农杆菌介导的人白细胞介素-4基因转化甘蓝的研究

以结球甘蓝‘92-1012-3-11’自交系种子转白细胞介素-4(IL-4)基因T0代材料为试材,研究了通过农杆菌介导法将人IL-4基因导入甘蓝后代的遗传转化情况.结果表明:共得到抗草铵磷(PPT)抗性再生植株396株,聚合酶链式反应(PCR)阳性植株137株,其中带柄子叶转化率为8.1％,下胚轴分化率为5.8％.通过对转基因阳性株T0代的PPT抗性筛选、PCR、PCRSouthern杂交检测获得IL-4阳性甘蓝植株,表明IL-4基因已转入甘蓝受体中.经ELISA和Western检测,说明IL-4基因已整合到甘蓝基因组,但表达量很低(0.23～2.81 ng/mL),且各植株间的表达量差异极大.     

甜瓜反义酸性转化酶基因对甜瓜的遗传转化

利用子房注射法将甜瓜反义酸性转化酶基因导入厚皮甜瓜自交系‘0123’果实, 应用PCR和Southern Blot对后代进行分子鉴定。结果表明, 330株甜瓜转化植株中, 有2株为阳性转基因植株, 转化率约为0.6%。进一步研究发现, T0代转基因甜瓜植株生长势减弱, 果实比对照小30%左右, 但可溶性糖含量比对照提高了52%。PCR和PCR - Southern Blot鉴定表明, T0-1的自交后代没有基因丢失, 反义酸性转化酶基因已在转基因植株中稳定遗传。T1代转基因植株生长势也明显减弱, 但成熟果实可溶性总糖含量提高了26% , 蔗糖含量比对照提高了2.5倍, 果糖和葡萄糖含量略有降低, 酸性转化酶活性比对照明显降低。这些结果表明, 反义酸性转化酶基因通过降低酸性转化酶活性, 调控了甜瓜果实蔗糖代谢过程, 改变了甜瓜果实糖分组成, 同时抑制了植株生长。     

结球甘蓝自交系YL-1的高效遗传转化体系的建立及应用

为了筛选结球甘蓝高效遗传转化受体材料,以高代自交系YL-1、21-3、12J35、650为试材,比较不同材料具柄子叶和下胚轴的再生频率差异。在4份供试材料中,YL-1为最优转化受体,再生频率显著高于其他3份材料;YL-1具柄子叶和下胚轴的再生频率无显著差异,均可用于遗传转化。进一步对YL-1遗传转化过程中光照强度、Basta除草剂浓度、农杆菌侵染浓度等关键影响因素进行优化,发现光照强度为4 000 lx时更有利于不定芽诱导;除草剂最适筛选浓度为8 mg·L~(-1);农杆菌侵染浓度OD600=0.3侵染8 min,YL-1抗性芽再生频率最高。基于建立的高效遗传转化体系,共获得47株抗除草剂植株,PCR检测显示其中12株为阳性,初步表明bar基因已转化到甘蓝中,转化率达到2.18%。利用转录组测序技术对2株PCR阳性材料进行基因表达分析,均检测到bar基因高效表达。甘蓝高代自交系YL-1高效遗传转化体系的建立可为今后结球甘蓝基因功能鉴定及重要农艺性状的改良提供基础。     

甜瓜芽黄标记性状的发现与遗传分析

为了使甜瓜芽黄标记性状能够更好地应用于甜瓜育种工作,笔者利用在本单位甜瓜试验地发现的甜瓜芽黄突变材料,研究了甜瓜芽黄资源的遗传规律。通过进行单株自交留种,并与正常叶色材料配制正、反交组合,其F1代均表现为正常叶色;对正、反交F1代与芽黄性状植株进行测交和自交,并对其测交后代与F2代的正常叶色植株与芽黄植株分离结果进行统计分析,结果表明,测交分离后代中正常叶色植株与芽黄植株的比率均接近于1∶1,正、反交F2代中正常叶色植株与芽黄植株的比率均接近于3∶1,经X2c适合性测验,差异不显著;同时发现,甜瓜芽黄材料通过连续多代自交,其后代均表现为芽黄,说明甜瓜芽黄突变性状可稳定遗传,属1对隐性基因控制的细胞核遗传。     

