EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)在重组大肠杆菌中的表达条件研究

本研究以EGCG-O-甲基转移酶（EOMT）催化EGCG生成EGCG3"Me的产量为主要指标,探讨了重组大肠杆菌内EGCG-O-甲基转移酶的诱导表达条件。结果表明,当诱导剂IPTG终浓度为0.05mmol/L,诱导时间为20h,培养基初始pH为7.0,以及诱导温度为20℃时,EOMT的表达效果最佳。     

小麦高分子量谷蛋白亚基1Dx5的AS-PCR分子鉴定

小麦高分子量谷蛋白亚基Glu—D1位点上1Dx5—1Dy10和1Dx2—1Dy12分别紧密连锁，与小麦面包加工品质的优劣密切相关。为了加速小麦品质育种进程，利用1Dx5亚基特异PCR标记鉴定了67份小麦品种（系）的谷蛋白Glu—D1位点，有22个品种扩增出478bp特异片段，表明这些品种具有1Dx5亚基；45份品种未扩增出478bp特异片段，表明其不具有1Dx5亚基，1Dx5亚基出现频率为32．8％。PCR标记的鉴定结果与SDs-PAGE电泳结果一致，通过比较，初步建立了鉴定1Dx5亚基的稳定扩增体系。     

HMW-GS分子标记多重PCR体系的建立及新疆春小麦的检测

为给新疆优质春小麦品种选育提供参考依据,利用小麦优质高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)基因的特异性标记,基于17份已知HMW-GS组成的品种(系),构建了3套多重PCR,体系Ⅰ可用于同时检测AxNull和Dx5基因,体系Ⅱ可同时检测Ax2*和By8基因,体系Ⅲ可同时检测Bx14和Dx5基因;用3套多重PCR体系分别检测17份小麦品种,其结果与SDS-PAGE检测结果完全一致,表明建立的3套多重PCR体系稳定可靠,可用于小麦品种优质HMW-GS基因聚合育种.利用此体系对85份新疆春小麦品种进行分析表明,AxNull和Ax1的频率均为24.7%,Ax2*为50.6%,By8为48.2%,Bx14(+By15)为0%,Dx5(+Dy10)为34.1%.     

转基因小麦1Dx5基因沉默的遗传表达和品质效应分析

为了明确通过RNA干扰技术（RNAi）获得的转基因小麦品系“Glu1Dx5RNAi”中1Dx5基因的遗传规律,以“Glu1Dx5RNAi”为供体亲本,以弱筋品种扬麦18和扬麦13为轮回亲本进行回交, 采用半籽粒SDSPAGE法检测亲本、F₁、F₂和BC₁F₁籽粒的高分子量谷蛋白亚基（HMWGS）组成。结果表明,1Dx5基因的沉默效应在杂交后代中表现为显性遗传,在F₂和BC₁F₁世代1Dx5亚基不表达的种子数与1Dx5亚基表达的种子数的比例分别符合13∶3和3∶1的分离比例,说明转小RNA基因导致1Dx5基因沉默是单基因显性遗传。对转基因小麦“Glu1Dx5RNAi”及其受体品种Bobwhite进行品质测试表明,Glu1Dx5RNAi蛋白质含量（13.28%）比转化受体Bobwhite（12.83%）高0.45个百分点,硬度指数、微量SDS沉降值比受体品种分别降低3.13和3.7 mL。1Dx5基因沉默对弱筋小麦育种可能会有一定的利用价值。     

HMW-GS分子标记多重PCR体系的建立及新疆春小麦的检测

为给新疆优质春小麦品种选育提供参考依据,利用小麦优质高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)基因的特异性标记,基于17份已知HMW-GS组成的品种(系),构建了3套多重PCR,体系Ⅰ可用于同时检测AxNull和Dx5基因,体系Ⅱ可同时检测Ax2*和By8基因,体系Ⅲ可同时检测Bx14和Dx5基因;用3套多重PCR体系分别检测...     

小麦热激蛋白WHSP90基因的原核表达及多克隆抗体制备

为了进一步研究HSP90基因的功能,将WHSP90基因构建到原核表达载体pET-28a(+)中,得到His-WHSP90融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,发现1 mmol/L IPTG诱导4 h蛋白表达量最大;经过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)纯化得到的纯化蛋白浓度达到0.4 mg/mL.免疫家兔制备抗体,用间接ELISA法检测免疫后家兔抗血清效价大于125 000,满足后续试验要求的效价值,为在蛋白水平上研究WHSP90基因功能提供了基础.     

优质高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5 1Dy10的分子检测

为给优质强筋小麦的选育提供高效、快速、稳定的选择手段,以已知高分子量麦谷蛋白亚基组成的10个小麦品种为材料,比较了5个已报道的高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5(1Dy10)的PCR分子标记,并对12个DNA模板进行了分子检测.结果表明,在5个分子标记中,有1个分子标记是非特异的,有2个分子标记是显性的特异标记,另2个则是共显性的分子标记.其中,由引物Dx-F、Dx5-F和Dx-R组成的共显性标记,能稳定地扩增出5亚基和非5亚基的特异序列,并且无非特异PCR产物,是用于高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5分子检测的最理想标记.     

