巨桉EgrWOX5基因的克隆、表达分析与超表达载体构建

以巨桉(Eucalyptus grandis)EG5无性系为试验材料,通过RT-PCR技术从中克隆得到了1个巨桉WOX家族基因成员的CDS序列,命名为Egr WOX5(Gen Bank登录号为KF964019)。该基因全长为543 bp,编码181个氨基酸,具有WOX基因家族最保守的特征结构域-Homeobox domain(HD)结构域;其氨基酸序列与草本植物的拟南芥At WOX5基因和木本植物杨树Ptr WOX5基因的氨基酸序列有较高的相似性。组织表达分析结果显示,Egr WOX5基因特异性地在巨桉EG5的根组织中表达。这些结果间接或直接地说明Egr WOX5在巨桉根组织的发育过程中发挥重要作用。本研究还利用Gateway技术成功构建了Egr WOX5基因的超表达载体,为后续基因功能的进一步鉴定奠定基础。     

大豆转录因子GmWRKY4分子克隆与表达分析

为研究WRKY家族基因在大豆抵御非生物胁迫中的生物学功能及其作用机制,利用铁丰29,获得了大豆WRKY家族基因GmWRKY4的开放阅读框序列,并对其在不同非生物胁迫处理下的表达模式进行了分析。结果表明,GmWRKY4开放阅读框为1 083 bp、编码360个氨基酸残基;对其编码蛋白GmWRKY4进行保守域及同源性分析发现,属于WRKY转录因子家族第1类,与GsWRKY4高度同源;分析GmWRKY4与拟南芥WRKY转录因子系统进化树发现,与At WRKY3、At WRKY4相似性最高;进一步分析该基因在盐(NaCl处理)、干旱(PEG处理)与低温胁迫处理下的表达模式发现,GmWRKY4可参与对上述3种非生物胁迫的响应;同时分析基因在乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)等激素处理下的表达模式发现,GmWRKY4可通过参与ACC、SA、JA信号通路实现对逆境胁迫的响应,为进一步深入研究该基因生物学功能及其作用机制奠定了基础。     

巨尾桉EuGR1基因的克隆及其低温胁迫下的表达特性分析

本研究通过反转录PCR方法克隆了巨尾桉谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,简称GR）基因,该基因定位于巨尾桉细胞质、长度为1485 bp,在NCBI申请基因注册（GenBank Accession Number KU904639）。构建了pET-EuGR1原核表达载体,酶活检测表明转化菌株GR活性较高。利用实时定量 PCR分析巨尾桉EuGR1的时空表达特性,结果表明：EuGR1的表达量随着巨尾桉叶片的成熟而降低,在幼叶中表达量最大,近根部的叶片表达量最低;在巨尾桉组培苗中,EuGR1在茎中表达量最大,叶中表达量较低,根中表达量最低。通过转基因抗寒巨尾桉温室苗研究EuGR1基因在低温胁迫下的表达模式,发现常温和低温胁迫下耐寒性强的株系其EuGR1的表达量较高（如P40、P41、P52）,耐寒性弱的株系其EuGR1的表达量较低（如P36、F44、F76）,说明巨尾桉EuGR1的表达量与植株的抗寒能力具有相关性。随着低温胁迫时间的延长,EuGR1的表达量在36 h后出现降低趋势,表明EuGR1在桉树耐低温胁迫的前期发挥作用较大。     

盐胁迫下玉米WRKY转录因子生信及表达分析

WRKY是一类在逆境胁迫响应中起重要调控作用的转录因子。基于盐胁迫下的玉米转录组数据,确定了16个差异表达的WRKY基因家族成员。利用生物信息学方法对各成员理化性质、染色体分布、蛋白保守结构域、系统进化、顺式作用元件及盐胁迫下的相对表达量进行分析验证。结果表明,16个差异表达的WRKY基因家族成员主要分布在玉米的7条染色体上,各成员之间理化性质存在差异。qRT-PCR 验证结果表明,不同基因家族成员对盐胁迫的敏感程度不同,对胁迫处理时间的响应也有所不同。ZmWRKY106、ZmWRKY108、ZmWRKY91、ZmWRKY27在盐胁迫后24 h内均未参与表达,经盐胁迫处理6 h后ZmWRKY63表达量达到最高。各家族成员对盐胁迫的响应及敏感程度不同,可能与各成员间理化性质和结构的差异以及所含的顺式作用元件、内含子和motif类型有关。     

