青稞HvnWAK基因的克隆及其在条纹病胁迫下的表达

为探索青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f）WAK类基因在青稞抗条纹病中的作用，以抗条纹病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141为材料，从叶片中克隆了HvnWAK基因。昆仑14号HvnWAK基因开放阅读框（ORF）为2 964 bp，Z1141的ORF为3 048 bp，分别编码988个氨基酸和1 016个氨基酸，两者氨基酸序列一致性为97.14%。启动子区域预测表明，该区段包含脱落酸、茉莉酸、赤霉素等与逆境胁迫相关的多个顺式作用元件。蛋白质序列分析表明，HvnWAK为亲水性的不稳定酸性蛋白，具有典型的细胞壁相关激酶结构特征，如细胞壁受体结构（GUB_WAK_bind）、胞内激酶结构域（intracellular kinase structural domain）和跨膜域、表皮生长因子结构域（epidermal growth factor，EGF），属于WAK家族。同源比对与系统进化分析表明，昆仑14号的HvnWAK蛋白与大麦、山羊草、硬直黑麦草的WAK蛋白序列相似性分别为97.24%、92.17%、80.80%;Z1141的HvnWAK蛋白与大麦、山羊草、硬直黑麦草等的WAK蛋白序列相似性分别为100%、92.17%、80.80%。青稞HvnWAK蛋白与大麦HvWAK蛋白的亲缘关系最近，与玉米和水稻的亲缘关系较远。蛋白互作预测结果表明，与WAK蛋白存在互作关系的有抗病蛋白同源物、解旋酶家族蛋白、苏氨酸蛋白激酶等。实时荧光定量（qRT-PCR）分析表明，该基因在感病后迅速表达，且在抗病材料昆仑14号中的表达峰值显著高于Z1141（P＜0.01），且高峰时期（8～9周）晚于在Z1141中的表达高峰时期（7～8周）。由此推测，HvnWAK基因在青稞抗条纹病的后期发挥重要的调控作用。     

盐胁迫下玉米WRKY转录因子生信及表达分析

WRKY是一类在逆境胁迫响应中起重要调控作用的转录因子。基于盐胁迫下的玉米转录组数据，确定了16个差异表达的WRKY基因家族成员。利用生物信息学方法对各成员理化性质、染色体分布、蛋白保守结构域、系统进化、顺式作用元件及盐胁迫下的相对表达量进行分析验证。结果表明，16个差异表达的WRKY基因家族成员主要分布在玉米的7条染色体上，各成员之间理化性质存在差异。qRT-PCR 验证结果表明，不同基因家族成员对盐胁迫的敏感程度不同，对胁迫处理时间的响应也有所不同。ZmWRKY106、ZmWRKY108、ZmWRKY91、ZmWRKY27在盐胁迫后24 h内均未参与表达，经盐胁迫处理6 h后ZmWRKY63表达量达到最高。各家族成员对盐胁迫的响应及敏感程度不同，可能与各成员间理化性质和结构的差异以及所含的顺式作用元件、内含子和motif类型有关。     

大麦 PHT1基因家族的鉴定及表达特性分析

植物磷转运蛋白1(phosphase transporter protein 1，PHT1)家族在植物磷吸收和转运中发挥着重要作用。为研究大麦 PHT1基因家族成员的特性，利用生物信息学方法在全基因组范围内对大麦 PHT1家族成员进行鉴定，结果共鉴定到14个大麦 PHT1（ HvPT1～ HvPT14）基因，分布在2H、4H、5H和7H染色体上。根据系统发育关系、基因结构和保守蛋白基序，可将14个大麦 PHT1基因分为3个亚群。基于RNA seq数据对大麦品种GN121(磷高效基因型)根和叶片中12个 PHT1基因的表达模式进行分析，发现在低磷胁迫处理下，根中 HvPT1、 HvPT7、 HvPT10和 HvPT12基因以及叶片中 HvPT13基因均上调表达。进一步利用荧光定量PCR技术对大麦品种GN121和GN42（磷低效基因型）根中10个 PHT1基因的表达模式进行分析，发现两个品种根中 HvPT7、 HvPT8、 HvPT10、 HvPT12和 HvPT14基因在磷恢复后第3 d的表达量均显著低于低磷处理第22 d的表达量，推测这5个基因在低磷胁迫下参与磷的吸收和转运；此外 HvPT5基因在磷恢复后第3 d的GN42根中表达量显著下降，而在GN121根中的表达量显著上升，说明 HvPT5基因的表达与品种类型有关。     

