GFP标记的尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染西瓜过程观察

将绿色荧光蛋白基因转入西瓜尖孢镰刀菌FON中,并利用荧光共聚焦显微镜观察GFP标记菌株侵染西瓜的过程.结果显示,转化子连续转接4代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入菌株FON中;利用GFP标记菌株在荧光共聚焦显微镜下观察其侵染西瓜苗的过程,发现在1/2 MS培养的西瓜苗中,FON经过48 h侵染即可进入西瓜的根维管束,第3天便进入茎维管束,第4天进入叶维管束(包括叶柄和叶脉);在土壤盆栽条件下,侵染后2d FON进入西瓜的根维管束,第9天进入茎维管束,第11天进入叶维管束.培养基培养与土壤盆栽相比,培养基栽培FON侵染的速度更快.     

芒果尖孢炭疽病病原菌的绿色荧光蛋白基因标记

芒果炭疽病是世界性的主要病害之一,引起芒果炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌2种。通过溶壁酶酶解菌丝体成功制备尖孢炭疽菌原生质体,用抗潮霉素基因作为选择标记,采用PEG介导的原生质体转化法,用绿色荧光蛋白表达载体(pCT74-sGFP)转化原生质体,获得表达GFP尖孢炭疽菌的转化子菌株;转化子菌株在含潮霉素平板上经多次单孢纯化后,在无选择压下连续继代培养仍能发出稳定而强烈的绿色荧光,用GFP特异性引物PCR扩增转化子菌株基因组DNA获得预期大小片段,表明gfp基因已成功导入芒果炭疽病病原菌基因组中,且稳定遗传;GFP标记菌株生长正常,致病性和野生型菌株无明显差别,这为进一步研究该病菌在自然界的生物学及侵染方式奠定了基础。     

借助ITS序列用GFP标记巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌

由多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)侵染引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是影响橡胶树产胶量的主要病害之一。为了开展该病原菌在活体叶片中的病理学研究,本实验将绿色荧光蛋白gfp基因表达盒插入了多主棒孢菌经定点突变后的ITS序列中,构建了重组质粒p ITGH,并经PEG介导转化了原生质体,获得了GFP标记的多主棒孢菌转化子,所获得的转化子经过连续7次转接培养后仍能在分生孢子、分生孢子梗、芽管和菌丝中稳定地发出强烈的绿色荧光,其生长特性和致病性与野生菌株无明显差异。     

海南桑树青枯病病原菌鉴定及其分子鉴定

桑树青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的细菌性病害,热带、亚热带地区发病严重,严重影响蚕桑产业的可持续发展。雷尔氏菌不同种间致病力和宿主各不相同,其防治策略也相应不同,准确地分离鉴定病原菌是青枯病有效防控的先决条件。本研究采集、分离了海南省琼中县桑青枯病发病桑园（‘桂桑优62’）桑树根部、茎部病原菌,并通过致病性、生理小种、生化变种测定,结合16S rDNA、特异性引物、复合PCR检测体系、序列变种等分子鉴定方法初步确定了病原菌的种类和分类地位。结果表明,引发海南省琼中县桑青枯病的病原菌属于青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、生理小种5（race 5）、生化变种Ⅴ（biovar Ⅴ）,病原菌遗传进化分析结果显示病原菌属演化型Ⅰ（phylotype Ⅰ）即亚洲分支菌株,序列变种12（sequevar 12）。这些结果将为海南桑青枯病的有效防控奠定基础。     

引起广西桑树“褐枯”的病原菌及致病机制研究

对广西地区的桑树发病初期叶片褐枯情况进行调查，通过收集桑树病株并进行分离。结果表明，得到优势菌株42株，各菌株形态基本一致。对分离到的菌株进行16S rDNA序列鉴定，比对后发现所有菌株序列均与劳尔氏青枯菌Ralstonia solanacearum（RS）相似度达99％，生化型分析结果显示主要为生化Ⅰ型。随机选择10个菌株进行致病力实验，结果表明，各菌株均具有致病性，部分菌株致病率达90％以上。其后利用扫描电镜观察青枯菌侵染桑苗过程，发现侵染后期桑根木质部导管内聚集大量菌体，堵塞整个导管。上述结果表明：广西地区桑树“褐枯”症状病害属于桑树青枯病，病原菌为劳尔氏青枯菌RS，其致病机制是通过在桑根木质部导管内大量定殖，堵塞导管阻止水分运输，最终导致植株枯萎死亡。     

