普通小麦TaSEC14p-5基因的克隆及表达分析

磷脂酰肌醇转运蛋白Sec14是最先在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的磷脂酰肌醇转运蛋白,含有一个典型的SEC14保守结构域.S0ec14p磷脂酰肌醇转运蛋白广泛存在于真核生物细胞中,并参与膜运输途径、质膜发育、脂肪酸代谢、根毛的生长等生命活动,但未见此蛋白在作物逆境胁迫的有关报道.为研究Sec14p基因在小麦(Triticum aestivum)发育及逆境胁迫中的功能,本研究采用电子克隆方法从小麦京花9号中得到一个Sec14p基因,命名为TaSEC14p-5 (GenBank登录号:KU639968).氨基酸序列分析表明,该基因ORF全长为984 bp,编码327个氨基酸,相对分子质量为37.1 kD,理论等电点为7.70.在植物中该蛋白有典型的SEC14类基因家族保守域SEC14和一个CRAL_TRIO_N结构域.进化和聚类分析表明,小麦TaSEC14p-5基因与粗山羊草(Aegilops tauschii)磷脂酰肌醇转运蛋白AeSEC14p基因和水稻(Oryza sativa)磷脂酰肌醇转运蛋白Os02g0200000基因亲缘关系较近,蛋白相似度分别为96.45％和88.38％.采用qRT-PCR技术,对小麦孕穗期不同组织和不同非生物胁迫幼苗进行表达分析.发现该基因在根、茎、叶、颖壳、雄蕊和种子中均有表达,且在茎中表达量较高,雄蕊次之,根最低;该基因受高盐的强烈诱导,同时也受到脱落酸(abscisic acid,ABA) (200μmol/L)、干旱(PEG6000)和低温(4℃)不同程度的胁迫诱导.TaSEC14p-5在NaC1、ABA、PEG和4 ℃四种不同胁迫处理下,总体趋势为先上升后下降.结果推测,TaSEC14p-5基因可能参与了NaC1、ABA、PEG6000和4℃等不同程度的非生物胁迫处理,为进一步改良小麦抗逆性等分子机理研究提供了新的依据.     

小麦PHO基因家族全基因组鉴定及表达分析

PHO基因家族主要参与磷酸盐的转运，在植物生长发育中起重要作用。为研究小麦PHO基因家族成员的潜在功能，本研究从小麦全基因组中鉴定PHO基因家族成员，并利用生物信息学手段对其基因结构特征、蛋白结构域、系统进化、顺式作用元件及表达特性进行分析。结果在小麦全基因组中共鉴定到12个PHO基因家族成员，所有成员均含有SPX和EXS结构域。系统进化、保守结构域和基因结构分析发现，小麦PHO蛋白与拟南芥PHO1-H1蛋白以及水稻PHO1蛋白亲缘关系较近；除TaPHO7、TaPHO10、TaPHO11和TaPHO12蛋白缺少部分基序外，其余小麦PHO蛋白均具有完整基序，且同一亚组内的成员具有相似的蛋白保守结构域和基因结构，说明PHO亚家族成员间高度保守。顺式作用元件分析发现，小麦PHO基因启动子区域含有与磷调控相关的激素诱导、光响应、低温响应等元件。基于RNA＿seq数据的组织特异性分析发现，大部分PHO基因在根中的表达量较高。qRT-PCR分析发现，低磷胁迫处理下磷高效小麦品种小偃54地下部分(根) TaPHO7和 TaPHO8基因的表达量显著高于对照。     

小麦糖转运蛋白基因TaSWEET6的克隆与表达分析

植物SWEET基因家族是一类糖转运蛋白,参与生殖发育、衰老、逆境响应等多个生理过程。为研究小麦SWEET基因对逆境胁迫的响应及其在花药发育过程中的功能,采用同源克隆的方法从普通六倍体小麦中克隆出TaSWEET6基因(GenBank登录号为KU936097)后对其进行染色体定位、同源蛋白序列比对和系统进化树分析,同时分析TaSWEET6基因于普通六倍体小麦在正常生长情况下及非生物胁迫条件下不同组织器官中和光温敏雄性不育小麦BS366在不同发育时期的花药中的表达模式。序列分析结果表明,TaSWEET6基因包含1个732bp的完整开放阅读框,编码243个氨基酸。跨膜结构分析得知,TaSWEET6蛋白包含2个Mtn3_slv跨膜结构域和1个起连接作用的跨膜-螺旋。系统进化树分析表明,TaSWEET6蛋白与大麦处于同一分支,其亲缘关系最近。中国春缺四体定位表明,TaSWEET6基因位于7D染色体上。表达分析表明,TaSWEET6基因在小麦根、茎、叶、种子、小花(除去雄蕊)、各时期雄蕊中均有表达,小孢子时期雄蕊表达量最高;在低温、干旱、NaCl和ABA胁迫处理下,TaSWEET6基因表达均有上调;光温敏雄性不育系BS366在不育环境(低温短日照)下,TaSWEET6基因在雄蕊发育关键时期(二分体时期)高度表达。说明小麦TaSWET6基因可能参与了多种逆境应答反应,并在小麦雄蕊发育过程中发挥着重要作用。     

