苹果Trihelix转录因子家族生物信息学鉴定与基因表达分析

利用生物信息学方法在苹果全基因组中鉴定了Trihelix转录因子基因,对基因结构、染色体的定位,以及其对应蛋白的理化性质、保守基序和进化关系等进行了分析;同时基于基因芯片表达数据和q RT-PCR分析,明确了苹果Trihelix在不同组织和逆境胁迫下的差异表达情况。通过分析,共鉴定得到了39个苹果Trihelix转录因子,其蛋白质的大小介于227～917 aa,分子量介于25.751～101.294 k D,等电点介于4.78～9.80。根据进化关系将其分为5个亚族,分别为GT-1、GT-2、GTγ、SIP1和SH4,亚族内部分成员的基因结构相似。基于MEME程序分析苹果Trihelix转录因子家族的保守基序与聚类分析结果具有较高的一致性。启动子上游1kb区域顺式作用元件分析表明Md Trihelix1、Md Trihelix19在CGTCA-motif上,Md Trihelix6、Md Trihelix13在ABRE上,Md Trihelix2、Md Trihelix7、Md Trihelix14和Md Trihelix16在GT1-motif上的响应均较高。基因芯片表达发现,Trihelix38、Trihelix14、Trihelix9和Trihelix11在花、果实、叶、茎、根、种子和幼苗中几乎不表达,其余35个基因在多种组织中均存在一定水平的表达,对花和果实表达上调的基因中除Trihelix36属于GT-1亚家族外,其余都属于GT-2亚家族和SIP1亚家族成员。通过q RT-PCR分析,检测到33个Md Trihelix在响应逆境胁迫应答方面表现出多样性。     

苹果6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1的克隆和功能分析

以‘嘎拉’苹果为材料,克隆了6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1(序列号:MDP0000279299)全长。序列分析显示,该基因包含一个长为1 047 bp完整的开放阅读框,编码347个氨基酸,分子量为36.430 k D,预测等电点为9.24。同源性分析表明Md6PGDH1还有另外3个同源基因;功能域分析表明Md6PGDH蛋白含有两个保守的绑定域;亚细胞预测表明Md6PGDH定位存在差异。分析Md6PGDH1启动子发现存在多个响应非生物胁迫的顺式作用元件。定量分析显示,Md6PGDH1在苹果的不同组织中都有表达,且受非生物胁迫诱导。原核诱导Md6PGDH1蛋白并进行蛋白酶活的测定,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。Md6PGDH1在苹果愈伤组织中过量表达,提高其抗盐胁迫的能力。     

苹果TIFY家族基因鉴定及其在虫害胁迫下的表达分析

利用生物信息学方法在苹果全基因组中鉴定了TIFY转录因子家族基因,对基因结构、蛋白保守基序和进化关系进行了分析,同时基于新疆野苹果(Malus sieversii)转录组数据分析,明确了苹果TIFY家族基因在虫害胁迫条件下的差异表达情况。共鉴定到了16个苹果TIFY基因,其蛋白质大小介于209~449 aa之间。16个TIFY基因分布于苹果8条染色体中,所有的MdTIFY蛋白都具有保守的TIFY结构域。其中8个苹果MdTIFY与新疆野苹果转录组测序拼接转录本对应,这些基因均含有保守的TIFY功能域,多物种进化分析表明该类蛋白可聚类成7个组。7个TIFY基因的表达量在不同处理间表现出显著差异,虫害侵染后,抗虫株系中MsTIFY10B-a表达量升高34倍,MsTIFY9-c上升5.2倍。同时抗虫株系在自然条件下茉莉酸—异亮氨酸含量显著高于敏感株系。新疆野苹果中重要抗虫响应基因MsTIFY10B-a和MsTIFY9-c位于预测关联网络节点中心位置,使它们在调节植物对生物胁迫的响应中发挥重要作用。     

