西瓜转基因抗病毒病新材料BH-1

西瓜新材料BH-1,是导入了西瓜花叶病毒(WMV)外壳蛋白基因、小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)复制酶基因、黄瓜花叶病毒(CMV)复制酶基因的转基因新材料。经温室及大田抗病毒病鉴定表明其抗性达中抗以上水平,是我国第1个通过转基因获得的抗病毒病西瓜新材料。     

西瓜转基因抗病毒病新材料BH-1

西瓜新材料BH-l，是导入了西瓜花叶病毒(WMV)外壳蛋白基因、小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)复制酶基因、黄瓜花叶病毒(CMV)复制酶基因的转基因新材料。经温室及大田抗病毒病鉴定表明：其抗性达中抗以上水平，是我国第1个通过转基因获得的抗病毒病西瓜新材料。     

小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因导入西瓜的遗传转化

研究了西瓜品种ZKM的再生体系和农杆菌介导小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellowmosaic virus,ZYMV)的外壳蛋白(cp)基因导入西瓜的遗传转化体系。结果表明,质量分数0.6%琼脂是适宜种子萌发的基本培养基,切取5d龄的西瓜无菌苗子叶为外植体,接种在MS+BA2.0mg/L诱导培养基上,诱导不定芽效率最高。选用75mg/L卡那霉素筛选西瓜抗性芽较为合适,外植体经预培养2～3d,菌液浓度以OD600nm值为0.4,共侵染10min有利于提高西瓜转化的效率。经PCR检测,ZYMVcp基因已经导入西瓜植株,转化频率为0.15%。     

农杆菌介导西瓜转葡聚糖酶及几丁质酶双基因

采用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法将含有葡聚糖酶基因和几丁质酶基因表达载体遗传转化西瓜(Citrulluslanatus),遗传转化体系为以子叶为外植体经过组织培养获得再生植株。结果表明,Kan抗性芽的分化率随着共培养时间的延长先上升后下降,GUS阳性芽的百分率逐渐升高,共培养时间30h后,GUS阳性芽的百分率趋于平稳,同时,通过对候选转基因植株中GUS基因染色鉴定、卡那基因、葡聚糖酶基因及几丁质酶基因特异引物PCR检测,表明葡聚糖酶和几丁质酶基因已成功导入西瓜植株中,转基因植株的表现在进一步研究中。     

黄瓜CMV复制酶基因相对表达定量PCR方法的建立

为了对黄瓜感染CMV植株体内CMV复制酶基因表达水平进行测定,建立CMV复制酶基因的相对表达定量检测技术,并用该方法开展黄瓜植株CMV抗性鉴定试验,以18SrRNA基因为对照,CMV复制酶基因为目标基因,设计引物,探索SYBRGreen实时荧光定量PCR反应体系,同时对CMV复制酶基因进行均一化处理,利用荧光阈值(Q值)计算p-防御素基因的相对表达量。结果表明:利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术测定黄瓜CMV复制酶基因相对表达定量具有较高的准确性,耗时短,该技术可应用于CMV抗性植株的筛选。     

Cry2Aa2 和PamPAP 双价表达载体的构建及其对辣椒的遗传转化

 为了获得既抗虫又抗病毒病，又对人体和环境安全的转基因辣椒（Capsicum annuum L．）材料，将启动子CaMV35S、终止子Nos-ter 及缺失无毒型商陆抗病毒蛋白基因PamPAP 一起插入到植物表达载体pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PMI 的多克隆位点上，构建双价表达载体，采用农杆菌介导法将其转入辣椒中，并用PMI/甘露糖筛选体系对转化植株筛选。经PCR 扩增和Southern 杂交检测，结果表明Cry2Aa2和PamPAP 已经整合到辣椒基因组中。进一步经RT-PCR 分析，证实Cry2Aa2 和PamPAP 在T₀ 代转基因辣椒植株中共表达。经抗虫性、抗病毒病表型鉴定：T₀ 代转基因辣椒植株对黄瓜花叶病毒（CMV）和斜纹夜蛾幼虫的抗性均显著高于非转基因植株。     