小麦木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21的克隆及赤霉病菌诱导下的表达分析

木瓜类半胱氨酸蛋白酶（PLCPs）作为一类重要的蛋白水解酶，在植物生长发育以及胁迫应答过程中都发挥着重要作用。本研究从抗、感赤霉病小麦品种差异表达基因谱中获得1个注释为RD21 Cysteine proteases的EST（表达序列标签），以此序列检索小麦最新基因组数据库并设计引物，从小麦中克隆到3个基因，分别命名为TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D，属于PLCPs RD21家族。序列分析表明，3个基因的开放阅读框长度分别为1 410、1 428和1 419 bp，分别编码469、475和472个氨基酸。序列比对发现，3个基因的序列相似性为89.3％，所编码蛋白的氨基酸序列相似性为95.6％。系统进化分析表明，TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D蛋白的同源性较高，且与乌拉尔图小麦TuRD21A蛋白聚为一类。qRT-PCR分析表明，3个TaRD21基因均受水杨酸(SA)、乙烯利(ETH)以及赤霉病菌诱导表达;感病品种中,TaRD21-2A对SA和赤霉病菌的响应更迅速，且表达量较高；抗病品种中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因对ETH的响应更迅速。     

燕麦PRR基因家族鉴定与表达分析

春、夏播燕麦是长日照作物，光周期不敏感燕麦的创制使其在短日照条件下能正常生长发育。PRR基因是光周期途径中重要的昼夜节律调节基因。前期转录组研究表明PRR基因可能与燕麦光周期不敏感性有关。本研究从转录组和全基因组水平对燕麦PRR基因家族进行鉴定、生物信息学分析和表达研究。结果表明，在燕麦转录组和基因组水平分别鉴定到6个和2个PRR基因，均包含REC和CCT结构域；进化分析表明燕麦PRR基因与小麦、大麦、黑麦草和山羊草的亲缘关系较近；燕麦PRR基因启动子区域包含与光响应、生长发育和胁迫相关的顺式作用元件；qRT-PCR分析表明燕麦PRR基因的表达具有节律特征，全生育期过程中AsPRR1和AsPRR2在穗和叶的表达量均呈现由低到高、下降后再升高的双峰趋势，且AsPRR2基因的表达量高于AsPRR1。以上结果说明，AsPRR基因在燕麦光周期途径中发挥负调控作用，其下调表达促进了光周期不敏感性燕麦gp012在短日照条件下开花。本研究为揭示AsPRR基因在燕麦光周期不敏感机制中的作用奠定 了基础。     

TaHIPP32与 TaHAK1表达及小麦缺钾胁迫耐性的关系

钾是植物生长发育必需的三大营养元素之一。高亲和性钾转运蛋白（HAK）能加强植物在缺钾胁迫时钾的吸收和转运。本课题组前期研究发现，小麦 TaHAK1基因在缺钾胁迫条件下显著上调表达，并筛选得到可能调控 TaHAK1基因表达的上游转录因子基因 TaHIPP32，但这两个基因在缺钾胁迫中的作用机制尚不清楚。本研究首先对 TaHIPP32基因进行了系统发育和亚细胞定位分析，然后利用双荧光素酶验证 TaHIPP32和 TaHAK1基因的互作，并以河南省大面积推广的小麦品种百农207为试验材料，利用大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默（BSMV-VIGS）技术分析缺钾胁迫处理下 TaHIPP32基因沉默对小麦植株的影响。系统发育和亚细胞定位分析表明， TaHIPP32基因与水稻 OsHIPP33基因的亲缘关系最近，且其编码的蛋白定位于细胞膜上。双荧光素酶试验表明，TaHIPP32蛋白能够与 TaHAK1基因启动子互作。通过BSMV-VIGS技术瞬时沉默 TaHIPP32基因，发现该基因沉默后，小麦植株对缺钾胁迫更为敏感，植株生长受到抑制，干重显著降低，丙二醛(MDA)含量显著提高；缺钾胁迫处理下，沉默 TaHIPP32基因的植株中， TaHAK1和 TaHIPP32基因的表达均被抑制，且植株体内钾元素从地下部到地上部的转移系数显著降低，说明 TaHIPP32基因通过调节 TaHAK1基因的表达来影响植株体内钾元素的转运。     