青枯病菌研究进展

细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种世界范围的细菌性土传病害,广泛分布于热带、亚热带及部分温带地区。青枯病菌寄主广泛,可侵染50多个科的200余种植物,给作物生产带来巨大损失。充分了解青枯病菌是进行青枯病防治的重要前提。本文从青枯病菌的菌群分类、基因组结构、致病机制与致病途径、病菌检测等方面做了系统的阐述,并对基于青枯病菌及寄主植物基因组序列信息,研究和探讨青枯病菌致病机制与青枯病防治进行了展望。     

番石榴叶挥发油的抗菌性及优化提取研究

分别由酸疮痂链霉菌（Streptomyces acidiscabies, SA）、茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum, RS）和胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora Borgey, ECCB）引起的植物疮痂病、青枯病、软腐病是农作物生产中常见多发的细菌病害。番石榴叶挥发油由多种活性物质组成，具有广谱抗微生物活性。本研究旨在提取并配置番石榴叶挥发油抗菌液，针对酸疮痂链霉菌、茄科雷尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌等3种病原菌进行挥发油的抗性研究，为农作物病害生物防治储备资源。采用添加锂盐结合微波辅助水蒸馏法提取番石榴叶挥发油，通过滤纸片扩散法和最小抑制浓度（MIC）评价了番石榴叶挥发油对3种供试菌株的抗菌效果，单因素结合响应面试验优化提取工艺，采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）测定番石榴叶挥发油的化学成分。结果表明：番石榴叶挥发油对酸疮痂链霉菌、茄科雷尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌均表现出良好的抑制效果，抑菌圈直径范围为20.57～23.24 mm，抑菌率均达到60%以上，MIC值分别为3.13、1.56、3.13...     

几株尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白基因转化

利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白基因转入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。结果表明：转化子连续转接5代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入到菌株中,为后续研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可视化的检测和分析手段。     

一个辣椒PHD-finger家族转录因子CaPHD1的克隆及其表达分析

以辣椒均一化cDNA文库为模板,通过PCR扩增获得CaPHD1基因克隆,该基因序列含有1个220个氨基酸序列的开放阅读框,同其他植物具有62%~89%的氨基酸同源性。在植物亚细胞定位实验中CaPHD1与GFP的融合蛋白定位于细胞核;实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因受到青枯菌侵染和水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯和脱落酸等外源激素的诱导,表明CaPHD1可能在应答病原菌中起重要的作用。     

橡胶树尖孢炭疽菌绿色荧光蛋白（GFP）标记转化株的获得

建立了根癌农杆菌介导转化橡胶树尖孢炭疽菌(Collectotrichum acutatum)获得T-DNA插入突变体的体系:在尖孢炭疽菌孢子浓度10~6个/mL、农杆菌浓度OD_(600)=0.15～0.2后在200μmol/mL的乙酰丁香酮(AS)诱导6 h,共培养48 h.转化效率可达150～300个/10~6个分生孢子.获得的转化子通过PCR检测绿色荧光蛋白基因、Southern 杂交验证、分生孢子的荧光观察,结果表明:被测转化子基因组中确实整合了目的片段,成功获得了橡胶树尖孢炭疽菌菌株CHY-1绿色荧光蛋白标记转化子.     

紫肉甘薯新品种‘莆紫薯3号’选育及特性鉴定

莆紫薯3号是以日清1号和台引2号为亲本,经杂交选育而成的紫肉甘薯新品种,2005年通过国家甘薯新品种鉴定（鉴定编号：国品鉴甘薯2015016）。对莆紫薯3号的形态特征、品质、抗病性、生产力和产量形成的生理特点等进行了研究,结果表明：莆紫薯3号地上部长势平稳,茎叶不易早衰,生育期应保持在150 d以上;鲜薯和薯干产量分别比对照宁紫薯1号增产7.51%和14.35%;薯块干率27.73%,比对照高1.88%;食味评分75.4分（对照为70分）,优于对照;薯块粗蛋白和可溶性糖高于对照,还原糖低于对照;中抗蔓割病,中感薯瘟Ⅰ型,感薯瘟Ⅱ型。     

不同丛枝菌根真菌种类对生姜生长的影响

研究盆栽条件下,接种不同丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi, AMF）种类对生姜不同生育时期农艺性状的影响及其在生姜根内的定殖情况。采用生姜组培苗,于幼苗期分别接种12株AMF进行生姜农艺性状比较试验,在温室盆栽接种后每隔30 d对生姜根系进行取样分析,比较菌根侵染率、侵染强度和丛枝丰度的大小,以观察不同AMF菌株对生姜苗的侵染动态。结果表明,所有接种AMF组的生姜植株,其生长量均高于空白对照组。结合不同菌株在根系的侵染率,筛选出生姜AMF优势种类为：细凹无梗囊霉（Acaulospora scrobiculata）、网状球囊霉（Glomus reticulatum）、隐形球囊霉（Paraglomus occltum）、摩西球囊霉（Glomus mosseae）。说明苗期接种这4个优势菌种,能够促进生姜生长,是适宜生姜生长的优良AMF菌株。     

嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲幼虫的室内致死能力测定

为探讨利用昆虫病原线虫嗜菌异小杆线虫H06品系防治红棕象甲的可行性,在室内研究了该线虫对红棕象甲幼虫的致死效果和毒力水平。采用微量点滴法测试线虫不同施药剂量和施药时间对红棕象甲3龄幼虫的致病效果,并观察处理后红棕象甲幼虫的形态学特征变化。嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲具有一定的致死作用,随着线虫接种剂量的增加,红棕象甲死亡率增加;毒力测定结果显示,随着处理时间的延长,红棕象甲幼虫的LD₅₀呈现降低的趋势,同时随线虫接种剂量的提高,LT₅₀逐渐缩短;形态学观察结果显示,红棕象甲幼虫被嗜菌异小杆线虫H06品系感染后,虫体呈现出僵硬皱缩、体色变褐、身体肿胀直至最后虫体腐烂、线虫游离而出的现象。实验结果表明,嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲低龄幼虫具有一定的防控潜力。     

长春花接种丛枝菌根真菌对柑橘黄龙病菌的抑制效果

通过筛选获得具有显著促生和抗病能力的AM真菌菌株,为防治柑橘黄龙病提供理论依据和基础,并探索防治新途径。采用盆栽法,于长春花幼苗期分别接种17株AM真菌进行长春花农艺性状和对柑橘黄龙病的抗病性比较试验,研究不同丛枝菌根真菌菌株对长春花的促生效果及对柑橘黄龙病的抑制效果。结果表明,长春花接种AM真菌后,菌株GZ10、GZ5和JX70能显著促进植株生长,其中接种GZ10的株高和茎径分别比CK增加了23.1%和12.1%,接种GZ5的叶片数比CK增加了12.9%;接种菌株GZ1、BNMJ和PWJ有效提高了长春花对柑橘黄龙病的抗病和耐病能力,其相对防效分别为78.39%、66.87%和69.75%。     

接种AM真菌对脱毒马铃薯产量的影响

在苗盘和大田条件下研究了接种丛枝菌根真菌对脱毒马铃薯菌根侵染率和产量的影响。在苗盘试验条件下,接种Glomus mosseae(BEG167)和Glomus versiform(G.v)2种菌种。在灭菌土壤中,接种BEG167和G.v,脱毒马铃薯侵染率分别达到27%和32%;BEG167使组培脱毒苗移栽生成的微型薯产量比不接种处理增加54.2%。未灭菌土壤上接种BEG167和G.v,侵染率则分别为44%和27%,而对照的侵染率为22%;接种BEG167使组培脱毒苗移栽生成的微型薯产量比不接种处理增加25.2%;在灭菌和未灭菌土壤条件下,接种G.v均降低了组培脱毒苗移栽生成的微型薯产量。在大田试验条件下,采用混合菌种(BEG167+G.v,体积比1:1)作为接种剂。接种菌根菌剂使脱毒马铃薯侵染率由21%提高到47%,薯块产量增加21%。上述结果证明,在苗盘和大田条件下,接种菌根真菌都能侵染马铃薯根部,并能增加产量。     

核盘菌接种不同抗性油菜后致病力分化的研究

为了解核盘菌致病力分化与寄主油菜品种抗性的关系,采用茎秆牙签接种法将单一核盘菌菌株接种至46份抗性表现不同的油菜品种茎秆上,再从46个接种茎秆内收集形成的菌核进行纯化和培养,获得46株核盘菌菌株,进而采用两种方法(室内离体叶片接种法和离体茎秆接种法),分别测定这46株核盘菌菌株对甘蓝型油菜品种黔油16号的致病能力。结果表明:不同核盘菌菌株在黔油16号上所致的病斑长度明显不同;相同来源菌株经两种接种方法所致病斑在长度上反映出的致病趋势一致,基本表现为中感﹥高感﹥低感﹥抗性。即来自油菜品种为"抗"类型上的对应菌株其致病力最弱,而来自"中感"类型上的对应菌株其致病力最强。结果说明核盘菌致病力强弱分化与油菜品种的抗性有关系。     