北京顺义西瓜病毒病的检测

以北京市顺义地区疑似病毒病症状的西瓜植株上典型的发病叶片和果实为试材,采用反转录PCR(RT-PCR)方法对叶片和果实的4个部位(瓜皮、瓜瓤、果蒂和瓜柄)共5个样品进行病毒检测,以期了解引起西瓜病毒的种类,为西瓜病毒病的防控提供参考。结果表明:在西瓜上共检测到了3种病毒,分别为西瓜花叶病毒2号(watermelon mosaic virus-2,WMV-2)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)。从5个样品中均检测到了WMV-2,从瓜皮、瓜瓤和果蒂上检测到了ZYMV,从瓜瓤和果蒂上检测到了CMV。从同一个果实的不同部位检测到了这3种病毒,说明果实中的病毒为复合感染,从叶片和果实中均检测到了WMV-2,说明WMV-2为北京顺义西瓜田间病毒的优势种。     

筛选抗西瓜花叶病毒(1及2)西瓜(初报)

共150份地理来源不同的材料,用苗龄3周带西瓜花叶病毒1和2的切穗接种。高抗材料中生长良好的植株越冬后,再次进行抗性评价,从选出的植株上取1～4个切穗,在田间条件下繁殖接种。自印度引入而存活的西瓜,具有极好的园艺性状,但不抗两种花叶病毒。来自非洲的材料对两种花叶病毒,具有最好的抗     

利用西瓜种子检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

以疑似感染黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的西瓜植株上收取的种子为材料,提取总RNA为模板进行RT-PCR扩增,并对电泳后的目标条带进行回收测序,将测序结果提交genebank与已知序列比较,结果显示所扩增序列为CGMMV外壳蛋白(CP)基因中的一个片段,说明此方法可以成功检测出西瓜种子携带的CGMMV,可作为一种快速检测西瓜种子是否携带CGMMV的方法。     

转基因西瓜研究进展

综述了西瓜转基因常用的方法、目前已获得的转基因西瓜性状以及转基因西瓜安全性等方面的研究进展，并提出了今后进一步的研究方向。西瓜转基因常用方法为叶盘转化法；将外源基因导入到西瓜基因组中常用的方法主要有农杆菌介导法和花粉管介导法；常采用PCR、Southern和Western等方法来检测和鉴定外源基因是否成功整合到西瓜基因组中；目前利用转基因技术改良的西瓜性状主要集中在培育抗病毒、抗枯萎病和耐旱、耐盐碱等方面；对转基因西瓜的安全性研究主要包括生态安全性和食品安全性2个方面。今后应利用转基因技术进一步提高西瓜营养品质、耐贮性和抗冻性等性状，并进一步加强对转基因西瓜安全性的研究。     

西瓜PRSV-W和ZYMV-CH抗性的遗传与连锁分析

番木瓜环斑病毒西瓜株系（PRSV—W）和小西葫芦黄化花叶病毒中国株系（ZYMV—CH）是危害我国西瓜的主要病害。以抗病毒病西瓜野生种质P．I．595203与感病普通西瓜自交系98R为亲本，采用单粒遗传方式得到109个F3代株系。分别对亲本、F1及F3代109个株系群体进行了苗期抗PRSV—W和ZYMV—CH接种鉴定，通过F3代群体的抗感分离情况来推测F2代单株的基因型，并分别对PRSV—W与ZYMV—CH抗性遗传及其这2个抗性基因的连锁关系进行分析。研究结果发现P．I．595203对PRSV—W的抗性是由单隐性基因控制，同时可能存在微效修饰基因，将此基因暂定名为prs—W；同时进一步证实了西瓜对ZYMV—CH的抗性由单隐性基因zym-CH控制，zym-CH和prs-W2个抗性基因在遗传上存在一定连锁关系，其遗传距离是27cM。     

