苹果赤霉素信号转导因子MdGAMYB的克隆和表达分析

以‘长富2号’苹果为试验材料,从其短枝顶芽中克隆得到1个赤霉素信号转导因子MdGAMYB,对其进行生物信息学和表达分析。结果表明,MdGAMYB的开放阅读框(ORF)长度为1 656bp,编码551个氨基酸,蛋白质分子量为59.741 kD。生物信息学分析表明MdGAMYB编码的蛋白存在多个糖基化位点和磷酸化位点;序列分析表明,Md GAYMB和其他物种的GAMYB蛋白有很高的相似性,均含有保守的R2R3 DNA结合域和GAMYB家族所特有的Box1,Box2和Box3保守区域;系统进化分析表明,Md GAYMB与梨、梅花、草莓、枣和葡萄等的GAMYB蛋白具有较高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明,Md GAYMB具有组织表达特异性,在叶片、花和芽中的表达量较高。外源GA3处理抑制了花芽孕育和翌年成花,抑制MdGAMYB的表达。在易成花品种‘烟富6号’中的表达量高于难成花品种‘长富2号’。     

苹果‘长富2号’开花调控转录因子基因MdIDD7的克隆及表达分析

以‘长富2号’苹果为试验材料,采用RT-PCR的方法,从其芽中克隆得到INDETERMINATE DOMAIN(IDD)转录因子基因MdIDD7,其开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。序列比对和结构域分析表明,该转录因子含有1个核定位信号和4个高度保守的锌指蛋白结构域。系统进化树分析表明,MdIDD7与白梨(Pyrus×bretschneideri,XP_009364602.1)、桃(Prunus persica,XP_007225628.1)和梅(Prunus mume,XP_008220893.1)聚在一起。实时荧光定量PCR表明,MdIDD7在‘长富2号’不同组织(茎、叶、花、果和芽)中均有表达,其中芽的表达量最高。花后40~60 d,MdIDD7在易成花品种‘烟富6号’芽中表达量显著高于难成花品种‘长富2号’。"小年"树顶芽组织中MdIDD7的表达量显著高于"大年"树。在花芽诱导前期,外源GA处理诱导MdIDD7下调表达,而蔗糖处理诱导其上调表达,说明MdIDD7响应激素和糖信号,促进苹果成花。     

苹果‘长富2号’开花调控转录因子基因MdSPL6的克隆及表达分析

以‘长富2号’苹果短枝顶芽为材料,采用RT-PCR方法克隆得到1个候选开花调控转录因子基因SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL),含有570 bp开放阅读框,编码189个氨基酸。序列比对发现,该基因含有一个保守的SBP结构域和核定位信号,属于SBP转录因子基因家族。系统进化分析表明,MdSPL6蛋白的核苷酸序列与拟南芥AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5具有较高的同源性。实时定量PCR分析结果表明,在不同的组织中MdSPL6的表达量存在差异,在叶片和顶芽中的表达量相对较高。易成花的‘烟富6号’苹果短枝顶芽内MdSPL6的表达高于难成花的‘长富2号’。外源GA处理诱导MdSPL6的表达在花后40和60 d下调;6-BA处理使MdSPL6的表达呈现先上升后下降趋势;蔗糖处理促使MdSPL6表达上调。推测MdSPL6对激素和糖信号介导的成花诱导有重要作用,可作为调控苹果花芽分化的目标基因。     