小麦G6PDH基因家族的鉴定与表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖途径中的关键限速酶，在植物生长发育及非生物胁迫响应中发挥重要作用。本研究利用生物信息学对小麦 G6PDH基因家族成员进行鉴定，并对该家族基因编码蛋白的理化性质、进化关系、亚细胞定位、基因复制事件以及在不同组织和不同胁迫下的表达模式进行分析。结果表明，在小麦基因组中共鉴定到14个 G6PDH基因家族成员，分布在小麦2A、2B、2D、4A、4B、4D、6A、6B和6D染色体上，其中5个基因编码的蛋白为胞质型，9个为质体型。亚细胞定位预测表明，胞质型G6PDH蛋白主要定位于细胞质上，而质体型G6PDH蛋白主要定位于叶绿体上。根据系统进化和保守结构域特征，可将14个小麦G6PDH蛋白分为Cy、P0、P1和P2四个亚组。共线性分析表明，小麦 G6PDH基因家族成员存在17对片段重复基因。RNA-seq分析结果表明，小麦 G6PDH基因家族成员在不同组织中存在明显的表达差异，其中 TaG6PDH1-2A/2B/2D基因在根中的表达量最高； TaG6PDH2-2A和 TaG6PDH2-2B基因在干旱胁迫后1 h以及热胁迫后6 h均上调表达。进一步利用qRT-PCR检测6个小麦 G6PDH基因在干旱和盐胁迫下的表达模式，发现分别有5个基因在小麦根中均上调表达，推测小麦 G6PDH基因在非生物胁迫响应过程中发挥着重要功能。     

小麦WRKY转录因子TaWRKY72B的克隆、亚细胞定位及表达分析

WRKY蛋白是一类转录因子，参与调控植物的多种生长发育和胁迫应答过程。为进一步探究WRKY在小麦响应逆境中的作用，本研究克隆了小麦中国春的TaWRKY72B基因，并对其进行了生物信息学、亚细胞定位和表达模式分析。结果表明，中国春的TaWRKY72B基因编码320个氨基酸，蛋白序列包含典型的WRKY保守结构域和C2H2锌指结构，分子量为33.94 kDa，理论等电点为6.60，是酸性亲水的不稳定蛋白，无信号肽序列，属非跨膜蛋白。二级结构预测表明，TaWRKY72B主要由无规则卷曲( 61.25%)、α-螺旋(23.12%)、延伸链(11.88%)和β-转角(3.75%)组成。TaWRKY72B定位于细胞核，符合转录因子特征。系统进化树分析显示，TaWRKY72B蛋白与节节麦、大麦和水稻等禾本科作物的WRKY亲缘关系较近。启动子顺式作用元件预测结果表明，该基因含有多个与生长发育、激素信号途径以及非生物胁迫应答相关的顺式调控元件。TaWRKY72B表达受激素、高温、低温和盐诱导，推测该基因可能参与小麦逆境胁迫应答和多种激素信号途径。     