新疆野苹果NAC基因分析及抗腐烂病基因筛选

【目的】探明新疆野苹果(Malus sieversii)中NAC基因资源,筛选潜在的抗腐烂病NAC基因。【方法】以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NAC蛋白为种子构建隐马可夫模型,从新疆野苹果转录组数据库中鉴定NAC转录因子,利用Protparam及qRT-PCR等手段对其理化性质、亚细胞定位、保守基序、系统进化及腐烂病菌侵染后的表达谱进行分析。【结果】从新疆野苹果中鉴定到165个NAC基因,根据蛋白系统进化关系分为12个亚组,且MsNACs在各亚组间分布不均。蛋白理化性质分析结果表明,MsNACs大多属酸性,且多为亲水性蛋白。保守基序分析结果表明,大多数MsNAC转录因子拥有由7个保守基序组成的完整NAC结构域,少数存在亚结构域的缺失。膜结合域分析结果表明,有18个MsNACs蛋白具有膜结合域,且大多定位于细胞核,少数定位于内质网、线粒体等其他细胞器。表达分析结果表明,34个MsNACs在腐烂病菌侵染后差异表达,可根据表达模式分为A、B、C三个亚簇,其中MsNAC073和MsNAC102表达变化剧烈,分别在5 dpi下调近6倍和上调近140倍。【结论】基于新疆野苹果转录组数据,首次对MsNAC家族基因进行鉴定、分类和表达量分析,为新疆野苹果抗病响应关键NAC基因的功能研究奠定了基础,也为其他物种中抗病基因的筛选提供了参考。     

苹果MLP家族基因鉴定及非生物胁迫响应分析

在苹果中鉴定了13个Major Latex Protein(MLP)家族基因Md MLP。序列比对及构建蛋白同源模型发现,Md MLP蛋白含有Bet_v1典型的Gly-rich loop区域结构,且为MLP家族特有的Gxxxxx G结构。经多物种MLP系统发育及共线性比较分析,Md MLP与其他蔷薇科物种MLP具有相似基因结构和蛋白质保守结构域。q RT-PCR分析表明,Md MLP在‘新疆1号’苹果14个器官组织中均有不同程度的表达,对ABA、Na Cl、PEG、低温(4℃)和高温(40℃)有一定响应,且同一亚族基因表达情况呈现相似趋势。String构建蛋白互作网络发现,Md MLP可能通过与PRSP、SNRK1/2、b HLH等应激、ABA相关转录蛋白互作,参与苹果对非生物胁迫的防御。     

苹果MLP家族基因鉴定及非生物胁迫响应分析

在苹果中鉴定了13个Major Latex Protein(MLP)家族基因Md MLP。序列比对及构建蛋白同源模型发现,Md MLP蛋白含有Bet_v_1典型的Gly-rich loop区域结构,且为MLP家族特有的Gxxxxx G结构。经多物种MLP系统发育及共线性比较分析,Md MLP与其他蔷薇科物种MLP具有相似基因结构和蛋白质保守结构域。q RT-PCR分析表明,Md MLP在‘新疆1号’苹果14个器官组织中均有不同程度的表达,对ABA、Na Cl、PEG、低温(4℃)和高温(40℃)有一定响应,且同一亚族基因表达情况呈现相似趋势。String构建蛋白互作网络发现,Md MLP可能通过与PRSP、SNRK1/2、b HLH等应激、ABA相关转录蛋白互作,参与苹果对非生物胁迫的防御。     

苹果MdDRB1的表达与功能分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为试材,扩增Md DRB1基因,分析其序列结构,同时原核诱导Md DRB1蛋白并观察其亚细胞定位。利用q RT-PCR检测Md DRB1在非生物胁迫下的表达量,通过遗传转化苹果苗鉴定Md DRB1在非生物胁迫中的功能。基因结构分析显示,Md DRB1具有2个内含子和3个外显子。亚细胞定位显示,Md DRB1主要定位于细胞核,少数定位在细胞质。原核诱导结果显示,Md DRB1融合蛋白以包涵体的形式存在。同时发现Md DRB1反义转基因愈伤中与抗性相关的mi RNA的表达水平上调。在PEG、ABA、盐和低温处理的材料中Md DRB1的表达水平明显上调。另外,Md DRB1过量表达明显提高了转基因苹果组培苗的抗性。推测Md DRB1在抗逆胁迫响应中有重要作用。     

