EGCG抑制Nicotine诱导肺腺癌H1299细胞JAK2/STAT3 mRNA的表达研究

为探索EGCG对Nicotine诱导肺癌细胞增殖的抑制作用,本研究通过MTT实验筛选出EGCG、Nicotine对肺腺癌细胞H1299的最佳作用浓度,利用实时荧光定量PCR技术检测EGCG、Nicotine对H1299细胞中Bax、Bcl-2、Jak2和Stat3基因mRNA相对表达量的变化。实验结果表明,EGCG对H1299细胞的半抑制浓度IC₅₀值约为32βμmol·L^-1（24βh）、15βμmol·L^-1（48βh）;1βμmol·L^-1的Nicotine对H1299细胞促增殖作用明显;以15βμmol·L^-1的EGCG预处理H1299细胞24βh可显著下调1βμmol·L^-1 Nicotine的促增殖作用（P<0.05）。1βμmol·L^-1的Nicotine处理H1299细胞可明显降低JAK2/STAT3信号通路中Bax基因mRNA的表达,增加Bcl-2、Jak2、Stat3基因的mRNA表达;15βμmol·L^-1 EGCG预处理H1299细胞可反向调控Nicotine诱导所致JAK2/STAT3信号通路中Jak2、Stat3和Bax、Bcl-2基因表达量的变化,结果具有显著性差异（P<0.05）。由此可知,EGCG对Nicotine诱导的肺腺癌H1299细胞增殖及JAK2/STAT3信号通路中促增殖基因mRNA的表达起抑制作用。     

表没食子儿茶素没食子酸酯增强卡莫司汀抗肿瘤作用的体外研究

采用MTT法及Comet assay(彗星实验分析方法)研究了表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与卡莫司汀联用对人肺癌细胞A549的生长抑制率及DNA损伤的影响,结果表明：联合应用EGCG能降低卡莫司汀对人肺癌细胞A549的IC₅₀。卡莫司汀单用对人肺癌细胞A549的IC₅₀为187.46βμg/ml,当用无毒浓度25βμg/ml和50βμg/ml的EGCG与卡莫司汀联用时,卡莫司汀对人肺癌细胞A549的IC₅₀分别下降为139.56βμg/ml和154.02βμg/ml。EGCG还能增强卡莫司汀引起的人肺癌细胞A549 DNA的损伤,彗星尾矩值由单用时的19.02±14.60上升为联用时的33.07±10.47。结果说明EGCG能增强卡莫司汀对人肺癌细胞A549造成的DNA损伤,从而增强其抗肿瘤活性。     

酶性氧化合成茶黄素条件优化的研究

利用提取粗酶液在单因素试验和正交试验进行合成茶黄素以及在此基础上利用捣碎茶鲜叶（不提取粗酶液）直接进行合成茶黄素试验以确定最优反应条件。结果表明,在本试验反应体系中,茶黄素酶促合成的最佳条件（茶黄素总量）为：温度为30℃,反应体系的最佳pH值为4.8,底物浓度为0.9βg/100βml,酶源物浓度为28βg/100βml（以鲜叶重量计）,通氧量为0.4βL/min,最佳反应终止时间是40βmin。其中温度和pH值是反应体系中两个极其重要的影响因素（P<0.05）;通氧量也是影响茶黄素酶性合成的必不可少的条件之一。     

茶多酚与绿原酸生物活性的比较研究

为了研究茶叶与金银花中主要药效成分茶多酚和绿原酸生物活性的差异,应用过氧化值测定法、分光光度法、最小抑菌浓度(MIC)测定法分别比较茶多酚和绿原酸的抗氧化性、自由基清除能力、体外抑菌活性;结果表明在6周的观测期内,浓度为100βµg/g和200βµg/g的茶多酚可将猪油的POV抑制在10βmeq/kg范围内,且抗氧化能力随浓度增加而增强,这与81％绿原酸有相似结果;20％绿原酸、81％绿原酸、95％茶多酚对DPPH和·OH的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为327、1β432、65、135、52βmg/L和1β908βmg/L;95％茶多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为500βμg/g和250βμg/g,81％绿原酸和20％绿原酸相应值分别为500βμg/g、500βμg/g和500βμg/g、1β000βμg/g;研究结论为茶多酚（95%）在抗氧化性、清除DPPH能力及对金黄色葡萄球菌的抑菌效果方面都要强于绿原酸（81%）,在清除·OH能力上要弱于绿原酸,在食品、药品行业中茶多酚有望比绿原酸发挥更大的作用。     

EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)催化EGCG形成的EGCG甲基化衍生物分析

研究了EGCG3′′Me、EGCG4′′Me和EGCG3′Me在正离子模式下的质谱裂解规律,并在此基础上分析了EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)催化EGCG形成的反应产物。结果表明,EGCG-O-甲基转移酶催化EGCG后反应体系中生成了10余种不同的EGCG甲基化衍生物,主要包括EGCG3′′Me、EGCG4′′Me、EGCG3′Me、EGCG5′Me、EGCG3′′,4′′-diMe、EGCG3′′,5′′-diMe、EGCG3′,5′-diMe、EGCG3′,5′′-diMe、EGCG3′,3′′,5′′-triMe,以及EGCG5′,3′′,5′′-triMe等。     