大豆GmERF6基因的原核表达及重组蛋白纯化

将大豆中已克隆的一个新的ERF转录因子基因(GmERF6)构建到原核表达载体pET28上,导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,对其进行IPTG诱导.结果表明:在IPTG浓度为0.3 mol·L-1,诱导时间为3h时,重组蛋白得到表达,分子量大约为30 kDa.SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在...     

CIMMYT小麦种质农艺及品质性状分析

为给黄淮南片冬麦区小麦育种提供种质信息,将1 328份CIMMYT国际面包小麦观察圃(IBWSN)的种质于2011-2015年度种植于黄淮南片冬麦区的新乡,调查了42^nd ～46^th国际面包小麦观察圃种质的主要农艺性状和抗病性,分析了45^th国际面包小麦观察圃种质的品质表现及优质亚基基因状况。结果表明,CIMMYT国际面包小麦观察圃种质均表现为春性,综合农艺性状差;株高不低于80 cm,大多数（84.6%）在90～110 cm之间;千粒重高于45.0 g和50.0 g的比例分别为28.4%和10.0%。CIMMYT国际面包小麦观察圃种质的花期与黄淮南片冬麦区品种一致,多数小麦种质白粉病发生比较轻。45^th国际面包小麦观察圃种质的湿面筋含量为23.6%～41.6%,其中,13.2%的小麦种质湿面筋含量大于35.0%,40.8%的小麦种质湿面筋指数不低于80.0%;49.7%的小麦种质携带Dx5+Dy10基因,3.0%的小麦种质携带Bx7^OE 基因;有 10个小麦种质含有优质5+10亚基及7超量表达亚基,可作为优质亲本改良黄淮南片冬麦区高产品种。     

25份澳大利亚小麦种质的性状表现及利用

为给黄淮南片冬麦区小麦育种提供信息,对25份澳大利亚小麦种质于2016-2018年度在新乡进行了部分农艺性状调查,对其品质性状及优质亚基等进行了分析。结果表明,25份澳大利亚小麦种质多表现为春性,综合农艺性状较差;千粒重低于黄淮麦区高产对照品种周麦18,变化范围为31.4 g～43.1 g;湿面筋含量、面筋指数、稳定时间、弱化度的变化范围分别为28.0%～39.1%、55.2%～96.5%、4.0 min～25.0 min、5%～100%。从澳大利亚小麦种质中,筛选出了具有湿面筋含量高、面筋指数高、稳定时间长、面粉粉色白等优良品质特性的材料,鉴定出了含5+10亚基、7+8~*亚基(7超量表达亚基)、17+18亚基、13+16亚基、低PPO活性基因及 Wx-B1基因缺失等优异品质材料,筛选出了含有 Rht-D1b矮秆基因以及 Lr34和 Lr46抗叶锈基因的材料。利用澳大利亚小麦种质为改良亲本,与黄淮麦区表现突出的小麦品种配制三交或四交组合,按常规系谱方法对优良性状进行定向选择,培育出了综合农艺性状表现好、品质表现突出的小麦新品系。     

斑茅SAMDC基因的克隆及其原核表达分析

以斑茅(Erianthus arundinaceus)samdc基因的cDNA为基础,采用基因重组技术,将该基因按正确的阅读框架定向克隆于原核表达载体pET-29a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果表明:重组斑茅samdc基因在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为43.281kDa.斑茅samdc基因原核表达载体的成功构建和重组斑茅SAMDC蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

基因工程菌生物合成茶氨酸条件研究

研究了不同诱导条件对基因工程菌催化合成茶氨酸的影响,确定了较为优化的诱导表达条件;通过单因子试验研究了不同反应条件对基因工程菌催化合成茶氨酸的影响,研究结果表明反应体系中较高的菌体浓度对催化茶氨酸有一定的抑制作用;高L-Gln浓度可以提高茶氨酸的生成量,但是却降低了L-Gln的转化率;基因工程菌催化合成茶氨酸的最适pH是9.5左右,较为适合的反应温度是32℃~37℃。     

Expression of an extended HMW subunit in transgenic wheat and the effect on dough mixing properties

Wheat line L88-31 was transformed with a gene encoding an extended form of subunit 1Dx5 to study the relationship between subunit size and the effect on dough mixing properties. Four transgenic lines were recovered, one of which expressed a truncated form of the protein with mobility between those of the wild type and extended subunits. Comparison of the Mixograph profiles and gluten protein compositions with those of the control lines and a line expressing the wild type subunit 1Dx5 transgene showed that two of the transgenic lines had poor mixing properties and that this was associated with co-suppression of HMW subunit gene expression. The other two transgenic lines had improved mixing properties (measured as increased mixing time) and this was associated with increased proportions of large glutenin polymers. None of the transgenic lines expressing the extended form of the 1Dx5 subunit showed the ‘overstrong’ mixing properties exhibited by transgenic lines expressing the wild type 1Dx5 transgene.     