‘长富2号’苹果短枝幼果摘除对芽叶可溶性糖积累和成花相关基因表达的影响

以‘长富2号’苹果为材料,在盛花期后31d进行短枝摘果处理,研究处理后短枝顶芽生长状态、成花率以及短枝芽叶可溶性糖(蔗糖、果糖、葡萄糖及山梨醇)的动态变化,并利用实时荧光定量PCR检测顶芽糖代谢相关基因(MdSPS6、MdSUSY1、MdHXK1、MdSUT1)、MdTPS基因和成花相关基因(MdFT、MdFD、MdCO、MdSOC1、MdLFY、MdAP1)的表达模式。结果表明:摘果处理后,短枝顶芽长度、宽度及鲜样质量有一定的增加,次年成花率显著高于对照;短枝顶芽中蔗糖、果糖、山梨醇变化较为明显,在生理分化后期都显著高于对照,而葡萄糖含量变化较小;短枝叶片中,4种可溶性糖含量第1个高峰由盛花期后60 d提前至40 d;顶芽糖代谢相关基因及3个MdTPS基因(MdTPS1-1~MdTPS1-3)都响应摘果处理;MdFT、MdFD、MdCO、MdSOC1和MdLFY等的表达在盛花期后40 d均有显著的上调,其中MdLFY的变化最为明显,而MdAP1在整个生理分化期与对照无显著差异。     

苹果全基因组PIN成员鉴定及MdPIN15的克隆和在腋芽萌发中的表达分析

从苹果金冠基因组中鉴定得到18个生长素输出载体蛋白PIN-formed(PIN),对其进行理化特性、基因结构、系统进化和启动子元件分析。结果表明,MdPIN基因家族中,含有1~14个外显子,0~13个内含子;MdPIN蛋白的保守基序数量在3~10。苹果PIN和拟南芥PIN等蛋白高度同源,且根据其进化树分为G1、G2和G3亚组;18个MdPIN在不同基因型苹果的不同器官中表达具有明显差异。以‘长富2号’为材料,从其腋芽中克隆得到一个候选基因MdPIN15,其开放阅读框为1869 bp,编码622个氨基酸。实时定量PCR表明,MdPIN15在梢尖部位表达量最高,其次是腋芽,在花芽中表达量最低;,外源GR24和Lovastatin(LVS)处理降低MdPIN15的表达量;6-BA和去茎尖处理提高了MdPIN15的表达量。MdPIN15在介导细胞分裂素(CK)、生长素(IAA)和独脚金内酯(SL)等激素调控腋芽萌发有重要作用。     

苹果全基因组PAL基因家族成员的鉴定及表达分析

根据金冠苹果参考基因组,利用BLAST在线网站鉴定得到苹果基因组中共8个PAL基因,所有MdPAL蛋白都含有MIO保守结构域(Ala-Gly-Ser)。分组鉴定和进化树分析结果显示,MdPAL蛋白可以被分为3组,分子量在47.713~81.748 ku,等电点在5.44~6.39,进化关系较近的成员拥有相似的基因结构和蛋白保守基序分布。利用GEO数据库和实时荧光定量PCR的方法检测苹果长富2号品种中PAL基因在不同组织器官及5个不同果实发育阶段的表达情况。不同组织器官表达结果表明,MdPAL2、MdPAL3/4/6/7、MdPAL8在叶中表达最高,而MdPAL1和MdPAL5在花中表达最高,表达模式存在多样性。不同果实发育阶段表达结果发现,MdPAL表达规律不同,所有MdPAL在幼果发育期或果实成熟期显著升高(除MdPAL1外),暗示其在果实发育和成熟过程具有重要作用。     

苹果全基因组多聚半乳糖醛酸酶基因家族的鉴定及进化分析

从苹果全基因组中鉴定出85个多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因,通过聚类分析将其分成了7个组(Group A~Group G),其分子量在176~1 125 aa之间,等电点在4.68~9.58之间。鉴定出来的Md PG基因除在14号染色体没有分布外,其余都有分布。系统分析了Md PG蛋白的保守基序和Md PG基因结构,发现苹果PG蛋白除包含有广泛存在于各种PG蛋白的4个保守基序以外,还含有其他相对特异的保守基序,Md PG75具有最多的外显子数,达到18个。对85个苹果PG蛋白之间的功能联系网络进行了系统研究,分析预测了相关基因的功能和多个基因间功能的联系,并作了初步验证。     

