴化毒株与其余毒株间存在明显差异,在遗传上相距较远,并且推测WSSV变异区和缺失区可能是各自独立进化变异的;同时,缺失变小的病毒基因组更易于适应宿主和环境的变化。     

黑龙江地区鲤春病毒血症病毒的分离与基因型分析

对2015—2016年黑龙江不同地区的40个养殖场送检的鲤(Cyprinus carpio)进行鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)的细胞培养分离、PCR鉴定、病毒滴度测定、病毒表面糖蛋白(glycoprotein,G)氨基酸序列聚类分析及基因分型研究。细胞培养结果显示,来自4个不同养殖场的鲤组织样本能够感染鲤上皮细胞(epithelioma papulosum cyprini,EPC)产生典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),收集病毒悬液分别称为Shlj1~Shlj4。PCR鉴定结果表明,该4株病毒均为SVCV。病毒滴度实验测算出SVCV Shlj 1~Shlj 4的滴度分别为10~(6.28)、10~(6.88)、10~(7.57)和106.38 TCID50/mL。Shlj的糖蛋白基因核苷酸序列的聚类分析和遗传进化分析结果显示,Shlj 1~Shlj 4与Gen Bank收录的中国参考株A2、BJ0505-2和美国参考株USA、212364聚为一簇,同源性为98.4%~99.8%;Shlj 1~Shlj 4毒株之间的糖蛋白核苷酸序列相似性在98.6%~99.8%,其中Shlj 3与美国SCVC毒株USA、212364具有最高的核苷酸相似性(99.8%),Shlj 2与英国参考毒株880163具有最低的相似性(88.0%)。糖蛋白氨基酸序列比对结果显示,Shlj4中氨基酸突变最多,与另3个毒株差异较大。基因型分析结果显示,Shlj 1~Shlj 4均为基因Ia型。本研究结果表明,黑龙江地区2015—2016年间的SVCV检出率约为10%,并且来源于不同养殖场的病毒分离株的核酸序列呈现不同程度的差异,该结果进一步证明SVCV毒株在中国不同的鲤养殖环境中正在不断地进化。     

广东佛山地区鸭圆环病毒分子流行株遗传变异分析

目的 研究广东佛山地区鸭圆环病毒(DuCV)流行毒株的遗传变异情况。方法 采用常规PCR方法，对采自广东佛山的3份阳性鸭组织样品中扩增Rep基因部分片段和Cap基因，进行核苷酸序列测序，并将Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列与30株参考序列进行同源性比较和遗传变化分析。结果 3份阳性样品分别扩增出相应的基因片段；Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列进化树和同源性分析显示，3株DuCV流行株与台湾株(AY3947213)在同一进化支，均属于DuCV-2型，与同分支的参考毒株相似性分别为97.2%～100%和96.9%～100%,2个基因型中Rep基因同源性高于Cap基因；氨基酸序列的变异分析表明，与中国台湾株(AY3947213)相比较，Rep部分氨基酸和Cap氨基酸分别发生相同位置的氨基酸置换和单独突变，Cap氨基酸突变位点多于Rep氨基酸。结论 研究测得的3株DuCV流行株均属于DuCV-2型，在广东地区有一定范围的流行，且CAP蛋白的变异程度高于REP蛋白，为鸭圆环病毒感染的监控和诊断提供了依据。     

东北地区不同宿主NDV的分离鉴定与系统发育进化分析

针对我国东北地区获得高免新城疫(NewcastleDisease,ND)抗体鸡群仍然发生新城疫(ND)的情况,应用分子流行病学技术,对所分离的18株鸡源新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)和1株鸽源NDV进行系统发育进化分析。将NDV分离株通过差速离心纯化,以SDS-蛋白酶K(或Trizol法)提取病毒RNA,RT-PCR扩增其融合蛋白(F)基因532bp或280bp关键片断,经回收克隆到pMD18-T载体上进行核苷酸序列测定(GenBank序列号:AY208680-AY208698)。核苷酸和氨基酸序列进行同源性比较,结果表明各毒株之间核苷酸同源性为83.1%～100%,氨基酸同源性为85.5%～100%;系统发育进化树分析显示,其中JL-12、HLJ-3为弱毒株,与疫苗株V4同属于基因Ⅰ型;其余17株均为强毒株,其中HLJ-4、JL-14为Ⅵ型,其余15株均为基因Ⅶ型,由此可见东北地区目前新城疫的流行是由3种不同基因型的NDV毒珠(Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型)所发,但以基因Ⅶ型为主,这与我国其他地区和世界上其他国家ND的流行情况趋于一致。     