转MLPK反义基因对甘蓝自交不亲和性的影响

对反义MLPK基因在甘蓝柱头特异启动子SLR的驱动下,通过农杆菌介导转化法将其导入高度自交不亲和甘蓝材料‘TF’。转基因甘蓝T0代植株定量PCR分析结果显示,不同的转MLPK反义基因单株内源MLPK mRNA积累量具有明显差异,其中转基因植株花期柱头内源MLPK mRNA积累量明显低于野生型对照。花粉原位萌发的荧光显微镜观察结果显示,转基因甘蓝植株花期自交后,吸附在柱头上的花粉粒大量萌发,且穿过柱头的花粉管明显增加,并导致花期自交结籽数上升,转基因植株花期和蕾期自交亲和指数均明显高于野生型对照植株。结果表明,下调MLPK基因表达能部分打破甘蓝自交不亲和,提高其花期自交结籽能力。     

农杆菌介导的BnCS基因对黄瓜遗传转化研究

以黄瓜为受体,用农杆菌介导的方法,将同源克隆的抗冷基因BnCS转入黄瓜,建立农杆菌介导的遗传转化体系,获得转化的抗性植株;对抗性植株和后代进行PCR鉴定,证明BnCS基因已经转入黄瓜.对T0种子和T1植株进行耐冷性鉴定.结果表明:后代耐冷性有所增强;试验获得的耐冷材料已应用于育种中.     

添加甘蓝2号染色体片段的大白菜易位系的获得及其遗传稳定性分析

为创建大白菜—结球甘蓝易位系,以大白菜—结球甘蓝2号单体异附加系(AC_2)为试材,对其花蕾辐射后获得的M_2植株进行游离小孢子培养。利用与结球甘蓝2号染色体对应的26个InDel标记对小孢子植株进行鉴定,结合细胞学观察,确认获得了6株添加甘蓝2号染色体片段的大白菜易位系植株。通过对InDel标记的加密设计,明确了6个大白菜易位系植株中均含有甘蓝特异标记C09-4和C09-4-52,片段大小为788.3 kb。选择两个来自不同M2单株的大白菜易位系‘AT2-1’和‘AT2-2’进行自交、回交及与大白菜高代自交系杂交,利用结球甘蓝特异的InDel标记对其后代进行鉴定。结果表明,两个大白菜易位系的85份自交后代、82份回交后代及188份杂交后代中均含有甘蓝特异标记C09-4和C09-4-52,说明这些易位系中的甘蓝染色体片段能够稳定遗传。     

转基因抗病毒病四倍体西瓜的培育

利用西瓜花叶病毒2号(WMV-2)外壳蛋白(CP)基因、小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)复制酶(NIb)基因和黄瓜花叶病毒(CMV)复制酶基因构建三价基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化四倍体西瓜植株,经分子检测证明目的基因成功地导入西瓜植株,并在后代中稳定遗传。经温室及大田接种鉴定,T3代转基因西瓜抗病毒性达中抗水平,为抗病毒无籽西瓜新品种的培育提供了可能性。     

EL-F_1厚皮甜瓜后代分离群体快速稳定与利用研究

应用模糊聚类方法,以果实多种性状综合差异为依据,对EL—F_1厚皮甜瓜后代分离群体进行了连续3代分离选择,所得EL-1和EL-2两个群体性状稳定性好.聚类结果表明,两种群体内个体性状差异远小于传统分类所得群体T-1.对以EL-1为母本配制的4个杂交组合进行田间鉴定,植株生长发育良好,抗霜霉病,高抗白粉病;果实性状稳定,多数经济性状明显优于母本.     

基因枪法和农杆菌介导的Bt抗虫基因转化芥蓝

以芥蓝品种小香菇为试材,分别采用基因枪法和农杆菌介导转化法将Bt抗虫基因Cry2Aa2转化到芥蓝中,并对两种转化方法进行了优化和比较。结果表明:基因枪法在轰击距离为6cm、轰击次数为1次时转化效率最高,为0.43%;农杆菌介导转化法以带子叶下胚轴为外植体、预培养2d、侵染10min、共培养2d、抑菌培养5d后转入筛选培养基为最佳参数,转化效率为0.37%。经PCR和PCR-Southern鉴定,基因枪法和农杆菌介导转化法均成功将目的基因导入芥蓝基因组中。经抗虫性表型鉴定,T_0代转基因芥蓝植株对甘蓝夜蛾幼虫的抗性高于非转基因植株。     

CsFAD7基因转化烟草的研究

以"革新一号"烟草种子为试材,采用根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法将来源于黄瓜的脂肪酸去饱和酶基因(FAD7)转入烟草,并在附加300mg/L氨苄青霉素(Amp)的MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA的培养基上诱导植株分化,再生芽在附加300mg/L Amp和100mg/L卡那霉素(Kan)的MS培养基上生根,获得再生植株。结果表明:Kan阳性植株经PCR检测筛选,得到转基因阳性植株,证明异源FAD基因已转入烟草基因组中。T1代经PCR-South-ern检测证明转化基因可以遗传;转基因烟草在低温胁迫下生长较好,叶绿素荧光参数F0值下降不大,Fv/Fm值保持较高,表现了对低温的耐受能力,脂肪酸分析表明,该基因可以使烟草叶片的亚麻酸含量比例升高。     

苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

辣椒CaSn 基因超表达增强转基因烟草对南方根结线虫的抗性

 CaSn 基因是在辣椒（Capsicum annuum）‘Santaka’中发现的新型抗菌肽Snakin 家族基因。 通过RT-PCR,将CaSn 基因从辣椒中分离并构建到pBI-121 植物表达载体,通过农杆菌EHA105 介导转 化白肋烟（Nicotiana tabacum‘White burley’）,筛选到10 个独立的转基因株系,并对T1 代植株进行抗 南方根结线虫（Meloidogyne incognita）鉴定及靶标基因表达分析。结果表明CaSn 已转入白肋烟,能够进 行超量表达,并且转CaSn 基因白肋烟上的根结数量比转空载体对照和非转基因对照减少70%,同时不同 转基因烟草株系间对南方根结线虫的抗性也存在着一定差别。通过试验证明了辣椒中的抗菌肽基因CaSn 具有抗南方根结线虫作用,对于植物抗线虫资源的挖掘及利用提供了重要理论依据。     

黄瓜Rubisco 活化酶基因CsRCA 表达载体构建与遗传转化

 核酮糖–1,5–二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）是光合碳循环中的关键酶,为了探明其在植物体内的活化机制,用农杆菌介导法将Rubisco活化酶（RCA）基因CsRCA导入黄瓜,分别用PCR、real-time PCR和Western杂交法进行分子检测,分析转基因植株的表达量。酶切鉴定结果显示,CsRCA正向插入植物表达载体pCAMBIA1301的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,成功构建CsRCA的正义表达载体。将pCAMBIA1301-CsRCA导入黄瓜自交系‘08-1’,获得7株转基因植株,拷贝数均为2（非转基因植株的拷贝数为1）,转化率约为3.5%。表达分析结果表明,7株T0代转基因植株叶片的CsRCA mRNA表达量为野生型（WT）的1 ~ 1.98倍,在蛋白水平的表达信号显著强于WT。T1代转基因植株的叶片叶绿素和类胡萝卜素含量、光合速率（P_n）及可溶性糖和淀粉含量均显著高于WT。研究结果表明,利用农杆菌介导法获得了稳定遗传的黄瓜CsRCA转基因植株,CsRCA过量表达能显著提高黄瓜叶片的P_n,增加干物质积累。     

雪花莲外源凝集素基因在大白菜中的表达和抗蚜性遗传分析

 通过农杆菌介导法将雪花莲外源凝集素基因(gna)导入了大白菜自交系282。分子检测和抗虫试验表明gna基因已整合进大白菜基因组，转基因植株较非转化对照植株有一定的抗蚜虫能力，抗虫性好的植株可以检测到较强的gna基因转录产物；后代遗传分析表明外源基因在转基因大白菜植株282-3和282-9的T₁代呈3:1的孟德尔分离比例。     

草莓主栽品种再生和转化的研究

 建立草莓主栽品种高效、稳定的离体再生体系和遗传转化体系, 获得了转基因植株。‘弗吉尼亚’和‘森嘎拉’的叶片离体再生芽频率达到100 %。试管苗叶片与农杆菌菌株EHA105 共培养3 d。共培养后的叶片在附加卡那霉素40 mg/L 的再生培养基上选择培养4周后, 外植体再生出转化芽, 弗吉尼亚的转化芽再生频率可达6. 8 %。采用组织化学染色法对随机选取的10 个GUS 基因转化植株进行基因表达测定, 结果5 个植株强烈表达GUS 活性。转bar 基因植株在附加除草剂草丁膦10 mg/L 的培养基上能够正常分化, 在田间对草丁膦表现出强烈抗性。转基因植株开花、结果正常。     

农杆菌介导ODREB2B基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种黄麻子和中薯3号脱毒微型薯为外植体，利用根癌农杆菌介导法，将来源于诸葛菜的抗逆相关转录因子ODREB2B基因导入马铃薯，并对遗传转化的影响因素进行优化。获得抗性植株黄麻子33株、中薯3号27株，经PCR-Southern杂交分析，两品种分别有16株和14株呈阳性，证明ODREB2B基因已整合到马铃薯基因组中。