紫外线照射对采后苹果抗灰霉病作用的研究

【目的】研究紫外线照射处理对采后苹果抗灰霉病的作用效果,了解紫外线照射处理诱导灰霉病抗性的机理。【方法】以晚熟苹果品种‘粉红女士’(Malus domestica‘Pink Lady’)为材料,对其进行7.0kJ/m2短波紫外线照射(处理组),以未经紫外线照射的果实为对照组,常温下放置2d后接种灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.),观察灰霉病发生情况,并测定相关生理指标。【结果】随着接种后时间的延长,苹果灰霉病发病率迅速增加,病斑直径不断扩大,对照组果实在接种后2d发病率约为60%,而处理组发病率约为40%,低于对照组;在接种后4d,处理组和对照组发病率均达到100%,到12d果实全部腐烂,病斑直径达到最大。在整个贮藏期内,处理组果实的呼吸速率和乙烯释放速率均低于对照组,处理组果实的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶活性均高于对照组。【结论】紫外线照射可以降低贮藏过程中果实的呼吸速率和乙烯释放速率,诱导果实酶活性增强,对采后‘粉红女士’苹果灰霉病有一定的抑制作用。     

苹果BR信号转录因子基因MdBZR1的克隆及表达分析

从矮化苹果砧木Malling 9（M9）中分离1个BR信号转录因子BRASSINAZOLE-RESISTANT 1（BZR1）基因,命名为MdBZR1,其开放阅读框为888 bp,编码295个氨基酸,有5个保守结构域：核定位信号结构域NLS（MARRKPSWRERENNRRTERRR）、氮（N）端结构域（NLPKHCDNNEVLKALCLQ AGWTVEDDGT）、BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 2（BIN2）磷酸化结构域（STKISPYSSLNPSPIPS YOVSPSSSSYPSPTR）、PEST结构域（PTAATIPECDESDASTVDSGQ）和碳（C）端保守结构域（VKPWIGEK IHEVGLDDLELTLGNGKA）。系统进化树分析显示,MdBZR1与美国National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库中注释的苹果BZR1基因亲缘关系最近。MdBZR1在M9不同组织均有表达,在顶梢中的表达水平最高;外源BR和生长素处理促进苹果幼苗（M9和平邑甜茶）株高增长,MdBZR1表达量增加;GA处理虽也促进株高增长,但对MdBZR1的表达影响不显著。此外,半矮化砧穗组合长富2号/MM106和乔化砧穗组合长富2号/长富2号接穗中MdBZR1的表达量明显高于矮化砧穗组合长富2号/M9。因此,MdBZR1很可能对苹果树株高具有重要调控作用。     

苹果赤霉素氧化酶基因GA2ox、GA3ox和GA20ox家族全基因组鉴定及表达分析

通过生物信息学方法对苹果赤霉素氧化酶基因GA2ox、GA3ox和GA20ox的结构、化学性质、染色体分布、进化关系、启动子顺式作用元件和组织特异性表达进行分析,并通过实时荧光定量PCR对苹果花芽诱导过程中的表达水平进行测定。从苹果基因组里鉴定出41个赤霉素氧化酶基因,其中GA2ox类20个,GA3ox类14个,GA20ox类7个,除4号染色体外,其他染色体均有分布;其蛋白质分子量在13.15 ~ 60.17 kD之间,等电点预测值在5.50 ~ 9.81之间;通过聚类分析将这41个赤霉素氧化酶基因分为5个亚家族;基因结构和保守结构域分析发现这41个赤霉素氧化酶基因的外显子数1 ~ 5不等,且保守基序Motif 1、5、6、7、10为大部分基因所共有;根据苹果表达量数据库组织特异性分析发现这3类基因在不同品种、不同组织部位的表达量不同,其中在花和果实中表达量相对较高。通过‘长富2号’花芽诱导过程的转录组数据,挑选出8个基因（MdGA2ox4、MdGA2ox6、MdGA2ox9、MdGA2ox12、MdGA3ox5、MdGA3ox12、MdGA20ox1和MdGA20ox5）进行实时荧光定量PCR分析,结果发现,GA₃处理后,花后不同时期GA20ox类氧化酶基因表达量均下调,GA2ox类氧化酶基因表达量均上调,GA3ox类氧化酶基因表达量则出现相对波动的现象。