以油菜脂肪酸延长酶基因fae1为靶标RNAi载体的构建

通过基因工程手段抑制脂肪酸延长酶基因fae1的表达,以阻止芥酸合成,培育不受高芥酸窜粉影响的低芥酸品种.利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物和多聚酶链式反应(PCR)从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的12个不同品种中扩增出长1007bp的fae1基因片段,通过对fae1基因片段DNA序列的测定和序列比较,找到长度为428bp高度保守区作为RNA干涉(RNAi)的靶标区.根据RNA干涉(RNAi)双向表达载体设计原则,将428bp fae1基因片段以正反两个方向插入双向表达载体pMCG161中,两个片段用一个wax基因的内含子连接,植物筛选标记基因采用bar基因,从而构建以油菜fae1基因为靶标的RNAi载体.     

油菜PEPase基因的克隆及其对应RNAi载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶.采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中双4号中扩增出PEPase基因cDNA片段,与已发表的PEPase基因(登录号为D13987)序列同源性为98%.根据RNA 干扰(RNAi)目标序列的选取原则选取两段长度约为400bp的DNA序列,分别克隆到RNAi载体pHBM1301中,构建了油菜中对应于PEPase基因的RNAi载体pHBM1301-PEP1和pHBM1301-PEP2.     

甘蓝型油菜种子特异性表达 fad2基因的ihpRNA载体构建

旨在通过转基因途径诱导油菜种子中fad2基因发生转录后基因沉默,本文构建了fad2基因的ihpRNA 植物表达载体。通过PCR扩增分离到甘蓝型油菜种子特异性表达的Nap in启动子序列(1147bp)以及油酸脱饱和 酶基因( fad2)的一个537bp的片段,并将它们分别克隆到pGEM - T easy载体中。利用中间载体pHurrican构建 fad2基因的反向重复框。将fad2基因片段以正向的方式连接在一个可剪切的内含子的5’末端,而以反向的方式 连接到该内含子的3’末端;然后将Nap in启动子序列连接到该反向重复框的5’端,而在其3’端接有一个nos终止 子序列;最后将fad2基因的反向重复表达框分两步克隆到植物双元载体pCAMB IA2300的pUC18多克隆位点,构建 具有种子特异性表达的fad2基因的ihpRNA表达载体pCNF IRnos。限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。     

FAD2和γ-TMT基因双价种子特异表达载体的构建及对花生的转化

根据已发表的γ-TMT基因序列(GenBank AF104220),从拟南芥(Arabidopsis thaliana)的cDNA中分离得到γ-TMT基因,根据已发表的油菜(Brassica napus)种子贮藏蛋白基因特异表达的2S启动子(登录号J02798)序列,从油菜DNA中分离得到2S启动子。为了同时提高花生中维生素E和油酸含量,构建得到了双价种子特异表达载体pCAMBIA1300AT,它带有FAD2基因反义RNA干扰体和γ-TMT基因的种子特异表达单元。该载体已登录在GenBank上(登录号FJ362601)。通过农杆菌C58介导转化花生品种闽花6号,获得PCR阳性的转化植株。     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因RNAi载体的构建

采用PCR技术扩增得到胰蛋白酶抑制剂KTi基因正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GUS基因片段,将其分别连入克隆载体pMD18-T Vector中.然后以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,通过AHLG作为中间载体,根据RNAi原理将组成RNAi 结构的4个目的片段分别连入其中,成功构建了种子特异性RNAi表达载体p1301-KTiRi.研究结果为RNAi技术在大豆品质改良中的应用提供了基础.     

花生PEPC基因反义表达载体构建及对花生的遗传转化

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是控制花生蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶.本研究利用PCR方法扩增出了PEPC基因片段,并将其克隆到pMD18-T Simple载体,序列分析表明克隆片段的长度为728bp.将该PEPC基因片段反向插入pCAMBIA1301-35S双元表达载体,构建了带PEPC反义基因的双元载体并进行花生的转化,目前已获得转基因植株,收获T1代种子.     