EGCG4"Me的选择性合成

以EGCG和没食子酸丙酯(PG)为起始化合物,以碘甲烷作为甲基化试剂,通过化学合成的方法选择性地合成了EGCG的甲基化衍生物EGCG4"Me,通过核磁共振鉴定其结构。     

毛细管电泳分析茶黄素的方法研究

研究了毛细管电泳分析茶黄素类组分的最佳条件。结果表明：在250βmmol/L H₃BO₄、10βmmol/L KH₂PO₄、0.75βmmol/L SDS和20％(v/v)乙腈组成的pH7.5电泳介质中,选择25βkV电压、20℃柱温和200βnm波长检测,可在10βmin以内将茶叶中的四种主要茶黄素单体分离,并获得较高的检测灵敏度。四种茶黄素单体浓度与峰面积值之间的相关系数r=0.9945~0.9990,检测下限在0.53~0.64βμg/ml之间,加标回收率为92.50%~108.36%,变异系数≤2.67%。本方法快速、准确,可用于实际样品的测定。     

配体交换色谱手性流动相法拆分和定量茶氨酸对映体

建立了配体交换色谱手性流动相法拆分茶氨酸对映体的方法。采用Polaris C₁₈柱;流动相为L-脯氨酸：Cu²⁺（摩尔比）为2:1,Cu²⁺浓度为0.5βmmol/L,pH6.8,甲醇的加入体积比为2%;波长254βnm;流速0.9βml/min;柱温30℃。L-茶氨酸的进样量在0.09542βμg~4.241βμg范围内峰面积与进样量之间线性关系良好,回收率在97.45%~100.4%之间;D-茶氨酸的进样量在0.08486βμg~4.243βμg范围峰面积与进样量之间线性关系良好,回收率在97.07%~100.1%之间。该方法通用,准确。     

基于4300 DNA分析系统的茶树SSR发掘方法优化与建立

简单序列重复（Simple sequence repeats, SSR）在茶树遗传与育种研究中具有重要的作用,基于4300 DNA分析系统的SSR发掘具有通量高、准确和灵敏等特点,已被用于许多物种的分子标记研究,但在茶树的相关研究中尚未见报道。本研究应用单因素试验和L₉(3⁴)正交设计试验对影响茶树SSR-PCR的主要参数进行优化,建立了适合于4300 DNA分析系统的茶树SSR-PCR反应体系：1.0 μL DNA（25 ng·μL^-1）,0.2 μL M13F-F、0.2 μL R和0.4 μL IR-M13F,0.8 μL dNTPs（25 mmol·L^-1）,1.0 μL 10×Buffer（含Mg²⁺）,0.1 μL Ex-Taq聚合酶（5 U·μL^-1）,无菌水定容至10 μL。所有引物浓度均为1 μmol·L^-1。同时,本研究还证明,可以以自行配制的6.5%聚丙烯酰胺凝胶溶液（acry:bis=29:1）替代4300 DNA分析系统指定凝胶溶液,检测SSR位点。     

茶氨酸酶促生物合成研究进展

茶氨酸系茶树（Camellia sinensis）特征性成分,具有放松镇静、增强记忆、保护神经、化疗调节等诸多生理活性。目前发现能催化茶氨酸生物合成的酶有7种,它们分别是茶氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰甲胺合成酶、谷氨酸合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰转肽酶。茶氨酸生物合成反应有两种代表类型：（1）谷氨酸和乙胺为底物的连接合成反应（需ATP供能）;（2）谷氨酰胺和乙胺为底物的酰基转移反应。本文对茶氨酸酶促合成途径进行了综述,以此为茶氨酸微生物合成技术的开发应用提供参考依据。     

茶叶中EGCG3"Me和EGCG4"Me的分离制备与鉴定

采用柱色谱和高效制备液相色谱法从茶叶中分离制备2种甲基化EGCG(EGCG 3"Me和EGCG 4"Me)。用含水的乙酸乙酯提取茶叶,粗提液浓缩后经HP-20柱色谱分离,再经制备液相色谱分离,以水和乙腈为流动相进行梯度洗脱得到2种甲基化EGCG。经紫外光谱、核磁共振及质谱分析,进一步确定2种甲基化EGCG分别为EGCG3"Me和EGCG4"Me。所制备的2种甲基化EGCG的纯度在98%以上。     

EGCG3" Me提取与分离工艺研究

采用HPLC、聚酰胺树脂、HPTLC等技术手段,进行EGCG3"Me的提取与分离纯化研究.通过正交实验表明,EGCG3"Me最优提取工艺条件为:乙醇体积分数70%、回流时间3 0 min、回流温度80℃、料液比1:10,质量分数为0.89%.采用40%酒精、60%酒精进行冼脱时,有大量EGCG3"Me富集.以甲醇:氯仿...     