木薯根系分泌物与土壤浸出液对橡胶树2种致病菌的化感效果

采用平板试验,通过生长速率法分析木薯根系分泌物及其土壤浸出液对橡胶树白根病病菌及棒孢霉落叶病病菌的化感效果,为判断胶园林下种植木薯的可行性提供理论依据。结果表明：（1）木薯根系分泌物对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌均表现为化感促进效果,但在任一处理时间,不同浓度间对白根病病菌的化感效果与对照均未达显著差异,而对棒孢霉落叶病病菌的化感效果呈现明显的剂量效应,浓度达40 mg/mL时,化感促进效果与对照达到显著水平。（2）木薯根系分泌物的任一浓度,对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌的化感效果,在不同处理天数间均未达到显著水平。（3）木薯土壤浸出液对橡胶树白根病和棒孢霉落叶病病菌均呈现化感促进效果,且存在明显的剂量效应;对橡胶树白根病病菌,处理后2 d,达到显著化感效果所需浸出液浓度至少为40 mg/mL,处理后3 d和处理后4 d,达到显著化感效果所需浸出液浓度至少为8 mg/mL;对棒孢霉落叶病病菌,在任一处理时间达到显著化感效果的浸出液浓度均至少为200 mg/mL。（4）土壤浸出液小于8 mg/mL时,3个处理时间之间的橡胶树白根病病菌化感效果无显著差异,当浓度达到40 mg/mL时,处理后2 d的化感促进效果显著大于处理后3 d和4 d;4种土壤浸出液的任一浓度,对橡胶树棒孢霉落叶病病菌的化感效果在不同处理时间之间均未达到显著差异。所以说,幼龄胶园间作木薯会在一定程度上促进橡胶树棒孢霉落叶病和白根病的发生。     

14种AM真菌对枳生长的影响

在盆栽条件下,以柑橘砧木枳（Fructus aurantii）幼苗为试验材料,在基质中接种从广西土壤中分离得到的不同丛枝菌根（AM）真菌菌株,探讨不同AM真菌对枳根系的侵染能力和植株生长的影响。结果表明：用于试验的14个AM真菌菌株均能与枳根系形成共生关系,平均侵染率为36.16%,其中侵染率最高的菌株是黄雷德克囊霉（Redeckera fulvum, Rf）,侵染率高达92.83%,侵染率最低的菌株是副冠球囊霉（Glomus coronatum, Gc）,侵染率仅为0.23%;接种黄雷德克囊霉、摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae, Fm2）和副冠球囊霉这3个菌株处理的枳植株的株高、茎粗、叶片数和叶柄长均高于CK,是枳的优势菌株,能促进枳的生长。     

持有Pi9基因的水稻单基因系IRBL9-W对稻瘟病菌苗期和成株期抗性差异

【目的】Pi9是一个广谱稻瘟病抗性基因,田间病圃监测发现持有Pi9的水稻单基因系IRBL9-W在苗期高抗稻瘟病,但却感穗瘟。探明水稻单基因系IRBL9-W在苗期抗病而孕穗末期感染穗颈瘟的原因,为Pi9基因在水稻抗病育种中的有效利用提供参考。【方法】利用从IRBL9-W穗颈瘟病斑上分离的8个单孢菌株以及实验室保存的单孢菌株Y363,在温室分别对单基因系IRBL9-W苗期和孕穗末期进行接种鉴定;并利用病原菌AvrPi9基因的特异引物对9个单孢菌株进行PCR扩增及产物测序;提取水稻单基因系IRBL9-W苗期叶片和抽穗期穗部的总RNA,通过半定量RT-PCR以及实时qRT-PCR分析Pi9基因在苗期和穗期的表达。【结果】在温室人工喷雾接种条件下,IRBL9-W在苗期对从穗颈瘟上分离的8个单孢及对照菌株Y363均表现为抗病;随机选取的2个从IRBL9-W穗颈瘟病样分离的单孢菌株(YX2-7-1和YX2-15-1)及对照菌株Y363对孕穗末期IRBL9-W注射接种,接种的植株表现出典型的穗颈瘟症状;AvrPi9的等位基因分析结果表明,与AvrPi9相比,Y363中的等位基因与AvrPi9完全相同,而从IRBL9-W穗瘟分离的8个单孢菌株中编码区与AvrPi9基因完全相同,但在编码起始位置上游-264 bp处缺失16 bp的一段序列。由于IRBL9-W苗期对这些菌株均表现抗病,推测这段序列的缺失并不影响AvrPi9基因的功能;实时qRT-PCR分析结果表明,Pi9基因在穗部的表达量为苗期叶片表达量的47.3%。【结论】在水稻单基因系IRBL9-W中,与苗期叶片中Pi9基因的表达量相比,Pi9基因在穗部表达量的明显降低可能是造成IRBL9-W穗期感稻瘟病的原因。