利用VIGS技术研究马铃薯抗晚疫病基因R3a和RB的信号传导

 利用VIGS技术，在烟草中沉默已知的抗病信号传导关键基因SIPK、NDR1、SGT1、HSP90、NPR1、Rar1、EDS1、WRKY1，再瞬时表达马铃薯抗病基因和其相应的无毒基因RB-Avrblb1和R3a-Avr3a，根据过敏反应（Hypersensitive Response，HR）反应是否被阻断来研究RB和R3a介导的抗病信号传导。结果发现SGT1和HSP90基因沉默阻断了HR反应的发生，表明SGT1和HSP90是参与RB和R3a抗病信号传导途径过程中的关键基因。该技术体系的建立，为以后发现新的晚疫病抗病相关基因的功能验证提供了一个高效的技术平台。     

苹果MdDRB1基因在番茄中异位表达与功能研究

【目的】将苹果Md DRB1基因转入番茄中,探究苹果MdDRB1基因在番茄中的异位表达与功能。【方法】采用农杆菌介导法,将苹果基因Md DRB1转入番茄植物体内,用PCR检测到该基因已整合到番茄总DNA中。对获得的5个转基因番茄株系进行半定量RT-PCR分析,挑选MdDRB1基因表达水平由低到高的3个株系,用实时荧光定量PCR检测与生长素有关的mi RNAs及相应靶基因的相对表达量。并对非转基因和转基因番茄进行3μmol·L-1IAA和5μmol·L-1IAA处理,对植株进行向光性检测。【结果】转基因株系中miR164、miR160、mi R393表达量下调,mi R167表达量上调,同时,它们分别对应的番茄中的靶基因SlNAC1、SlARF10和SlARF16、SlTIR1的相对表达量上调,SlARF8相对表达量下调。IAA处理后,转基因株系幼苗的侧根数目比未转基因植株增多,同时,转基因株系幼苗的向光性也增强。【结论】苹果Md DRB1基因在番茄中的异位表达,通过抑制生长素响应相关的mi R164、miR160、miR393和增加miR167的积累水平,部分解除其对下游靶基因SlNAC1、SlARF10和Sl ARF16、SlTIR1以及增加Sl ARF8的转录后基因沉默作用,进而提高了转基因番茄对生长素响应的敏感性。     

马铃薯抗晚疫病基因R3a、R1和RB在番茄中的表达

 晚疫病由疫霉菌( Phytophthora infestans) 引起, 主要侵染番茄和马铃薯等茄科作物, 造成巨大的经济损失。马铃薯已有5个抗晚疫病基因被克隆。为了研究已克隆的马铃薯抗晚疫病基因是否在番茄中起作用, 将马铃薯的抗晚疫病基因R3a、R1和RB 通过农杆菌介导法分别导入番茄品种Moneymaker中。筛选得到的再生植株经PCR检测结果表明, 目的基因已整合入番茄基因组; 转基因番茄离体叶片接种验证结果表明, 接种马铃薯晚疫病菌株8914829 (即小种0) , 转基因番茄产生了抗病的过敏反应(HR反应) 。为了验证转基因番茄是否对番茄晚疫病菌株产生抗性, 用番茄晚疫病的主流小种和强致病力菌株共5个菌株接种转基因番茄植株, 结果表明转R3a和R1 基因的番茄对部分番茄晚疫病菌株能够产生抗性, RB转基因植株叶片对5个番茄晚疫病菌株均产生抗性。该研究为番茄抗晚疫病的基因工程育种开辟了新的途径。     

转MdSOS2L1基因苹果植株根际微生物多样性的研究

以野生型‘嘎拉’苹果和转MdSOS2L1基因植株为试材,利用高通量测序技术研究转MdSOS2L1苹果植株对根际微生物的影响。结果表明,转基因与野生型植株根际微生物群落丰富度和多样性存在较大差异,其中原核微生物群落变化最为明显。转MdSOS2L1植株根际酸杆菌门丰度增加较多,蓝藻、放线菌门丰度略有下降。同时,转基因植株根际土壤pH值低于野生型,并且转基因植株根际土壤的苹果酸、柠檬酸、草酸含量明显升高,两者非根际土无明显差异,转基因植株根际微生物的差异极有可能与MdSOS2L1基因介导的有机酸分泌有关。     