磷胁迫对不同桉树品种酸性磷酸酶活性的影响

通过土培试验对磷胁迫条件下不同桉树品种酸性磷酸酶(APA)活性和桉树苗高、地径进行了比较研究.结果表明:1)在缺磷条件下桉树叶片和根际的APA活性明显高于正常供磷处理,而且随胁迫程度时间的延长,APA活性逐渐增大.不同桉树品种APA的变化规律不同,其中巨赤桉、尾赤桉、邓恩桉在磷胁迫条件下APA活性增加较快;巨桉和巨细桉增加缓慢;而缺磷环境对其根际和叶片APA活性不造成显著影响;尾细桉和尾巨桉介于以上二者之间,磷胁迫强度与不同桉树品种APA活性显著相关.2)磷胁迫对不同桉树品种苗高、地径影响表现为巨赤桉、尾赤桉、邓恩桉最大;尾细桉和尾巨桉次之;巨桉和巨细桉最小.这充分说明在磷胁迫条件下,桉树可通过叶片及根际APA活性的增强来适应缺乏磷环境,但不同桉树品种对磷缺乏的适应性存在明显差异.能否将APA活性作为评价桉树耐低磷特性的指标仍需结合大田试验进一步研究论证.     

玉米泛素结合酶基因ZmUBC-76的功能分析

通过生物信息学方法,从玉米基因组中得到1个泛素结合酶家族基因序列,将其命名为ZmUBC-76。该基因序列开放阅读框为2 589 bp,编码的蛋白具有862个氨基酸,其分子量为98.91 ku,理论等电点为8.07。预测定位于细胞核。荧光定量PCR分析表明,该基因具有组织表达特异性,在根和幼果中的表达量最高,在穗丝中表达最低。非生物胁迫表达分析结果表明:在盐胁迫和干旱胁迫下,ZmUBC-76的表达呈逐渐下降趋势,在处理24 h时达到最低;在低温胁迫时,ZmUBC-76的表达量未出现显著变化。上述结果表明,ZmUBC-76可能参与了植物对盐和干旱胁迫的响应。     

小麦耐盐相关基因TaHAK1的克隆与表达分析

为了解小麦品种山融3号耐盐性的基因状况,以大麦HvHAK1为探针,通过电子克隆和PCR方法,从该品种根的cDNA文库中克隆到一个小麦的耐盐相关基因TaHAK1（High Affinity K＋transporter1）。该基因ORF全长2 405bp,编码776个氨基酸,含有8个内含子。与已报道的大麦、水稻、玉米等单子叶植物的HAK基因具有较高的相似性。RT-PCR分析表明,TaHAK1在小麦根中表达量较高,且受钾饥饿和盐胁迫诱导表达。在200mmol.L-1 NaCl胁迫条件下,TaHAK1在耐盐小麦品种山融3号中的最高表达量高于在盐敏小麦品种济南177中的最高表达量。这些结果说明,在小麦中克隆到了大麦HvHAK1的同源基因,该基因参与了小麦对高盐、低钾等非生物胁迫的响应,可能对山融3号的耐盐性具有一定贡献。     

大豆RNA依赖的RNA聚合酶基因GmRDR1的克隆与表达特性分析

为了寻找大豆抗病新基因,培育大豆新型抗性品种,利用同源克隆的方法从大豆品种科丰1号中分离出1个新的GmRDR1基因,并对其进行序列分析,组织表达、抗逆境胁迫表达分析及该基因的亚细胞定位研究。结果表明:GmRDR1基因位于大豆基因组的第2号染色体,基因全长为3 956 bp,其中ORF为3 378 bp,编码1 125个氨基酸,相对分子量和等电点分别为279.72×103和4.63;GmRDR1含有RDRs家族的保守序列"DLDGD";该基因在所有被检测组织中均表达,并且在叶中的表达量最高;荧光定量结果发现:在大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)处理下,GmRDR1在抗病材料科丰1号中的表达量显著高于感病材料南农1138-2。盐及干旱胁迫下,48 h之内,该基因的表达量明显升高,SA诱导条件下该基因在6 h出现了早期响应,冷害处理下24 h表达量出现了突然的升高。GmRDR1基因的亚细胞定位结果表明:该基因所编码的蛋白定位在细胞核里。根据以上结果判定GmRDR1基因参与了大豆对SMV的抗性反应,并且能够强烈响应盐和干旱的胁迫,因此该基因在大豆抗逆分子育种中具有较好的应用价值。     