毛竹4个miRNA在胚芽萌发过程的表达响应研究

为探究毛竹mi RNA在种子萌发过程中相关调控机理,利用荧光定量和生物信息学技术分析毛竹中可能参与种子萌发调控的mi RNA,并预测其潜在靶基因。并对毛竹种子萌发过程中胚芽萌发的不同阶段的mi RNA及其潜在靶基因的表达模式进行验证分析。结果显示,毛竹4个mi RNA基因(phe-mi RNA156k、phe-mi RNA159b、phe-mi RNA160a和phe-mi RNA396e)在种子萌发至形成完整胚芽的3个阶段中表达水平呈上升趋势。通过mi RNA及其靶基因的表达关联分析,发现毛竹这4个mi RNA潜在靶基因(phe-mi RNA156-T1、phe-mi RNA156-T2、phe-mi RNA159-T1、phe-mi RNA160-T1、phe-mi RNA396-T1和phe-mi RNA396-T2)的表达下调,而这些靶基因可能参与调节毛竹种子萌发、细胞分化和器官形成等过程。其中根中高表达的phe-mi R396e随着毛竹萌发而上调表达,其靶基因则表达下调,它可能通过抑制其2个生长因子相关蛋白的靶基因来实现对毛竹萌发过程的调控。由此表明,这4个毛竹mi RNA在胚芽萌发过程可能具有重要作用,研究结果对进一步发展毛竹分子育种提供一定理论参考。     

大豆耐盐基因GmHAL3a的克隆及RNAi载体的构建

利用同源克隆方法从大豆中克隆到一个耐盐基因HAL3,命名为GmHAL3a,组织表达分析发现GmHAL3a基因在大豆根中表达量最高,荚中次之,叶中表达量最低;非生物胁迫实验表明该基因受NaCl、LiCl和山梨醇诱导表达;通过生物信息学的方法分析发现该基因具有2个跨膜螺旋区域,可能定位于叶绿体中;同源序列比对证实该基因氨基酸序列具有与其他物种相似的保守位点:黄素单核苷酸(FMN)结合位点和磷酸泛酰半胱氨酸(PPC)脱羧酶活性位点。同时扩增了这个基因的2个干扰片段,用Gateway技术将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR221,测序后又通过LR反应分别将目的片段插入到RNAi载体pB7GWIWG2(Ⅱ),再转入根癌农杆菌EHA105中。这2个载体的构建对于进一步研究大豆中GmHAL3a基因的功能具有重要意义。     

RNAi干扰油菜Δ12-脂肪酸脱饱和酶基因的表达效果

为进一步研究RNAi介导的Δ12-脂肪酸脱饱和酶（FAD2）干扰基因对油菜内源FAD2基因表达的影响,以油菜肌动蛋白(β-Actin)基因为内参照基因,提取转基因油菜幼嫩种子总RNA,通过半定量RT-PCR检测内源FAD2基因的相对表达量。结果表明,T1,T3代转基因种子中FAD2基因的相对表达量与对照相比明显降低。对T3代种子的油酸含量的分析表明：转基因油菜种子中油酸的含量比野生型增加了13.90到32.20个百分点,直接说明RNAi干扰体下调了FAD2基因的表达。因此,种子内源表达的FAD2基因被RNAi干扰体有效沉默,并且产生了能够稳定遗传两代的表型变化。     

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究

为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR方法分析外源基因在转基因植株中的拷贝数.PCR和双酶切鉴定表明,玉米PEPC cDNA序列已插入双元表达载体pCAMBIA3301中,命名为p3301-pepc;对获得的抗性再生植株进行PCR扩增,其中有342株扩增出目的条带;在选取的15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株.初步证明玉米pepc基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝插入,这为进一步研究该基因在小麦基因组中的功能表达提供了试验材料.     