长穗偃麦草EeSnRK2.6基因克隆及生物信息学分析

蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族2(SnRK2)基因家族受各种逆境胁迫诱导表达,在提高植物的抗逆性中发挥着至关重要的作用。为继续深入挖掘有效的抗逆相关基因资源并为转基因小麦提供重要候选基因,基于同源克隆方法从抗旱、耐盐性极强的长穗偃麦草中克隆了EeSnRK2.6基因的cDNA序列,该基因全长1 096bp,编码364个氨基酸,推测分子量为41.73kD,等电点为5.98,是亲水性氨基酸,共有18处磷酸化位点和1处跨膜域。氨基酸序列同源性分析发现,长穗偃麦草EeSnRK2.6基因与其他目前已报道的抗逆效果显著的SnRK2家族基因有较高同源性,同大豆SnRK2.6基因同源性达到95%,且具有典型的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶保守域。系统进化树分析表明,EeSnRK2.6与SbSnRK2.6属于同一进化分枝上。因此,推测该基因属于SnRK2基因家族成员,可能在参与逆境胁迫反应、增强植物的抗逆性中起着重要作用。     

长穗偃麦草EeDREB2基因的克隆与生物信息学分析

为了进一步研究EeDREB2基因的结构和功能特点并为转基因小麦挖掘有效的候选基因,应用同源克隆的方法从长穗偃麦草中克隆出EeDREB2基因,通过生物信息学的手段对EeDREB2基因进行初步的分子特征分析。结果显示,该基因全长1035 bp,编码344个氨基酸,理论上的等电点为4.85,分子量为37485.49 Da,属于亲水性蛋白,有20个磷酸化位点。亚细胞定位预测显示EeDREB2基因定位在细胞核中,表达谱分析预测表明EeDREB2在根、茎、叶、花、种子中都表达,其中叶中表达量最高。同源性分析发现,EeDREB2与TaDREB4B同源性最高。EeDREB2基因的克隆为转基因小麦的抗逆性研究提供了有效资源。     

北京籽种产业科技创新现状调研与发展建议

籽种产业是现代农业的核心,是北京都市型现代农业发展的首要任务。通过对北京籽种产业科技创新的基础与现状进行调研,从人才、技术、信息、资源等方面阐明北京所具备的种业科技创新的实力和地位,分析在全球经济一体化的大形势下北京种业科技创新面临的问题与挑战,探讨北京籽种产业科技创新的途径与思路,提出促进籽种农业发展之建议。     

偃麦草ErABF1基因克隆及功能分析

抗逆相关bZIP (Basic leucine zipper) 转录因子家族基因主要参与ABA、干旱、高盐等胁迫应答反应，其过表达能够显著增强植物的抗逆性。本研究从偃麦草（Elytrigria repens L.）中分离到一个抗逆相关 ErABF1（E. repens ABA Binding Factor 1）基因，氨基酸序列比对分析发现，该基因与小麦、玉米、拟南芥等bZIP转录因子基因同源性较高，亲缘关系较近；ErABF1基因的表达受到ABA、干旱、高盐、低温的强烈诱导；在2% PEG、200 mmol·L^-1 NaCl胁迫培养基上初步功能分析表明， ErABF1过表达提高了转基因烟草对干旱、高盐的胁迫耐性。     