β–1,3葡聚糖酶基因转化提高苹果对斑点落叶病的抗性

为提高苹果抗病性,利用根癌农杆菌介导的叶片转化法,将带有NPTⅡ筛选基因、GUS标记基因及β–1,3葡聚糖酶目的基因质粒导入‘富士’和‘嘎拉’苹果。具有卡那霉素(Kan)抗性的转化株系,经GUS组织化学染色及PCR扩增检测,得到17个‘嘎拉’阳性株系和11个‘富士’阳性株系。选取‘嘎拉’和‘富士’各3个阳性株系进行Southern blot检测,结果表明外源目的基因已整合到所试转化株系中。选取‘嘎拉’及‘富士’各5个阳性株系进行半定量RT-PCR检测,除1个‘富士’株系没有条带外,其余株系均有阳性条带,且各条带的明亮清晰程度有差别,说明不同转基因株系中目的基因的表达量有差异。转化植株离体叶片接种苹果斑点落叶病菌进行抗病性表型检测结果证实,‘嘎拉’10个转化株系中8个株系表现抗病,7个‘富士’转化株系中2个株系表现一定的抗病性,抗病性的增强与目的基因的表达水平有关。     

荷花NnNHX1基因耐盐性在转化烟草中的验证

 为研究荷花液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因NnNHX1的耐盐性,构建了植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnNHX1,并通过农杆菌介导的叶盘转化法将NnNHX1基因转入烟草。利用荧光定量PCR分析NnNHX1在转基因烟草中的表达情况。对转基因烟草进行盐胁迫试验,并测定其在盐胁迫条件下叶绿素、脯氨酸和丙二醛含量、相对电导率、SOD和POD活性等相关生理指标及后代种子的发芽率。结果显示,在获得的7个转NnNHX1基因烟草株系中,T-N1、T-N2和T-N10等3个株系NnNHX1表达量较高。盐胁迫下,转基因烟草组培苗和盆栽苗的生长状况都好于对照植株,在叶绿素含量、脯氨酸含量、细胞质膜的完整性（相对电导率和丙二醛含量）和抗氧化酶（SOD和POD）活性等方面都好于对照,并且后代种子的发芽率也明显高于对照。表明荷花NnNHX1基因能够在烟草中正常翻译和表达,NnNHX1的过量表达提高了转基因烟草的耐盐性。     

利用沙冬青抗寒基因AmEBP1 转化杏的研究

 利用花粉管导入法,将沙冬青抗寒基因AmEBP1 转化到‘大果’杏幼胚中,在改良WPM 培 养基上经卡那霉素筛选,PCR、Southern 检测,结果得到5 个转基因阳性株系;组培苗抗寒试验结果表明, 相同低温（–4 和–8 ℃）条件下,转基因植株均比对照表现出较高的成活率;随着处理温度的降低,转 基因株系REC 与MDA 含量始终低于对照植株;转基因植株的低温半致死温度（LT50）比未转基因对照 低2.13 ℃。试验结果表明导入的AmEBP1 基因提高了‘大果’杏的抗寒性。     

湖北海棠二价融合表达载体MhT2AC的构建及转化烟草耐盐性分析

 利用口蹄疫病毒2A序列将湖北海棠MhTGA2转录因子和几丁质酶基因（Mhchitl）两个抗病相关基因融合在同一个开放阅读框下，构建二价融合植物双元表达载体，命名为MhT2AC。将该载体转化烟草，获得了8个转基因株系，MhTGA2基因和Mhchitl基因在烟草中共表达，并且转基因株系中NtSOD、NtAPX和NtPPO等抗逆基因的表达量均加强；转基因烟草T₁代植株抗盐性增强。     

CRISPR/Cas9技术在天目地黄RcPDS1基因编辑中的应用

为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用，克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1），利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘，通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示，克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列，其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸残基，基因组DNA序列长度8 041 bp，包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系，其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示，Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。     

抗菌肽MB39基因导入‘皇家嘎啦’苹果及其四倍体植株的培育

 采用农杆菌介导法, 将抗菌肽MB₃₉基因转入‘皇家嘎啦’苹果, 获得了7 个转基因株系。通过秋水仙素诱变染色体组工程育种技术, 由转化体叶片获得了20 个四倍体植株。经PCR 检测和Southern Blotting 杂交证明, 抗菌肽MB₃₉基因已经整合到皇家嘎啦苹果的染色体组中。转基因株系TR21、TR23 提高了对火疫病的抗性。采用流式细胞技术( Flow Cytometry) 确定植株为四倍体。     