大豆GmPUB32基因的克隆及耐盐功能分析

泛素化系统通过介导蛋白质的翻译后修饰,参与包括细胞分化、激素应答、生物与非生物胁迫响应等多个生物学过程,其中含有U-box基因的泛素连接酶为泛素化系统的重要酶之一。课题组前期研究发现大豆Glyma.13G115900(GmPUB32)基因编码一个泛素连接酶(PUB),其表达量在根中受盐胁迫影响显著。本研究在大豆品种垦丰16中克隆得到大豆U-box家族基因GmPUB32,序列分析结果表明GmPUB32基因的开放阅读框长度为513bp,编码170个氨基酸,在其83-131个氨基酸之间含有一个RING/U-box保守结构域;亚细胞定位分析结果显示GmPUB32蛋白定位于细胞膜与细胞质中;GmPUB32基因在大豆根、茎、叶片与荚果中均能检测到不同程度的表达,在根中表达量最高,GUS组织化学染色进一步明确其在根中发挥主要作用;荧光定量PCR分析结果显示,在200 mmol/L NaCl处理后,与对照相比随着处理时间的延长GmPUB32在根中的表达量呈现出显著的下降趋势,表明GmPUB32可能参与大豆对于盐胁迫的应答过程;通过对过表达GmPUB32的T3拟南芥的盐胁迫耐受性进行分析,结果表明转基因拟南芥的萌发率、子叶绿化率与盐胁迫下的存活率均明显低于野生型,此外,GmPUB32过表达转基因毛状根的生长速率相比野生型也明显受到抑制。由此推断,GmPUB32可能作为负调控因子参与大豆对于盐胁迫的应答过程,降低植物对于盐胁迫的耐受性。     

稀土铈诱导玉米根尖细胞hsp70 mRNA表达研究

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以总RNA作为模板两步法扩增hsp70。设置阳性(热应激)和阴性(蒸馏水培养)对照组,以actin为内参,研究硝酸铈[Ce(NO3)3]胁迫(浓度为1、4、16、64、256mg/L)下玉米根尖细胞hsp70 mRNA表达量的变化。结果表明,Ce(NO3)3各处理组的hsp70 mRNA的表达量高于阴性对照组,1～64mg/L处理组hsp70 mRNA的表达量低于阳性对照组,256mg/L处理组hsp70 mRNA的表达量高于阳性对照组,说明Ce(NO3)3可诱导玉米根尖细胞中hsp70 mRNA的表达。     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

异源表达玉米ZmWRKY11基因增强拟南芥对盐胁迫的耐受性

从玉米中分离得到响应高盐胁迫的WRKY基因,将其命名为ZmWRKY11。构建过量表达载体pCAMBIA1301-ZmWRKY11,采用花序侵染法转化拟南芥,研究ZmWRKY11基因的生物学功能,扩繁后对T3代转基因植株进行耐盐鉴定试验。结果表明,转基因株系的绿苗率在盐胁迫处理后显著高于野生型拟南芥,同时,野生型株系中丙二醛含量和相对电解质渗透率相较于转基因植株发生了更为显著的上升,但脯氨酸含量的上升幅度则小于转基因株系。结果表明,ZmWRKY11在拟南芥中的异源过表达增强了转基因植物对盐胁迫的耐受性。     

橡胶树胶乳WRKY家族转录因子HbWRKY27基因的克隆与表达分析

从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了1个WRKY转录因子家族成员基因,命名为HbWRKY27,该基因含有1个1 266 bp的开放阅读框(ORF),编码422个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbWRKY27含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序,属于II类WRKY家族成员,与大豆、油棕、麻风树、葡萄和拟南芥的WRKY27蛋白的同源性分别为81%、74%、63%、62%和58%。酵母转化试验表明,HbWRKY27具有转录激活活性。实时荧光定量RT-PCR分析显示,HbWRKY27基因在健康橡胶树树皮组织中表达量最高,但在死皮橡胶树树皮组织中的表达量随着死皮程度的增加而下降,而在死皮橡胶树胶乳中HbWRKY27基因表达量则随着死皮程度的增加而升高;割胶、乙烯利和茉莉酸甲酯刺激都可显著促进胶乳HbWRKY27基因上调表达。转录因子HbWRKY27可能在割胶和乙烯等调控橡胶树胶乳代谢中发挥重要作用,并且还可能与橡胶树死皮病的发生相关。     