小麦 DA1基因家族成员的鉴定及其表达谱分析

泛素受体DA1在控制种子和器官大小上发挥着重要作用。本研究以中国春小麦为材料,采用生物信息学的方法对小麦 DA1基因家族成员进行了全基因组鉴定和分析,共鉴定到12个小麦 DA1同源基因（ TaDA1s）,分别位于2B、2D、4A、4B、4D、5A、5B和5D染色体上,亚细胞定位预测结果表明其位于细胞核中。系统进化分析发现, TaDA1s可分为 TaDA1、 TaDAR1和 TaDAR2三类。除TaDA1-2D1编码的蛋白只含有DA1-like结构域外,其他成员编码的蛋白均含有DA1-like、UIM和LIM结构域。启动子序列分析发现, TaDA1s的启动子区含有较多的响应激素、逆境以及与生长发育相关的顺式作用元件。通过公共的转录组数据和qRT-PCR试验验证, 发现 TaDA1s在不同组织中都有表达,在籽粒发育过程中,不同的小麦 DA1基因呈现不同的表达模式,暗示存在基因功能分化现象;脱落酸（ABA）能够抑制 TaDA1s的表达;在低温和盐胁迫条件下, TaDA1s基因表达有明显的差异。酵母双杂交和荧光素酶互补试验发现,TaDA1-2B、TaDAR1-5A和TaGW2存在转录自激活现象,且TaDAR1-5A与TaGW2有微弱的互作效应。本研究结果为进一步探究 DA1基因家族在小麦中的生物学功能奠定了基础。     

偃麦草ErABF1基因克隆及功能分析

抗逆相关bZIP (Basic leucine zipper) 转录因子家族基因主要参与ABA、干旱、高盐等胁迫应答反应,其过表达能够显著增强植物的抗逆性。本研究从偃麦草（Elytrigria repens L.）中分离到一个抗逆相关 ErABF1（E. repens ABA Binding Factor 1）基因,氨基酸序列比对分析发现,该基因与小麦、玉米、拟南芥等bZIP转录因子基因同源性较高,亲缘关系较近;ErABF1基因的表达受到ABA、干旱、高盐、低温的强烈诱导;在2% PEG、200 mmol·L^-1 NaCl胁迫培养基上初步功能分析表明, ErABF1过表达提高了转基因烟草对干旱、高盐的胁迫耐性。     

刈割留茬高度对青稞饲草与籽粒产量及饲用品质的影响

为探究适宜于高寒区青稞多元化利用最佳刈割留茬高度，以昆仑14号、昆仑18号和柴青1号为试验材料，以未刈割为对照(CK),于分蘖盛期开展不同留茬高度的刈割处理，探究留茬高度对青稞农艺性状、籽粒产量、饲草产量及营养品质的影响。结果表明，随着刈割留茬高度的降低，各青稞品种青苗饲草产量均呈逐渐增加的趋势；青苗中粗蛋白含量呈逐渐降低趋势，而纤维类物质含量呈逐渐升高的趋势，使青苗相对饲喂价值显著降低。各青稞品种秸秆饲草产量随刈割留茬高度的降低而降低，且降幅随留茬高度的降低而增大。刈割使青稞秸秆中粗蛋白含量增多，纤维类物质含量减少，相对饲喂价值升高。留茬8 cm有助于促进青稞穗部、茎部和根系的生长发育，使籽粒产量升高；留茬5 cm会抑制青稞各器官的生长发育，使籽粒产量锐减。各品种在留茬8 cm时综合经济产值最高，其中昆仑14号综合经济产值最高，为2.86×10⁴元·hm^-2。参试材料中，昆仑14号为高寒区最适用于粮饲兼用的青稞品种，8 cm为适宜于青稞饲草与籽粒兼收的最佳刈割留茬高度。     