葡萄病毒病研究进展

综述了近5年来国际葡萄病毒病最新确立的病毒属、鉴定的新种及几种重要葡萄病毒形态、基因组、病原、病毒检测技术及防治策略。葡萄病毒已由1999年的17个属,47种增加到2003年的20个属,55种。其中葡萄病毒属(Vitivirus),凹陷病毒属(Foveavirus)、葡萄斑点病毒属(Maculavirus)和葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)为新确定的4个属。已完成葡萄扇叶病毒(GFLV)和葡萄斑点病毒(GFkV)的全序列测序(2001年)。新发现葡萄卷叶相关病毒-9号(GLRaV-9)(2002年)。新增加GLRaV-8和葡萄D病毒(GVD)的单克隆抗体和沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)的多克隆抗体。RT-PCR技术已成功地应用于GRLaV-1、GRLaV-2、GRLaV-3、GRLaV-4、GRLaV-5、GRLaV-6、GRLaV-7、GVB、GVA、GVD、GRSPaV、葡萄拟卷叶病毒(GFkV-likeviruses)、GFLV和南芥菜花叶病毒(ArMV)等病毒及葡萄病毒属(Vitivirus)和凹陷病毒属(Foveavirus)病毒的检测。GFLV、ArMV、GVA及GVB和GVA、GFLV、GLRaV-2、GLRaV-3外壳蛋白(CP)基因已分别导入到欧洲葡萄(Vitisvinifera)和沙地葡萄(Vitisrupestrsis)及其他砧木中,目前仍在检测阶段。     

抗菌肽基因Gnk2-1经花粉管通道法导入西瓜的初步研究

 通过花粉管通道介导银杏抗菌肽基因Gnk2-1 于西瓜自交系‘04-1-2’中，以浓度为100、200、 300 和400 ng · μL-1 的DNA 为供体，分别于授粉后24、27、30 和33 h 导入，对子代进行PCR 检测。结 果表明：T0 代坐果率和单瓜结籽数随授粉后处理时间的增加而升高，但在各个处理时间下均显著低于对 照；外源DNA 的导入对授粉后27 h 处理的T1 代种子发芽率和授粉后24 h 处理的T1 代种子出苗率均造成 显著降低；不同DNA 浓度转化的T1 代种子的发芽率和出苗率与对照相比差异不显著；对1 280 株T1 幼 苗进行PCR 检测，得到32 株阳性转化植株，总体转化率为2.5%，最佳转化时间为授粉后24 ~ 27 h，最佳 DNA 转化浓度为100 ~ 200 ng · μL-1；PCR 阳性植株抗病鉴定表明转基因植株对西瓜枯萎病的抗性有所增强。     

低温胁迫下西瓜同源二倍体和三倍体甲基化及基因表达的差异分析

为了揭示西瓜二倍体及三倍体在低温胁迫下的耐冷性分子机制,以西瓜二倍体自交系‘83166’（‘京欣1号’品种的母本）及其同源三倍体为材料,利用MSAP及cDNA-AFLP技术研究低温处理前后基因表达的差异,并对差异带进行克隆、测序和比对。28对MSAP引物扩增得到2 356个位点,其中二倍体经低温处理后总甲基化率下降8.5%,三倍体下降10.4%。将13条差异带与西瓜基因组数据库比对,有7条带确定是西瓜基因组序列。26对cDNA-AFLP引物组合扩增出1 267条带,其中二倍体上调表达占48.2%,下调表达占51.8%;三倍体上调表达占51.3%,下调表达占48.7%。21条差异带在NCBI中找到了同源序列基因,包括假定蛋白（38.1%）、能量与代谢（38.1%）、信号转导（9.5%）、物质运输（9.5%）以及DNA修饰（4.8%）,另有9条无同源序列。低温胁迫后,三倍体去甲基化率与上调表达量均大于二倍体,而且三倍体诱导出更多的差异基因参与了能量代谢调控、信号转导、物质运输等过程,说明在抵御低温胁迫中三倍体比二倍体有更强的耐冷性。     