应用GISH与STS标记鉴定小麦-中间偃麦草抗黄矮病端体系

由大麦黄矮病毒引起的小麦黄矮病毒病是一个严重病害，至今在小麦属内还没有发现抗源。中间偃麦草2Ai-2染色体携带一个高抗黄矮病基因，对该基因的染色体臂定位将为制定抗病基因向小麦转移策略，筛选、开发特定的、与抗性连锁的分子标记的研究提供重要信息。本文对由小麦-中间偃麦草二体附加系Z6衍生的3个抗黄矮病端体系进行鉴定，通过分析端体的遗传构成、筛选与端体共分离的STS标记以确定端体在遗传上的染色体臂归属，从而明确BYDV抗病基因的染色体位置。以拟鹅冠草基因组[Pseudoroegneria strigosa (M. Bieb.) Löve，St]DNA为探针，中国春基因组(Triticum aestivum L., ABD) DNA作封阻分别对抗病亲本Z6及抗病端体系N530的根尖体细胞染色体进行原位杂交，结果表明，N530体细胞中有2个端体显示出与Z6中外源染色体2Ai-2短臂相似, 而与长臂不同的杂交信号。以小麦第2同源群的5个RFLP探针的DNA序列为基础，设计了6对PCR引物，对小麦-中间偃麦草二体异附加系、二体代换系和端体系进行扩增，结果表明，基于短臂探针psr126，psr131序列设计的2对引物，可在含有2Ai-2染色体及端体的抗黄矮病材料中特异扩增，而基于长臂探针psr112序列设计的1对引物，可在含有2Ai-2染色体的抗黄矮病材料中特异扩增，但不能在端体系进行特异扩增，证明外源端体为2Ai-2染色体的短臂。本研究不仅将黄矮病抗性基因定位于2Ai-2染色体的短臂上, 而且由RFLP探针psr126、psr131和psr112序列转化的标记STS₁₂₆ (sequence tagged site) STS₁₃₁和STS₁₁₂还可分别作为追踪2Ai-2染色体短臂和长臂的分子标记，用于抗病易位系辅助选择。     

小麦类成束阿拉伯半乳糖蛋白编码基因TaFLA的克隆与表达分析

为研究类成束阿拉伯半乳糖蛋白编码基因Fasciclin-Like Arabinogalactan-protein(FLA)在小麦抗逆境胁迫和花药发育中的作用,利用同源克隆法从小麦中获得1个FLA基因,命名为TaFLA,并对其组织表达特性和逆境胁迫表达特性分别进行了分析。序列分析结果表明,TaFLA基因含有1个1 530 bp的完整开放阅读框,编码509个氨基酸;TaFLA蛋白含有预测的N-末端信号肽,两个Fasciclin结构域(氨基酸205-300、371-474)和两个N-糖基化位点(氨基酸369和487)。系统演化分析结果表明,TaFLA基因与二粒小麦处于同一分支,其亲缘关系最近。荧光定量表达分析结果表明,TaFLA基因在小麦根、小穗(除去雄蕊)、减数分裂前和分裂时期的雄蕊中均有表达,其中,小穗(除去雄蕊)中表达量最高;在低温胁迫处理下,TaFLA基因表达上调,而在干旱、高盐和ABA处理下,表达量均有所下降;温敏雄性不育系BS366在不育环境(低温)下,TaFLA基因在雄蕊发育关键时期(二分体时期)大量表达,约为可育环境(高温)下表达量的29倍。     

小麦多蛋白桥梁因子基因 TaMBF1c的克隆与表达分析

多蛋白桥梁因子(multiprotein bridging factor 1,MBF1)是一类广泛存在于植物中的转录共激活因子,在植物生长发育和逆境响应过程中发挥重要作用。为进一步了解该蛋白的功能,利用同源克隆法从小麦中获得 MBF1基因,根据其染色体位置分别命名为 TaMBF1c-A、 TaMBF1c-B和 TaMBF1c-D,通过生物信息学方法分析其蛋白序列特征、蛋白三级结构及顺式作用元件,并利用RT-qPCR技术分析其组织表达特异性以及干旱、热胁迫响应模式。序列分析表明,TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D分别含有456、471和465 bp的开放阅读框;三维结构预测发现,TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D在N端和C端分别含有MBF1结构域和4个α螺旋组成的helix-turn-helix结构域;系统进化分析结果表明, TaMBF1c基因与二粒小麦(Triticum dicoccum)的亲缘关系最近。顺式作用元件分析发现, TaMBF1c-A、 TaMBF1c-B和 TaMBF1c-D启动子区都含有干旱响应元件(MBS element/MYB element)和热响应元件(HSE element)。RT-qPCR分析显示, TaMBF1c-A和 TaMBF1c-B基因在叶片中特异性表达, TaMBF1c-D只在根部特异性表达;在干旱胁迫条件下, TaMBF1c在干旱敏感小麦品种中表达量较高,其表达量是 TaMBF1c在耐旱小麦品种中表达量的280倍, TaMBF1c在干旱信号途径中起负调控作用。在热胁迫条件下, TaMBF1c-A和 TaMBF1c-B在热敏感与耐热小麦品种中上调表达,而 TaMBF1c-D仅在热敏感小麦品种中上调表达,明显高于耐热小麦品种。