玉米ZmGAPDH2基因的克隆及表达特性分析

研究通过同源比对查找GAPDH基因的保守区,运用逆转录PCR和同源克隆技术从玉米叶片中克隆出GAPDH2基因的全长cDNA序列。采用qRT-PCR分析两个玉米品种登海605和蠡玉35幼苗叶片中GAPDH2基因在非生物胁迫和ABA 处理下的表达特性,利用二维凝胶电泳（2-DE）和基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法（MALDI-TOF）,对登海605和蠡玉35幼苗在干旱胁迫下叶片中的GAPDH蛋白表达水平进行分析。结果表明,ZmGAPDH2基因开放阅读框（ORF）全长1 014 bp,编码337个氨基酸。ZmGAPDH2蛋白分子量为36.53 kDa,属于亲水性蛋白。生物信息分析发现,玉米 ZmGAPDH2 蛋白和单子叶植物小米 GAPDH2 蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94.66%。qRT-PCR分析表明,ZmGAPDH2在登海605和蠡玉35叶片中均能被ABA和PEG处理诱导表达,登海605在NaCl和蠡玉35幼苗在低温处理下其表达量均有所下降。干旱对登海605和蠡玉35幼苗叶片中ZmGAPDH2蛋白表达量也有影响。     

油菜黑胫病抗性相关基因BnWRKY70的功能研究

WRKY转录因子是植物信号传导过程中的重要成员,在植物抗病过程中发挥着重要作用。为了解BnWRKY70在油菜黑胫病抗性反应中的作用机理,本研究对油菜响应黑胫病菌侵染产生的特异基因BnWRKY70进行序列分析;将克隆得到BnWRKY70基因CDS 308bp特异区段,利用烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）载体构建了基于病毒诱导的油菜基因沉默体系;利用qRT-PCR验证目的基因的表达水平;最后进一步通过表型观察和病情指数统计分析评价BnWRKY70基因沉默植株在接种黑胫病菌之后油菜的抗病性。结果表明,BnWRKY70基因最长ORF为858bp,编码285个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域,属于Ⅲ类WRKY转录因子。BnWRKY70基因沉默后的表达量显著下降,说明在油菜中成功构建了VIGS体系。表型观察发现基因沉默油菜株系叶片比未沉默株系更易感病,病斑面积更大,且病情指数显著高于对照,说明BnWRKY70基因沉默减弱了油菜的抗病性。本研究为揭示BnWRKY70在油菜病原菌分子互作机制中的作用奠定基础。     

橡胶树HbWRKY3的克隆及其响应逆境胁迫的表达分析

通过RACE技术扩增获得橡胶树HbWRKY3基因,并对该基因及其所编码氨基酸序列进行生物信息学分析和响应逆境胁迫的表达分析,结果表明：该基因含有2个WRKYGQK结构域和2个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅰ类;由4个外显子和3个内含子组成,DNA序列全长3 780 bp;开放阅读框长度为2 211 bp,编码由737个氨基酸组成的多肽。该基因定位于细胞核中,在橡胶树叶片、树皮、花、胶乳等不同组织中都有表达,以花中的表达水平最高。盐、PEG、茉莉酸、水杨酸等非生物胁迫均可诱导HbWRKY3的表达,但干旱、ABA、乙烯和低温胁迫的诱导较为明显。     

偃麦草ErABF1基因克隆及功能分析

抗逆相关bZIP (Basic leucine zipper) 转录因子家族基因主要参与ABA、干旱、高盐等胁迫应答反应,其过表达能够显著增强植物的抗逆性。本研究从偃麦草（Elytrigria repens L.）中分离到一个抗逆相关 ErABF1（E. repens ABA Binding Factor 1）基因,氨基酸序列比对分析发现,该基因与小麦、玉米、拟南芥等bZIP转录因子基因同源性较高,亲缘关系较近;ErABF1基因的表达受到ABA、干旱、高盐、低温的强烈诱导;在2% PEG、200 mmol·L^-1 NaCl胁迫培养基上初步功能分析表明, ErABF1过表达提高了转基因烟草对干旱、高盐的胁迫耐性。     

野生大豆转录因子GsWRKY57 的克隆与抗旱性功能分析

WRKY转录因子是近年来在植物中发现的一类重要转录因子，在植物抗逆相关过程中发挥重要作用。本研究通过对野生大豆转录组数据进行分析，从野生大豆中克隆得到GsWRKY57 基因的CDS序列。该基因开放阅 读框为903bp，编码300个氨基酸残基，分子量为34.23kD，等电点为5.88。氨基酸序列分析显示该蛋白含有一个 WRKY保守结构域，属于III类WRKY转录因子。系统发育树分析表明该蛋白与栽培大豆同源性最高、其次是赤豆、木豆。启动子作用元件分析预测显示该基因可能存在多种非生物胁迫作用元件。组织特异性表达分析表明该基因在大豆叶片中高丰度表达，然后依次是茎、花、荚、根。GsWRKY57 基因表达受茉莉酸、水杨酸、脱落酸、干旱等 植物逆境诱导。过表达GsWRKY57 基因的转基因拟南芥植株相对于野生型耐旱能力增强。