甲壳素对连作平邑甜茶生长、光合及抗氧化酶的影响

以苹果连作土盆栽的平邑甜茶幼苗为试材,探讨了0、0.5、1.0和2.5 g·kg-1不同施入量的甲壳素对其光合速率、活性氧含量及抗氧化酶活性的影响。结果表明,1.0 g·kg-1的甲壳素处理能显著促进幼苗株高、地径,干样质量和根冠比的增加,根冠比为对照的1.51倍;明显提高了幼苗叶片光合色素含量、净光合速率和蒸腾速率,其中光合速率为对照的1.30倍;同时提高了幼苗叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,分别为对照的1.10倍、1.85倍、1.77倍和1.43倍;减少了叶片丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子的积累,分别为对照的73%、62%和34%,降低了脯氨酸(Pro)和可溶性糖含量。当甲壳素施用量为2.5 g·kg-1时则显著抑制平邑甜茶幼苗生长,降低幼苗叶片光合速率和抗氧化酶活性,并使超氧阴离子和脯氨酸含量明显上升。因此,适宜用量的甲壳素能减轻苹果的连作障碍。     

植物Gly-RLK基因家族鉴定及其在苹果中的表达分析

类受体激酶（receptor like kinase，RLK）在植物生长发育和环境适应中起重要作用。前期研究发现苹果（Malus  domestica）中存在一类具有Glyco_18胞外结构域（SM000636或SM000704）的RLK，命名为Glyco_18-RLK（Gly-RLK）。本试验中以Glyco_18和Pkinase（SM000220）保守域全蛋白序列为种子序列，对53种被子植物基因组中的Gly-RLK进行鉴定，并分析其进化特征；明确苹果Gly-RLK（MdGly-RLK）的理化性状、亚细胞定位，基因在染色体上的分布、启动子区域的顺式作用元件和表达模式。结果表明，仅19种植物中存在Gly-RLK，家族成员数介于1 ~ 20，单子叶植物中均未发现该家族成员。根据进化分析将其分为8个亚组，亚组Ⅲ、Ⅶ和Ⅷ分布基因数较多。共发现6个MdGly-RLK，其编码的氨基酸序列大小、分子量和等电点分别介于451 ~ 776、50.99 ~ 87.33 kD和5.95 ~ 8.21，主要位于质膜，4个为串联重复。MdGly-RLK在苹果各组织和品种间存在不同的表达模式；接种苹果腐烂病菌（Valsa mali）后，6个MdGly-RLK均差异表达，MdGly-RLK6（MD15G1156900）可上调至对照的16.33倍。综上，Gly-RLK仅在部分双子叶植物中存在，家族成员的扩增速度较快。MdGly-RLK响应苹果生长发育和黑腐皮壳菌信号，MdGly-RLK6可作为苹果抗腐烂病研究的候选基因。     

苹果MdMYB2基因对非生物胁迫的响应

为阐明苹果(Malus×domestica)R2R3-MYB转录因子基因MdMYB2在非生物胁迫条件下的生物学功能,对MdMYB2的启动子序列进行分析,发现其含有非生物胁迫相关顺式作用元件,且MdMYB2的表达量受外源ABA、聚乙二醇(PEG)和4℃低温的诱导。在不同处理对MdMYB2过表达拟南芥植株和MdMYB2过表达苹果愈伤组织的试验中发现,外源ABA处理抑制了MdMYB2转基因拟南芥种子的萌发,且转基因幼苗提高了对ABA的敏感性、耐旱性和抗冷性。同时,过表达MdMYB2的苹果愈伤组织也表现出对ABA敏感、耐旱和抗冷的表型。以上结果说明MdMYB2在植物的逆境胁迫响应中发挥重要作用。     