四种油料作物中的细菌型PEPC基因的鉴定及在发育种子中的表达

鉴定和获取了四种油料作物（油菜、大豆、花生和芝麻）中的细菌型PEPC基因,分析了所编码蛋白的保守结构域（BOX I-IV）和蛋白作用功能位点。基因包括甘蓝型油菜的Bna10093361、Bna1009749和Bna10093360,大豆的Glyma10g34970.1, Glyma01g22840.1和Glyma02g14500.1,芝麻的SIN1018296和花生的AhPPC5。这8个基因含有19～21个内含子,内部插入一个约350～600bp的高度变异区,编码的蛋白在C端形成R/KNTG结构域,在N端缺乏磷酸化作用位点。在种子发育的不同时期,油菜中仅Bna10093360表达,但其表达量不到油菜BnActin表达量的0.1%;大豆中Glyma10g34970.1表达量最高（接近大豆GlymaActin的2%）,Glyma02g14500.1次之;花生AhPPC5表达量为花生AhActin的32%～175%,在种子不同发育时期表达量为早期>中期>晚期;芝麻SIN1018296表达量为芝麻SINActin的3%～18%,在种子发育时期的表达趋势和花生AhPPC5相似。8个基因种子中的表达模式差异明显,说明细菌型PEPC基因可能存在着广泛的功能分化。       

甘蓝型油菜耐湿性的遗传差异鉴定

9个不同遗传背景的甘蓝型油菜品种（系）在室内进行发芽种子水淹和春季田间模拟湿害条件下，研究油菜对湿害胁迫的耐湿遗传差异。结果表明，不同油菜品种（系）对湿害具有较大的遗传差异。发芽种子湿害胁迫后，耐湿品种中双8号和中双9号等品系（种）具有较强的耐湿性，表现为发芽湿害处理后活力指数、成苗率、相对苗长、相对根长和相对苗重等显著较高，田间湿害后单株有效果数、每角粒数和单株粒重的降低程度显著低于其他品种，而且千粒重显著提高，含油量和蛋白质变化不显著。不耐湿的品种如GH01等活力指数、相对苗长、相对苗重、单株粒重、每角粒数含油量等显著降低，蛋白质含量显著提高。相关分析表明，发芽种子耐湿活力指数与花期田间湿害后的产量性状耐湿指标具有显著或极显著的相关关系。     

春性甘蓝型油菜EMS突变体库的构建与筛选

创制突变体库是甘蓝型油菜品种选育和重要性状遗传解析的重要基础。春性甘蓝型油菜开花不需漫长的春化过程,生育期短,在创制突变体库方面具有独特优势。本研究采用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变春性油菜862种子,以构建春性油菜EMS诱变突变体资源库。通过比较8种不同浓度EMS（0~1.4%,间隔0.2%）对发芽率的影响,最终确定使用0.8%的EMS作为最佳处理浓度,发芽率为37.2%。田间种植筛选与表型统计初步鉴定了M2代1823个单株的形态学性状,突变频率为3.91%,主要包括叶色、叶形、株高、株型、角果长短、种粒大小、种皮颜色、种子含油量以及其它性状变异等,突变类型十分丰富。该突变体库的构建为油菜功能基因组学研究和分子育种提供表型多样的种质资源。     

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD)基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD)核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、葵花等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。本文还对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1:1、BnSAD2:1、BnSAD2:2和BnSAD2:3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP (C18:0-ACP)脱氢生成油酰基ACP(Δ9C18:1-ACP)的过程,尤其是BnSAD2:3可能为种子特异表达基因。     

缺氧对甘蓝型黄籽与黑籽油菜发芽的影响

随机选取甘蓝型黄籽、黑籽油菜各20个品系,将萌发中的种子进行淹水缺氧处理,观察黄籽、黑籽品系耐湿性表现.结果表明,甘蓝型黄籽油菜的相对成苗率、相对苗高、相对苗重、活力指数低于黑籽油菜,单位电导率高于黑籽油菜.无论是黄籽油菜还是黑籽油菜,品种间的耐湿性差异都很大.电导率与活力指数之间有极显著的负相关,可用来快速筛选油菜耐湿性材料.     