苹果黄酮醇合成酶基因MdFLS1的克隆、生物信息学分析及催化活性鉴定

【目的】在‘嘎拉’苹果中克隆黄酮醇合成酶基因Md FLS1全长,对其进行生物信息学分析,研究其表达特点和催化活性。【方法】利用RT-PCR和PCR克隆Md FLS1的全长,测序后运用多种生物信息学手段对其序列进行分析,运用q RT-PCR的方法研究其表达模式,原核诱导获得Md FLS1蛋白,并利用高效液相色谱鉴定其催化活性。【结果】苹果Md FLS1基因包含1 014 bp完整的开放阅读框,编码337个氨基酸,理论等电点为5.48,预测分子质量为38.12 ku。苹果Md FLS1基因定位于基因组8号染色体上,属于α-酮戊二酸依赖性双加酶家族。系统进化树分析表明,FLS在不同物种间具有高度的氨基酸序列保守性;其中,苹果Md FLS1与甜樱桃Pa FLS亲缘关系最近。苹果Md FLS1蛋白整体表现为亲水性,α-螺旋和不规则卷曲是其最大的结构元件。分析苹果Md FLS1氨基酸序列发现其不含信号肽和转运肽,没有跨膜结构域,预测其定位于细胞质中。分析Md FLS1的启动子区域发现含有激素信号、生物和非生物胁迫响应顺式作用元件。Md FLS1在苹果不同组织中都有表达,在叶中表达量最高,在茎中表达量较低。原核诱导并纯化了MdFLS1蛋白,鉴定了Md FLS1的催化活性。【结论】Md FLS1的表达明显受高盐胁迫、低温、干旱和ABA的诱导,并且具有催化活性。     

辣椒β–酮脂酰辅酶A合酶基因家族的鉴定与表达分析

为深入了解β–酮脂酰辅酶A合酶(β-ketoacyl-CoAsynthase,KCS)基因家族在辣椒基因组中的特征,利用生物信息学方法鉴定所有KCS基因家族成员,对基因染色体定位、系统发育关系、基因结构、蛋白保守基序和组织表达模式等进行分析,并通过qRT-PCR方法检测基因在高温、低温和NaCl胁迫下的响应。从辣椒基因组中共鉴定出22个KCS家族基因,其不均匀地分布在辣椒的9条染色体上;系统发育分析表明辣椒KCS基因家族可分为4组,每组含有不同数量的基因;该家族成员含有0~3个内含子,保守基序有6~14个;KCS家族基因具有不同的表达模式;高温、低温和NaCl处理可以抑制或激活该家族成员的表达。     

苹果全基因组CRF家族成员鉴定及在不定根发育过程中的表达分析

通过生物信息学分析,从‘金冠’苹果基因组鉴定得到了11个细胞分裂素响应因子（CRF）基因。根据基因在染色体上的位置,将其依次命名为MdCRF1 ~ MdCRF11,并对其进行理化特性、基因结构、系统进化和启动子元件分析。MdCRF编码的蛋白在137 ~ 435 aa之间,等电点在4.26 ~ 9.68之间。基因结构分析发现,MdCRF1有2个外显子1个内含子,MdCRF11有3个外显子2个内含子,其余基因都只含有外显子,没有内含子;保守基序列分析发现,MdCRF蛋白的保守基序数量在5 ~ 9。通过系统进化分析将家族成员分为G1、G2和G3共3个亚组,每个亚组内成员数量相对均匀。组织特异性表达分析发现11个基因在不同杂交种苹果和不同器官中的表达量存在明显差异。以苹果砧木‘T337’为材料,qPCR验证了MdCRF家族基因大部分在根、茎、愈伤组织中高表达,同时也响应生根处理表达量发生显著下调。对11个MdCRF蛋白之间的网络调控关系进行了研究,分析预测了相关基因间的潜在联系。结合分析可知,其中MdCRF8、MdCRF10和MdCRF11可能参与调控苹果砧木不定根发育。     