硫磺对苹果连作土壤环境及平邑甜茶幼苗生长的影响

以盆栽的试验方式，研究了在老龄苹果园土壤中添加不同量（0、0.1、0.3、0.5 g ? kg-1）的硫磺对土壤微生物环境及再植平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）幼苗的影响，为减轻苹果连作障碍提供理论依据。温室和露地盆栽结果显示：硫磺对改善连作土壤环境及促进平邑甜茶幼苗的生长具有良好的效果，但不同添加量促进效果不尽相同，其中以0.3 g ? kg-1的促进效果最为显著。与对照相比，0.3 g ? kg-1的硫磺处理浓度下平邑甜茶幼苗株高、地径、鲜质量、干质量分别增加了60.83%（26.03%，露地数据，下同）、26.78%（19.66%）、73.44%（62.15%）和93.32%（72.93%）；根长、根表面积、根体积、根尖数、根系呼吸速率提高了1.47倍（1.82倍）、2.28倍（2.05倍）、2.05倍（2.74倍）、1.73倍（1.67倍）、2.12倍（1.98倍）。硫磺处理后叶片叶绿素含量、光合参数、土壤酶的活性均有不同程度提高。0.3 g ? kg-1硫磺处理具有最高的细菌与真菌比值、真菌的丰富度和多样性指数及最低的优势度指数。主成分分析发现，随硫磺添加量增加，土壤真菌群落与对照距离越来越远，但当添加量由0.3 g ? kg-1增加至0.5 g ? kg-1对改善连作土壤环境的效果不是特别明显。实时荧光定量结果表明，硫磺的添加可以显著降低串珠镰孢菌基因拷贝数。综上，0.3 g ? kg-1硫磺处理可较好地优化土壤环境，促进平邑甜茶幼苗的生长，可作为一种减轻苹果连作障碍的有效方法。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

苹果属植物种质多样性的SLAF-seq分析

利用简化基因组测序技术—特异性位点扩增片段测序技术（Specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq）对509份苹果属植物种质进行测序，获得586 454个SLAF标签，其中多态性SLAF标签463 612个；经过序列比对，根据完整度 > 0.94、次要等位基因频率（MAF）> 0.05，过滤筛选得到46 460个多态性单核苷酸（SNP）位点；基于这些SNP位点构建苹果属植物不同种的系统发生树并分析主成分。结果表明，通过SLAF-seq技术能够在全基因组范围内快速开发高通量的SNP标记，并直接用于苹果属植物种质资源遗传多样性研究中。34种509份苹果属植物的多样性水平较高（He = 0.318，I = 0.488，Ae = 1.520），在多于1份试材的种群中，变叶海棠的遗传多样性水平最高，中国苹果的遗传多样性水平最低。综合聚类分析和主成分分析结果表明，供试苹果属植物分为5个基本的类群，Ⅰ山荆子类群，Ⅱ苹果属植物野生种类群，Ⅲ苹果栽培品种类群，Ⅳ以中国苹果、八棱海棠、花红、楸子和海棠花为主的类群，Ⅴ新疆野苹果类群。野生种丽江山荆子、山楂海棠、陇东海棠、变叶海棠、花叶海棠、滇池海棠和沧江海棠聚类比较紧密，栽培种之间的亲缘关系相对较近，栽培品种与东方苹果和森林苹果等野生种聚在一起，新疆野苹果与中国原产苹果属栽培种的亲缘与起源演化关系有待于进一步考究。     

溃疡病菌侵染早期柑橘细胞程序性死亡的响应特征及机制

为进一步研究柑橘溃疡病抗性与细胞程序性死亡的关系， 以高感品种晚锦橙（甜橙类，Citrus sinensis Osbeck）和高抗品种金弹（金柑类，Fortunella crassifolia Swingle）为试材，从抗性特征、发病早期的相关信号变化、抗氧化酶活性和基因表达变化等方面探讨柑橘细胞程序性死亡响应溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri）侵染的特征及机制。接种溃疡病菌后，晚锦橙叶片出现明显的海绵状凸起，为典型的溃疡病症状；而金弹则出现超敏化反应细胞坏死症状。接种前，过氧化氢（H2O2）在金弹中的基础水平较晚锦橙高；接种后，两品种的H2O2含量均上升，但金弹上升幅度高于晚锦橙。随着H2O2水平升高，代表膜脂过氧化程度的丙二醛（MDA）含量在两个品种中均增加，但金弹中增加幅度更大。抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）活性在晚锦橙和金弹叶片中均呈下降趋势；过氧化氢酶（CAT）活性在两个品种中均提高且差异不大；过氧化物酶（POD）活性在两个品种中均提高，但晚锦橙的上升更快，且提高程度低于对照。参与细胞程序性死亡正调控的基因CsCEP1-1、CsCEP1-2和CsMCA1在两个品种中均受溃疡病菌诱导上调表达，但金弹中的表达水平显著高于晚锦橙；参与细胞程序性死亡负调控的CsDAD1-1、CsDAD1-2、CsMLO2和CsMLO3的转录水平在晚锦橙中变化不大，而金弹中随着接种时间的延长逐渐降低。结果表明，溃疡病菌胁迫下晚锦橙和金弹在发病早期均启动了超敏化反应，但在金弹中更为强烈，有助于诱导发生细胞程序性死亡，而限制病原菌的生长，这可能是金弹抗病性强的内在原因之一。     