种子芥酸和硫苷含量对甘蓝型油菜遗传转化的影响

选取低硫苷低芥酸含量的甘蓝型油菜品种“湘油15号”和“Westar”,高硫苷高芥酸含量的甘蓝型油菜品系“GX-272”和“GX29”,利用农杆菌介导法,以pFGC5941为目标载体,分别对其进行遗传转化。以磷化麦黄酮（PPT）作为筛选剂,分别对4个油菜品种（系）的子叶柄分化率和转化率进行统计。结果表明,双低油菜“湘油15号”、“Westar”的子叶柄分化率高于高硫苷高芥酸油菜“GX-272”和“GX29”;而高硫苷高芥酸油菜“GX-272”和“GX29”的转化率则高于双低油菜“湘油15号”、“Westar”。初步认为种子中硫苷和芥酸含量对甘蓝型油菜子叶柄遗传转化的分化率和转化率有一定影响。     

不同钾效率类型油菜的农艺性状及钾素积累特征比较

为了解甘蓝型油菜不同钾素利用效率的植株所具有的表型特征,以长江流域冬油菜主产区广泛种植的34个甘蓝型油菜品种为试验材料,在田间试验小区以最佳肥料用量（每公顷210kg 氮,45kg五氧化二磷,67.5kg氧化钾）种植油菜,比较不同品种油菜对钾素的吸收利用率。根据平均值法可将材料分为四类：A-高效吸收高效利用型、B-低效吸收高效利用型、C-高效吸收低效利用型、D-低效吸收低效利用型。比较发现：A类的一次分枝数、一次分枝角果数、籽粒产量和茎秆干物质均显著高于B、C、D三类,每角粒数显著大于D类,而分枝节位则显著小于D类。A类籽粒钾含量和钾（氧化钾）积累显著高于其他类型。地上部钾积累总量表现为A（和C）高于B（和D）。     

河南省甘蓝型油菜细胞质雄性不育杂种优势研究应用及展望

河南省对甘蓝型油菜细胞质雄性不育杂交种产量及有关性状、抗逆性和品质性状等杂种优势及其遗传特性、生理生化基础等进行了研究。采用细胞质雄性不育系统育成了40多个强优势双低油菜杂交种,其产量、品质和抗逆性等方面均有显著提高,已在生产上广泛应用。河南省在2003-2016年平均单产为2288.6kg/hm2,比1978 -2000年的平均单产提高50%,比全国同期平均单产高23.58%。今后河南省在甘蓝型油菜细胞质雄性不育杂种优势研究与利用方面,重点是选育和推广高含油量、抗倒伏、抗裂角适应机械化生产的强优势杂交油菜品种,同时加强抗根肿病的防控和抗病品种选育,充分挖掘油菜在菜用、肥用、饲用、蜜用和观赏等多功能利用潜力。     

敌草快对成熟期油菜脱水和种子质量的影响

为适应机械化收获对种子成熟的要求,研究化学催熟剂敌草快对油菜角果脱水和种子质量的影响,选用甘蓝型油菜品种阳光2009在油菜成熟期进行田间喷施敌草快试验,测定菜籽含水量、发芽率、千粒重、品质和敌草快残留。结果表明:于油菜角果黄熟期主花序角果转色时用1.8L/hm2的敌草快水剂喷施处理6d,与自然成熟(喷施等量清水)的对照组和人工割晒组相比,油菜脱水效果显著,角果和籽粒含水量分别为7.8%和10.49%;与对照组相比,角果和籽粒含水量分别下降52.66%和24.84%。该浓度处理下对油菜发芽率、千粒重及品质均未产生显著影响,其中发芽率达99%,贮藏2周的油菜种子中敌草快残留量为0.13mg/kg,符合中国和英国的安全标准;贮藏3周未检测到敌草快残留。建议加快敌草快在油菜催枯用途方面的农药登记,推进我国油菜全程机械化技术的应用。