猪蓝耳病免疫应注意的问题

<正>蓝耳病疫苗需要谨慎选择。一般认为,蓝耳病疫苗的选择应建立在本场病原学检测的基础上。据调查分析,86%以上的猪场感染的蓝耳病为变异株,那么这部分群体应选择高致病性毒株的蓝耳病疫苗,其它的选择经典毒株的疫苗。猪场第一次做蓝耳病疫苗必须坚持做好"三步曲"。第一步,要预防、稳定猪场的细菌性疫病和蓝耳病等,应用药物来杀灭细菌、抑制病毒的增殖,避免"不打疫苗没事、打了却发生了高热病"的事件出现。药物方案为用5%优乐欣2 000 g+比龙瘟清1 000 g/t拌料,     

克氏原螯虾白斑病毒株(WSSV-Cc)基因组的一个印迹

从自然感染、濒死的克氏原螯虾中分离出的白斑病毒株(Cambarus clarkii whispovirus,WSSV-Cc或Cc株)是一株基因组较小的新毒株。为寻找白斑病毒进化过程在基因组中留下的印迹,进行了显微和超微观察、基因组架构与系统发育分析及相关基因扩增等研究。选择Cc株74L、86L、87R、88R、92R和95R的6个基因,与8个白斑病毒株的同源基因所编码蛋白序列构建进化树,结果可分为克氏原螯虾病毒(Cc株、CN02株、Pc株)和海水对虾病毒(CN株、CN01株、CN03株、CN04株、TW株和KR株) 2支。再对不同毒株的同源蛋白进行多重序列比对,显示Cc-87R是与海水对虾病毒株同源蛋白差异显著、缺失跨膜区(TMD)及其相邻287 aa序列、但仍有完整PI3K_rbd结构域的病毒膜蛋白。进一步设计和使用87R-F/87R-R和238-F/87R-R两对引物,分别以淡水小龙虾病毒Cc株和海水对虾病毒CN株的基因组为模板进行核酸扩增,结果从Cc株模板中扩增到大小为709 bp,含Cc-87R全部序列的核酸片段;而从CN株的模板中却扩增到大小分别为1 600和4 810 bp,仅含Cc-87R部分序列的核酸片段,为Cc-87R是Cc株基因组中一个序列结构独特的印迹提供了实验证据。这一发现将有助于克氏原螯虾白斑病毒病原的检测及其流行趋势预警。     

两株Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的分离、鉴定及生物学特性比较

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同分离株毒力强弱及生物学特性的差异,该研究从患病和健康草鱼体内分离到Ⅱ型GCRV各一株,分别命名为ZH180804和CQ180701,并从细胞培养特性、致病性、基因组带型、基因序列差异、遗传进化关系等方面进行比较分析。结果显示,ZH180804对草鱼和稀有鲫的致死率分别为80%和100%, CQ180701对草鱼和稀有鲫的致死率分别为0和10%,初步表明ZH180804为强毒株,CQ180701为弱毒株,且弱毒株感染过的草鱼对强毒株的攻击感染具有较好的免疫保护;2株分离株在草鱼鳔细胞(GSB)、稀有鲫卵细胞(GRE)及稀有鲫尾鳍细胞(GRF)中均能增殖但不产生致细胞病变效应(CPE),且ZH180804株的增殖量是CQ180701株的1 000倍以上;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,2株分离株基因组带型相似,但S7、S8、S9、S10与S11节段的分布存在一定的差异;2株病毒的S7与S11节段的基因序列同源性分别为98%和99%。基于S7与S11节段编码的氨基酸序列构建的遗传进化树显示,2株分离株聚在同一个分支上,具有较近的亲缘关系。研究表明,从患病和健康的草鱼中分离的2株Ⅱ型GCRV有较多共性,但其复制能力、致病性等方面存在较大差异。     

重庆5个地区PRRSV ORF7基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法,对来自重庆合川、长寿、綦江、大足、开县等5个区县的5个猪场的PRRS病料进行了ORF7基因的扩增,并克隆、测序和序列比对。结果发现,这5株与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性为98.5%,其推导的氨基酸序列同源性为92.6%;与已发表的ORF7序列CQ0703、JX0602、HB0602比对,核苷酸同源性为99.6%,其推导的氨基酸同源性为98.0%;与疫苗株RespPRRSMLV核苷酸同源性为98.6%,氨基酸同源性为94.3%,与欧洲型代表株LV株ORF7基因序列差异较大,核苷酸同源性仅有56.6%,而且推导的氨基酸数比LV株少5个,二者同源性仅为58.1%。结果表明5个区县流行的PRRSV与VR-2332和RespPRRSMLV亲缘关系很近,均为美洲型毒株。     