苹果BR信号转录因子基因MdBZR1的克隆及表达分析

从矮化苹果砧木Malling 9（M9）中分离1个BR信号转录因子BRASSINAZOLE-RESISTANT 1（BZR1）基因,命名为MdBZR1,其开放阅读框为888 bp,编码295个氨基酸,有5个保守结构域：核定位信号结构域NLS（MARRKPSWRERENNRRTERRR）、氮（N）端结构域（NLPKHCDNNEVLKALCLQ AGWTVEDDGT）、BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 2（BIN2）磷酸化结构域（STKISPYSSLNPSPIPS YOVSPSSSSYPSPTR）、PEST结构域（PTAATIPECDESDASTVDSGQ）和碳（C）端保守结构域（VKPWIGEK IHEVGLDDLELTLGNGKA）。系统进化树分析显示,MdBZR1与美国National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库中注释的苹果BZR1基因亲缘关系最近。MdBZR1在M9不同组织均有表达,在顶梢中的表达水平最高;外源BR和生长素处理促进苹果幼苗（M9和平邑甜茶）株高增长,MdBZR1表达量增加;GA处理虽也促进株高增长,但对MdBZR1的表达影响不显著。此外,半矮化砧穗组合长富2号/MM106和乔化砧穗组合长富2号/长富2号接穗中MdBZR1的表达量明显高于矮化砧穗组合长富2号/M9。因此,MdBZR1很可能对苹果树株高具有重要调控作用。     

苹果L-LEC-RLK基因家族鉴定及响应病原真菌信号的表达分析

以L型类凝集素(Lectin-LegB;Pfam:PF00139)和激酶(Pkinase;Pfam:PF00069)保守域全蛋白序列为种子序列,鉴定了苹果(Malus×domestica Borkh.)L型类凝集素类受体激酶(L-LectinReceptor-like kinase,L-LEC-RLK)家族成员,并对其理化性状、进化特征、亚细胞定位、染色体位置和表达模式进行分析。通过鉴定,共获得41个成员,其氨基酸序列大小介于423～1 291 aa,分子量介于47.12～143.27 kD,等电点介于5.50～8.91,其中28个成员位于质膜。根据进化分析将拟南芥、水稻、马铃薯、杨树和苹果等5个物种的L-LEC-RLKs分为8个亚组,苹果L-LEC-RLKs分布于亚组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ。染色体位置分析表明苹果L-LEC-RLKs存在多个串联重复。该家族成员在不同组织中存在多样化的表达模式。27个成员在苹果接种腐烂病菌(Valsa mali,Vm)或斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype,AAAP)后存在差异表达。其中,MD15G1226500和MD14G1055200的表达量在两种病害发生后都发生了显著的差异。以上差异基因可作为进一步开展抗病研究和功能分析的候选基因。     

梨CRK家族基因及其腐烂病菌侵染响应成员的鉴定

在植物响应逆境过程中，半胱氨酸富集类受体激酶（Cysteine-rich receptor like kinase，CRK）起重要的调控作用。本研究中以结构域Stress-antifung（Pfam：PF01657）和Pkinase（Pfam：PF00069）的保守序列为种子序列，在全基因组范围鉴定了梨（Pryus spp.）CRK家族成员。此外，对其蛋白理化性质、进化特征、基因在染色体上的位置、顺式作用元件（cis-acting regulatory element，cis-element）和表达模式进行了分析。共获得32个CRK家族成员，其氨基酸数、分子量和等电点分别介于440 ~ 1 217、48.90 ~ 137.02 kD和5.31 ~ 8.59，主要位于质膜。根据进化分析，将来自梨、拟南芥、苹果、番茄和水稻的156个CRK分为6个亚组，梨CRK主要分布于亚组Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ。梨CRK中存在5个串联重复的基因簇，共包含了20个成员。此外，该基因家族所有成员的启动子区域都存在多个响应激素和逆境信号的cis-element。接种腐烂病菌Valsa pyri（Vp）后，杜梨（Pyrus betulifolia，抗病）和‘早酥’梨（Pyrus bretschneideri，感病）中分别发现8个和10个CRK发生了差异表达，6个基因在两种资源中都发生了差异表达。差异基因中，Pbr001477.1和Pbr000205.4在抗、感病资源中都显著上调，而其他基因的表达量在两种资源中呈现不同的变化趋势。