大豆GmPM13基因的克隆及原核表达

通过对大豆(Glycine max)油体钙蛋白(caleosin)基因GmPM13的克隆及原核表达,为今后利用基因工程方法检测转GmPM13基因提供抗体。运用RT-PCR技术克隆得到大豆油体钙蛋白GmPM13基因,构建原核表达载体,命名为p ET-28a-pm13。并转化到Ecdi和Rosetta中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析GmPM13蛋白的表达情况。大豆GmPM13基因全长c DNA序列为738 bp,包括一个720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸,油体钙蛋白的分子量为27.1 k Da,诱导表达产物的大小与预计蛋白大小相符。在28℃,1.5 mol·L~(-1)IPTG浓度下,诱导12 h蛋白的表达量最高,占总蛋白的39.25%。     

茶氨酸生物合成工程菌构建

通过PCR扩增E.coli DH5α的γ-ggt基因,产物经纯化后用Kpn I和Xho I双酶切,回收γ-谷氨酰转肽酶基因目的片断,并与经相同双酶切的表达载体pET-32a连接,得到重组质粒pET-GGT。将重组质粒转化到E.coli BL21中,获得工程菌。工程菌株经0.05βmol/L IPTG,32℃诱导表达,湿菌体的酶活达到2.0βU/g,大约是出发菌株E.coli DH5α的15倍。工程菌催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到29.40βg/L,L-Gln的转化率为48.22%,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力比出发菌株E.coli DH5α提高了100多倍。     

Mixing properties and dough functionality of transgenic lines of a commercial wheat cultivar expressing the 1Ax1, 1Dx5 and 1Dy10 HMW glutenin subunit genes

In this work we report the effects of the HMW-GS 1Ax1, 1Dx5 and 1Dy10 on the breadmaking quality of the bread wheat cultivar Anza that contains the HMW-GS pairs 1Dx2 + 1Dy12 and 1Bx7* + 1By8, and is null for the Glu-A1 locus. This allows the characterization of individual subunits 1Dx5 and 1Dy10 in the absence of subunit 1Dx5, and the interactions between these subunits and subunits 1Dx2 and 1Dy12 to be determined. Three transgenic lines termed T580, T581 and T590, containing, respectively, the HMW-GS 1Ax1, 1Dx5 and 1Dy10 were characterized over 3 years using a range of widely-used grain and dough testing methods. The transgenic subunits 1Ax1, 1Dx5 and 1Dy10 accounted for 25.2%, 20.3% and 17.9%, respectively, of the total HMW-GS in the three transgenic lines. Although lines T581 and T590 expressed similar levels of subunits 1Dx5 and 1Dy10 they had different effects on other aspects of protein composition, including changes in the ratios of glutenin/gliadin, of HMW/LMW-GS, the 1Dx2/1Dy12, the x-type/y-type HMW-GS and the proportions of high molecular mass glutenin polymers. In contrast, lines transformed to express subunits 1Ax1 and 1Dx5 showed similar changes in protein composition, with higher protein contents and decreased ratios of glutenin/gliadin and 1Dx2/1Dy12. In addition, both transgenic lines showed similar increases in the ratio of x-type/y-type subunits compared to the control line. The transgenic lines were analysed using Farinograph, Mixograph and Alveograph. This confirmed that the expression of all three subunits resulted in increased dough strength (and hence breadmaking quality) of the cultivar Anza. A beneficial effect of subunit 1Dx5 has not been reported previously, transgenic wheat lines expressing this subunit giving overstrong dough unsuitable for breadmaking. However, the expression of subunit 1Dy10 had a greater effect on breadmaking quality than subunits 1Ax1 and 1Dx5. The Farinograph parameters such as dough stability and peak time were increased by 9.2-fold and 2.4-fold, respectively, in line T590 (expressing 1Dy10) with respect to the control line. Similarly, the Mixograph mixing time was increased by four-fold and the resistance breakdown decreased by two-fold in line T590 compared with the control line. The Alveograph W value was also increased by 2.7-fold in line T590 compared to the control line. These transgenic lines are of value for studying the contribution of specific HMW-GS to wheat flour functional properties.     

栽培大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）全长cDNA的克隆及原核表达

根据NCBI中发表的大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）序列（AF303939-1）设计特异引物,以吉农13大豆为实验材料,采用Trizol法提取叶片总RNA,通过RT-PCR克隆大豆rbcS的cDNA。将该基因与原核表达载体pET-30a（+）连接,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,双酶切鉴定后筛选阳性克隆,测序结果显示：rbcS全长 696bp,其中开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸;选择含大豆rbcS cDNA阳性克隆菌液IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,诱导表达出分子量为29.1kDa的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符。诱导7h蛋白表达量最高,为64.15%。