东北地区不同宿主NDV的分离鉴定与系统发育进化分析

针对我国东北地区获得高免新城疫（Newcastle Disease，ND）抗体鸡群仍然发生新城疲（ND）的情况，应用分子流行病学技术。对所分离的18株鸡菲新城疲病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）和1株鸽源NDV进行系统发育进化分析。将NDV分离株通过差速离心纯化．以SDS-蛋白酶K（或Trizol法）提取病毒RNA，RT—PCR扩增其融合蛋白（F）基因532bp或280bp关键片断，经回收克隆到pMD 18-T载体上进行核苷酸序列测定（GenBank序列号：AY208680-AY208698）。核苷酸和氧基酸序列进行同源性比较，结果表明各毒株之间核苷酸同源性为83．1％-100％，氨基酸同源性为85．5％-100％；系统发育进化时分析显示．其中JL-12、HLJ-3为弱毒株．与疫苗株V4同属于基因Ⅰ型；其余17株均为强毒袜．其中HLJ-4、JL-14为Ⅵ型，其余15株均为基因Ⅶ型，由此可见东北地区目前新城疲的流行是由3种不同基因型的NDV毒珠（Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型）所发．但以基因Ⅶ型为主．速与我国其他地区和世界上其他国家ND的流行情况趋于一致。     

哺乳仔猪腹泻综合征发病原因

<正>关于本病的发病原因众说纷纭,哈尔滨兽医研究所学者初步认为是冠状病毒(流行性腹泻)的变异株,在腹泻猪病料中已检测到新的变异毒株,与韩国等周边国家鉴定出PED二型病毒基本相同。第二种说法是新发现一种病毒如博卡病毒、星状病毒等,但后来发现未发生腹泻的猪体内也可检出这种病毒,所以不太可以是发病的主要病原,最多是帮凶的作用。第三种说法是其它病毒:有的猪场检出了大量的轮状病毒,还有的人认为是蓝耳病病毒的变异株。第四种说法是猪场猪群中毒因素造成,据广州国家种猪测定中心樊福好博     

湖北地区克氏原螯虾白斑综合征病毒变异区ORF14/15、ORF23/24基因序列比较分析

试验扩增、克隆了在湖北地区采集的19份克氏原螯虾(Procambarus clarkii)白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)阳性样品的变异区ORF14/15和ORF23/24基因,通过测序比较分析了湖北各WSSV毒株与Gen Bank公布的标准毒株间在变异区ORF14/15及ORF23/24基因的差异性。结果显示,19份WSSV阳性样品中有部分样品在变异区扩增出ORF14/15、ORF23/24基因片段,变异区基因序列分析发现,与Gen Bank已公布的标准毒株相比,存在大片段缺失。在变异区ORF14/15,有3个毒株扩增出1 442 bp的片段,4个毒株扩增出630 bp的片段,基于变异区ORF14/15构建的系统进化树显示,这些毒株归属两个不同的分支。在变异区ORF23/24,有2个毒株扩增出大小为2 096 bp的片段,进化分析发现这2个毒株在变异区ORF23/24的遗传距离较近。     

高致病性猪蓝耳病的发生及诊断要点

<正>高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征(俗称蓝耳病)病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病。仔猪发病率可达100%、死亡率可达50%以上,母猪流产率可达30%以上,育肥猪也可发病死亡。1猪蓝耳病传播途径猪蓝耳病病毒可以通过多种途径     

基于牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因的巢式PCR检测方法的建立及应用

为了建立适用于Os HV-1不同变异株的检测方法,在牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)3个变异株全基因组序列比对的基础上,筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的DNA聚合酶(DNA polymerase)基因,据此设计巢式PCR引物,优化PCR反应体系和条件,建立了基于Os HV-1 DNA聚合酶基因的巢氏PCR检测方法(P-n PCR检测方法),利用P-n PCR与Cn PCR检测方法对不同年份和宿主来源的Os HV-1疑似感染样本进行检测。结果显示,Pn PCR检测方法能稳定地检出100拷贝/μL的病毒DNA;P-n PCR较C-n PCR检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明,本研究建立的P-n PCR检测方法适用于Os HV-1不同变异株的检测,可为该病毒的检测和流行病学调查提供可靠的技术支持。     