西瓜核心种质枯萎病抗性与SRAP 分子标记的关联分析

 对35 份西瓜核心种质进行了抗枯萎病鉴定,再采用SRAP 分子标记技术对35 份核心种质进行多态性分析。从63 对引物组合中筛选出46 对多态性引物。SRAP 扩增共产生445 个条带,其中262条为多态性条带,多态率为58.88%。平均每对引物产生9.67 个条带。在对供试材料进行群体结构分析的基础上,利用TASSEL 软件对多态性标记与枯萎病抗性进行关联分析。群体遗传结构分析将35 份西瓜核心种质分为3 大群体：1 个野生西瓜群体和2 个栽培种群体。分析发现在2 个栽培种群体中存在基因渗透。聚类分析结果与群体遗传结构分析结果一致,分为4 个类群,其中第2 类群又细分为5 个小类群。聚类分析结果说明具有相同抗性水平的材料倾向于聚在一起。关联分析发现有1 个标记位点与枯萎病抗性显著关联（P < 0.01）,该位点对表型性状的解释率为0.2035。本研究结果表明利用SRAP 标记可以有效地对西瓜种质资源进行群体结构的划分,且关联分析能够找到与西瓜枯萎病抗性相关联的SRAP 标记,为西瓜抗病育种和分子标记辅助选择奠定了基础。     

西瓜短蔓性状的利用

对控制西瓜短蔓性状的4个不同基因位点的短蔓基因dw-1、dw-2、dw-3、dw-4(拟)的发现以及它们所具有的不同特性、形态特征、优缺点和应用前景进行了简要的描述和评价。     

木霉制剂对西瓜枯萎病的田间防治效果

利用3种不同的生防木霉菌株,经发酵并按照一定的助剂配比制成木霉制剂,并对西瓜枯萎病进行了田间防治试验.结果表明:3种木霉制剂T1、T2、T3对西瓜枯萎病具有明显的防治效果,田间防效达71.4％～85.4％,增产效果达16.07％～24.70％.其中木霉制剂T1、T3防效及增产效果好,且对西瓜植株具有一定的促生长作用.     

钾肥水平对不同类型西瓜嫁接苗生长的影响

为研究不同类型嫁接西瓜苗期的需钾特征，对6个不同钾肥水平下的大果型西瓜品种“丽园”、中果型西瓜品种“8424”和小果型西瓜品种“小红玉”嫁接苗的生长指标进行测定分析。结果表明：不同钾肥施用量对嫁接西瓜幼苗叶片叶绿素含量、株高、茎粗、生长量和壮苗指数均有不同程度影响，小果型西瓜叶片叶绿素含量各处理均高于中果型和大果型西瓜；大果型和中果型西瓜在钾素水平T4(N-P2O5-K2O为17-17-34)时，幼苗茎粗、全株干质量及壮苗指数均达到最大值，而小果型西瓜在钾素水平T3(N-P2O5-K2O为17-17-25.5)时以上指标均达最大值。由此可知，适宜的钾肥施用量可促进西瓜嫁接苗健壮生长，且大、中果型西瓜幼苗需钾量高于小果型西瓜。     

不同化学药剂诱导西瓜抗病毒病试验

为了筛选出能够诱导西瓜对病毒病产生一定抗性的化学诱抗剂,在西瓜团棵期开始用硼酸、草酸、水杨酸、壳聚糖、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、硅酸钠等7种化学药剂在西瓜作物上进行对病毒病的诱导抗性试验。结果表明,1 g·L-1壳聚糖、5 g·L-1硫酸亚铁和1 g·L-1草酸处理均可使西瓜对病毒病产生一定抗性,能降低病毒病的发生,病情指数较低;其中1 g·L-1壳聚糖处理防治效果最好,防治效果达69.7%。不同的化学药剂具有不同的诱抗效果,其持续效果也各不相同。