产地及品种对西藏青稞营养品质的影响

为了明确产地和品种对西藏青稞营养品质的影响,对采自西藏6个地(市)、26个县的7个普通青稞品种和3个有色青稞品种(257份样品)的5个品质指标和8种矿质元素含量进行了分析。结果表明,(1)产地生态条件是影响青稞品质和矿质元素含量的首要因素,产地对普通青稞的10个被测指标有显著影响;品种对普通青稞的5种被测指标有显著影响;产地和品种的交互作用显著影响5个被测矿质元素含量;产地显著影响有色青稞的黄酮、粗蛋白和磷含量。(2)青稞不同品质指标和矿质元素含量变异程度不同,变异系数最高为52.3%。供试青稞粗淀粉含量为46.64%~53.76%,粗蛋白含量为6.51%~14.21%,粗纤维含量为1.66%~3.4%,β-葡聚糖含量为3.63%~5.13%,黄酮含量为0.18%~0.40%;钾含量为4 224.8~7 646.5mg·kg~(-1),磷含量为2 243.1~6 288.7mg·kg~(-1),镁含量为731.6~1 572.0mg·kg~(-1),钙含量为246.4~789.0mg·kg~(-1),铁含量为27.59~173.99mg·kg~(-1),锌含量为17.56~85.22mg·kg~(-1),锰含量为10.42~22.23mg·kg~(-1),铜含量为2.12~11.84mg·kg~(-1)。(3)有色青稞的粗淀粉和黄酮含量显著高于普通青稞,而粗蛋白和粗纤维含量显著低于普通青稞,β-葡聚糖含量二者间无显著差异。     

青稞B-hordein基因对小麦面粉加工特性的影响

B组醇溶蛋白是大麦的主要贮藏蛋白之一,其组成及含量与大麦的营养品质和加工品质密切相关。为探究大麦B组醇溶蛋白对小麦面粉加工特性的影响,以转青稞B-hordein基因的小麦转基因高代株系(T4、T5代)及其受体品种龙麦30为材料,分别对转B-hordein基因小麦高代株系及龙麦30进行分子检测、农艺性状测量、近红外分析和粉质分析。结果表明,转B-hordein基因小麦高代植株均为阳性植株;在农艺性状方面,转B-hordein基因小麦与龙麦30无显著差异;在品质方面,转B-hordein基因小麦的蛋白质含量、湿面筋含量的平均值均极显著高于龙麦30;粉质分析结果也表明转B-hordein基因小麦的粉质参数优于龙麦30。由此推测,B-hordein基因的成功转化能够改善小麦的面粉加工特性。     

青藏高原16个青稞品种区域试验甘孜试点结果初报

为选育适应青藏高原地区种植的青稞新品种,2010—2012年在四川甘孜对16个青稞参试品种(系)进行了区域试验。结果表明,在16个参试品种(系)中,康青8号、康青7号、甘青5号、藏青25、藏青690、昆仑13这6个青稞品种比对照品种813增产显著,且综合农艺性状好,可在甘孜州青稞适宜种植区种植。其余品种(系)与对照品种813相比,产量相当或减产,可作为种质资源利用或保存。     

利用SSR引物分析西藏青稞种质资源的遗传多样性

为了评价西藏青稞种质资源的遗传多样性,用260对SSR引物对来自青藏高原主要农区的75份青稞育成品种、17份野生大麦、39份青稞地方品种和44份国外大麦材料的遗传多样性进行了分析.结果表明,从260对SSR引物中筛选出23对多态性高的引物,占筛选引物的8.1％.23对SSR引物在西藏野生大麦中共扩增出稳定、清晰的条带92条,多态性条带为81条,其比例为88.04％;在西藏青稞地方品种中共扩增出稳定、清晰的条带89条,多态性条带为78条,其比例为87.6％;在青稞育成品种中共扩增出稳定、清晰的条带109条,多态性条带98条,其比例为89.9％;在引进材料中共扩增出稳定、清晰的条带64条,多态性条带53条,其比例为82.8％.遗传多样性分析结果为青稞育成品种(0.9882)＞西藏野生大麦(0.8033)＞西藏青稞地方品种(0.5820)＞国外大麦材料(0.4218).聚类与主坐标分析表明,实验材料可以清楚的分为4类,西藏野生大麦分在两个类群,西藏青稞地方品种分在两个类群,引进大麦材料分在一个类群,青稞育成品种分在四个类群.同一来源地区的青稞育成品种遗传基础较为狭窄,不同地区间的青稞育成品种遗传差异较大.以上结果说明,在西藏青稞新品种选育和遗传改良中,在发掘和利用西藏野生大麦资源、西藏青稞地方品种资源的同时,更应该加强不同地区青稞育成品种资源的交换和配合使用.     