传染性造血器官坏死病毒Sn1203株全基因组序列及系统进化分析

本课题组于2012年从中国东部的虹鳟鱼养殖场分离得到了严重威胁我国鲑鳟鱼养殖的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)IHNV-Sn1203病毒株。根据GenBank中收录的IHNV病毒株的序列设计引物,将IHNV-Sn1203基因组序列分成5个片段进行RT-PCR克隆,最终得到完整的IHNV-Sn1203基因组序列。利用Lasergene和MEGA 5.0软件分析了IHNV-Sn1203株的全基因组序列、基因组编码蛋白、基因组末端和未翻译序列、以及病毒基因同源性和系统发育。结果发现,IHNV-Sn1203基因组全长11131nts,共编码6个病毒蛋白,大小分别为核蛋白(N)1176nts、磷蛋白(P)693nts、基质蛋白(M)588nts、表面糖蛋白(G)1527nts、聚合酶蛋白(L)5961nts和非结构蛋白(NV)336nts。IHNV-Sn1203株各基因间均具有保守的基因终止序列(Gene end,GE)、基因间序列(Intergenic regions,IG)、基因起始序列(Gene star,GS)及Kozak序列,以确保病毒基因的转录和翻译效率。系统进化分析发现,IHNV分为E、U、M、L和J共5个基因型,其中IHNV-Sn1203株与中国其他IHNV株具有显著的亲缘关系,属于J基因型中的J Nagano亚型。由G基因的进化分析发现,J基因型的病毒与U基因型亲缘关系最近,推测IHNV病毒最初可能通过进口鱼卵的方式由U基因型引入,随时间的推移逐渐进化为J基因型。     

10株副溶血弧菌多位点序列分型新序列型

2011年浙江某规模化养殖场大面积爆发凡纳滨对虾红体病。病虾未检出白斑病毒与桃拉病毒,在肝胰脏分离得到10株副溶血弧菌,对其进行基于dnaE-gyrB-recA-dtdS-pntA-pyrC-tnaA的多位点序列分型。这些菌株均为新序列型(ST)菌株,其中1株为ST413,7株为ST414,2株为ST415;ST413包含新等位基因型recA-166与tnaA-121,ST414则含有新等位基因型gyrB-219。新等位基因型与新序列型已被多位点序列分型数据库确认并收录。新序列型与已知序列型均只含有3个以下相同的等位基因。结果提示,与此次凡纳滨对虾红体病相关的副溶血弧菌分离株可能经历了较高水平的分子变异,呈现出显著的分子多样性,并非来自单一克隆。本研究代表由副溶血弧菌新序列型引起凡纳滨对虾红体病的首次报道。     

高致病性猪蓝耳病的流行特点、诊断与综合防制

<正>2006年夏,猪"高热病"首先在我国南方部分省、市发生,给养猪业造成了较大损失。2007年1月,国家农业部通过对分离到的病毒采用全基因序列分析等技术手段,最终确定变异猪蓝耳病病毒是猪"高热病"主要病原,并定名为高致病性猪蓝耳病。     

高致病性猪蓝耳病的综合防控措施

<正>近年来,高致病性猪"蓝耳病"在我国南方各省陆续发生,严重威胁着生猪生产的安全,制约着生猪产业的发展。高致病性猪"蓝耳病"是由猪繁殖与呼吸综合症(俗称蓝耳病)病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病。仔猪发病率可达100%、死亡率可达50%以上,母猪流产率可达30%以上,育肥猪也可发     

上海地区2013—2018年鲤春病毒血症病毒的分离和进化特征分析

为了解上海市近年来鲤春病毒血症病毒(SVCV)的流行情况,探明上海市SVCV变异进化规律,对上海地区2013—2018年送检的养殖鲤(Cyprinus carpio)、锦鲤(Cyprinus carpio koi)、金鱼(Carassius auratus)等鲤科鱼类样品中的SVCV进行了病毒分离、鉴定和基因序列进化分析。结果显示: 上海地区近6年来每年均有SVCV检出,从125份样本中共分离获得了18株SVCV毒株,阳性率为14.4%。各毒株接种草鱼卵巢细胞(grass carp ovary, CO)后均可以导致明显的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)。免疫荧光实验也表明,病毒结构蛋白N、P、M和G均在感染细胞中高水平表达。进一步通过巢式PCR扩增和序列测定,获得了18株分离株G基因606bp的核酸序列。进化分析显示,上海地区的SVCV分离株均隶属于Ia分支,株间核酸序列同源性较高,但不同分离株之间核酸序列也呈现出一定程度的差异。其中2015年之后的分离株均聚类为同一小分支,提示其从同一祖先进化而来。实验结果显示,SVCV在上海地区持续以低水平流行并在不断进化。研究提示,养殖户应改变传统的养殖模式,提高防病意识和管理水平,相关部门也需要加强持续监测,以减少和控制鲤春病毒血症(SVC)的发生和流行。     

猪圆环病毒2型分离株的基因组克隆、序列测定与分析

设计合成两对覆盖PCV2基因组全长的引物,对PCV2分离株S2、P11、L进行全基因测序。将所测序列与GenBank上已公布的PCV2毒株序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株与其它地域的24株PCV2分离株的基因组序列同源性很高。3个分离株之间的全基因核苷酸同源性在95.4%～99.3%。序列分析表明欧洲分离株和美洲分离株分别构成PCV2的两个大的分支:欧洲系和美洲系。S2、P11属于欧洲系,L属于美洲系。