茶树种质资源EGCG3"Me含量及其变化规律研究

采用HPLC分析技术对国内茶树种质资源的EGCG3"Me含量及其变化规律进行了研究。结果表明：在200份高多酚茶树种质中发现EGCG3"Me的含量大于1%的茶树种质有6个;茶梢中EGCG3"Me的含量随着叶片成熟度的提高而增加,并且秋季新梢高于夏季新梢;绿茶加工过程能有效保持鲜叶中EGCG3"Me含量,而乌龙茶加工过程的萎凋工序中茶叶中EGCG3"Me含量有明显增加。     

茶树种质资源EGCG3″Me含量及其变化规律研究

采用HPLC分析技术对国内茶树种质资源的EGCG3″Me含量及其变化规律进行了研究。结果表明：在200份高多酚茶树种质中发现EGCG3″Me的含量大于1％的茶树种质有6个;茶梢中EGCG3″Me的含量随着叶片成熟度的提高而增加,并且秋季新梢高于夏季新梢;绿茶加工过程能有效保持鲜叶中EGCG3″Me含量,而乌龙茶加工过程的萎凋工序中茶叶中EGCG3″Me含量有明显增加。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对卡莫司汀处理后张氏肝细胞DNA损伤的保护作用

采用MTT法、Cometassay(彗星实验)和流式细胞分析法研究了表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对卡莫司汀引起的张氏肝细胞DNA损伤的保护作用及其机制。结果表明:EGCG能阻止卡莫司汀所致张氏肝细胞的生长抑制,卡莫司汀单用对张氏肝细胞的IC50为43.31μg/ml,当用无毒浓度25μg/ml和50μg/ml的EGCG与卡莫司汀联用时,对张氏肝细胞的IC50分别提高至52.46μg/ml和46.65μg/ml。彗星分析结果表明EGCG还能减小卡莫司汀引起的张氏肝细胞DNA损伤,彗星Olive尾矩值由单用时的9.07±5.48降为联用时的6.02±2.46。EGCG还能减小卡莫司汀所致张氏肝细胞的早期凋亡率,25μg/ml的EGCG和20μg/ml的卡莫司汀联合处理4、6h和24h时,早期凋亡率分别从4.53±0.64(%)、6.01±0.14(%)、2.27±0.32(%)降至3.04±0.47(%)、5.61±0.10(%)、1.14±0.23(%)。说明EGCG能保护卡莫司汀对正常肝细胞的杀伤,其机理是它能减少这类药物引起的细胞DNA损伤,降低卡莫司汀所致细胞早期凋亡。     

EGCG与锌离子互作对PC-3细胞能量代谢的影响

采用Hoechst33258荧光染色法观察EGCG、Zn2+和EGCG+Zn2+对前列腺癌PC-3细胞凋亡的诱导作用;采用HPLC法检测了EGCG、Zn2+和EGCG+Zn2+对PC-3细胞内腺苷酸(ATP、ADP、AMP)含量的影响,并分析了能量负荷(EC)和ATP/ADP比值。结果表明,Hoechst33258染色后正常细胞发出均匀微弱的蓝色荧光,细胞核未见异常,EGCG、Zn2+和EGCG+Zn2+处理后凋亡的PC-3细胞都发出较强的蓝色荧光,细胞核DNA断裂及染色体高度浓缩;EGCG、Zn2+及二者混合物处理后细胞内总腺苷酸含量、EC及ATP/ADP比值都下降,表明EGCG与Zn2+对PC-3细胞能量代谢都存在明显的抑制作用。     

甲基化EGCG的研究现状及展望

EGCG3"Me于1982年首次从绿茶中被分离出来,并发现它具有潜在的抗过敏活性。近年来,甲基化的EGCG不断从茶叶和体内代谢物中被发现。本文对国内外甲基化EGCG的分离方法、功效和合成方法进行了综述。常见的甲基化EGCG分离方法包括葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）、高速逆流色谱、Toyopearl HW-40S中压柱层析、制备型液相色谱（pHPLC）等方法;甲基化EGCG在抗过敏性、抗细胞毒素、抑制脂肪氧化酶、抑制诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、保护肝细胞等方面都优于EGCG;甲基化EGCG的合成主要包括化学合成和生物合成两种途径。     

EGCG对DNA辐射损伤的保护作用

利用荧光探针溴化乙啶（ＥＢ）研究了茶儿茶素ＥＧＣＧ与小牛胸腺ＤＮＡ的相互作用，结果表明，ＥＧＣＧ─ＤＮＡ的荧光光谱基本不随时间而变化，但随ＥＧＣＧ浓度增强，λ２峰（５８８．８ｎｍ）强度下降，偏振度增加，这可能与ＥＧＣＧ插入ＤＮＡ碱基对平面，双链有序度增加有关。γ辐照使小牛胸腺ＤＮＡ发生断裂等损伤，剂量越大，损伤越严重，但加入ＥＧＣＧ后，对ＤＮＡ损伤有一定保护作用，这可能与ＥＧＣＧ清除γ辐照间接效应产生的自由基有关。