青稞骨干亲本昆仑1号及其衍生品种(系)重要性状的演变研究

为阐明昆仑1号及其3个不同时期衍生品种(系)重要农艺性状的演变规律,对重要农艺性状和产量性状进行了研究。结果表明,昆仑1号衍生品种(系)的株高呈增加趋势,子代株高相对于昆仑1号平均株高分别增加8.17%、18.77%和14.74%;子代叶片类型由长而宽逐渐演变为短而窄,旗叶长宽比逐渐增加,叶面积逐渐减少,该类型变化使株型更加紧凑,有助于增加单位面积的植株数,提高光合总产量,促进青稞的增产;穗长、单株有效穗数、穗粒重和小区产量均显著增加;小穗数和穗粒数变化不明显,千粒重小幅度减少。相关性分析表明,穗粒重、千粒重与产量呈显著正相关,单株有效穗数、穗长、株高对产量呈显著负相关,小穗数和穗粒数与产量间的相关性不显著。因此,昆仑1号的穗大、千粒重高等丰产特性在品种演替中得到了很好的传递。建议西藏青稞育种中,应结合农区畜牧业的发展,保持株高、减少穗长、增加有效小穗数、提高结实率,千粒重和穗粒重并重、主攻小穗数和穗粒数是提高青稞产量的有效途径。     

西藏青稞品种藏青13高氮处理的SSH文库构建及分析

为了分析青稞高氮处理相关基因的表达,以藏青13为实验材料,通过抑制差减杂交构建了青稞高氮处理下的差减c DNA文库。在随机挑取的281个阳性克隆中,测序获得219条高质量的EST,含有212条非重复且与Genbank中的基因或蛋白具有较高的同源性的序列。对其进行Blast2Go功能注释可将差异表达的基因定位到细胞组件、分子功能和代谢过程3大类内。通过KEGG代谢途径分析,212个比对结果中的117个ESTs有详细的KO功能注释,定位到17个具体的代谢途径上,且主要定位在光合作用碳固定途径和氮素代谢途径。此外,分析还发现这些基因主要是编码参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶,且参与信号转导、转录调节和光合作用等生理过程,说明这些基因很可能参与到青稞在高氮处理下的抗性反应中。     

西藏青稞育成品种醇溶蛋白的遗传多样性分析

利用A-PAGE(Acid-polyacrylamide gel electrophoresis)法对18份西藏青稞育成品种醇溶蛋白的遗传多样性进行了研究。结果表明:18份供试材料共分离出22种相对迁移率不同的醇溶蛋白谱带,16种不同的电泳图谱,说明西藏青稞育成品种具有较丰富的醇溶蛋白遗传多态性。平均等位变异数为10个,平均遗传多样性值为2.602。聚类分析结果表明,四川农业大学育成的青稞品种2000-9与所有的西藏材料分别聚为A、B两大类。在遗传距离为0.42水平上,所有的西藏材料又可归为B1、B2两亚类。遗传距离分析表明,西藏材料间的遗传距离平均值较低(0.282)。在西藏超级青稞育种中,应加强青稞资源的收集、发掘和评价,扩大青稞资源的遗传基础。     

西藏青稞染色体多样性分析

为了解西藏青稞的染色体多样性，从西藏六个地区共采集124个青稞品种，每个品种取3个单株，基于南京农业大学开发的寡核苷酸探针ONPM#8(Oligonecleotide probe multiplex#8),利用荧光原位杂交(fluoresence in situ hybridization, FISH)技术对所有品种进行染色体鉴定，并建立可以区分全部染色体的青稞参考核型。结果表明，采集到的青稞植株有26种染色体多态类型，其中5种多态类型(1H-1、2H-2、4H-1、5H-1和7H-4)的频率大于50%。染色体多态性信息含量(PIC)分析发现，3H染色体最多(PIC=0.75),5H染色体最少(PIC=0.00)。372个单株存在明显的核型变异，涉及染色体多态性、杂合性和异质性，其中261个单株为纯合类型，其余111个单株为杂合类型，平均每株包含1.15对杂合染色体，说明新采集的青稞涉及染色体多样性，可通过后续个体选择和后代鉴定选育出纯系品种。