苹果全基因组PIN成员鉴定及MdPIN15的克隆和在腋芽萌发中的表达分析

从苹果金冠基因组中鉴定得到18个生长素输出载体蛋白PIN-formed(PIN),对其进行理化特性、基因结构、系统进化和启动子元件分析。结果表明,MdPIN基因家族中,含有1~14个外显子,0~13个内含子;MdPIN蛋白的保守基序数量在3~10。苹果PIN和拟南芥PIN等蛋白高度同源,且根据其进化树分为G1、G2和G3亚组;18个MdPIN在不同基因型苹果的不同器官中表达具有明显差异。以‘长富2号’为材料,从其腋芽中克隆得到一个候选基因MdPIN15,其开放阅读框为1869 bp,编码622个氨基酸。实时定量PCR表明,MdPIN15在梢尖部位表达量最高,其次是腋芽,在花芽中表达量最低;,外源GR24和Lovastatin(LVS)处理降低MdPIN15的表达量;6-BA和去茎尖处理提高了MdPIN15的表达量。MdPIN15在介导细胞分裂素(CK)、生长素(IAA)和独脚金内酯(SL)等激素调控腋芽萌发有重要作用。     

苹果锚蛋白基因ANK家族生物信息学鉴定分析

 利用生物信息学方法对苹果ANK基因家族成员及分类鉴定,同时对其染色体定位、系统进化关系及芯片表达特性进行了分析。苹果MdANK家族包含351个基因,根据蛋白结构域差异分为16个类别,ANK-M类型最为庞大,有143个ANK蛋白;苹果的17条染色体均有ANK家族基因分布,其中第2条染色体上分布最多,有36个ANK基因。MdANK编码的蛋白在72 ~ 2 429个氨基酸范围内,等电点在4.30 ~ 11.13之间。芯片分析发现,在苹果果实成熟时期及砧木接穗互作过程中,多数MdANK基因的表达都有不同程度变化。     

Genome-wide analysis of antioxidant enzyme gene families involved in drought and low-temperature responses in Apple (Malus domestica)

Antioxidant enzymes were well-known for reactive oxygen scavenging and protecting cells from oxidative damage in multiple biotic and abiotic stresses. Aimed to overview of antioxidant enzyme gene families and screen for drought and low-temperature response members, the whole apple antioxidant enzyme genes in apple genome were studied. Out of 73candidates in seven antioxidant enzyme gene families among the entire apple genome, a total of 49 genes were identified, showed more antioxidant enzyme gene members than those in other plant species. A phylogenetic tree based on predicted functional domains and motifs of apple and Arabidopsis antioxidant enzymes revealed 19 putative drought or low-temperature response genes, and 9 out 19 genes belong to five families responded to both drought and low-temperature stresses. Subsequently, cis-elements in those nine antioxidant enzyme gene promoters were examined and abundant elements involved in multiple hormone regulation and abiotic stresses response, including drought and low-temperature were found. The tissue expression specificity for those nine members in eight kinds of tissues was also examined. Screening and identifying both drought and low-temperature response genes provide useful information to understand gene functions and promote application of antioxidant enzyme genes in apple abiotic resistance breeding.     

苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定

利用生物信息学的方法,对10个苹果MdCBLs家族蛋白的功能域进行预测,并与拟南芥AtCBLs家族的10个蛋白进行了系统进化分析,同时对苹果MdCBLs基因进行了系统的命名。利用qRT-PCR,检测了苹果MdCBLs基因在不同组织的表达及对非生物胁迫(包括盐、低温、ABA、干旱)的响应,结果表明,MdCBLs在苹果不同组织及非生物胁迫中起重要作用。另外,通过遗传转化苹果愈伤组织鉴定了MdCBL1在盐胁迫中的功能,MdCBL1过量表达明显提高了转基因愈伤组织的盐胁迫抗性。     

辣椒全基因组WRKY转录因子的分析

基于已公布的辣椒全基因组数据,利用生物信息学方法对辣椒WRKY转录因子家族进行全面鉴定和系统命名,并在此基础上对基因分类、染色体定位、系统进化关系和结构域序列保守性进行了研究。结果表明:辣椒CaWRKY家族包含71个基因,根据WRKY结构域的数量及锌指结构的特征可将其分为GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ等3大类,GroupⅡ又可分为Ⅱ(a)、Ⅱ(b)、Ⅱ(c)、Ⅱ(d)和Ⅱ(e)等5个亚类。辣椒12条染色体上均有WRKY转录因子分布,其中第1号染色体上分布最多,共有10个,第4号染色体上分布最少,仅有2个。辣椒每类/亚类WRKY几乎含有相同的保守基序。辣椒WRKY编码的蛋白在132~869个氨基酸范围内,平均氨基酸数量为373个。     

丹参细胞分裂素调控因子序列特征分析

细胞分裂素通过双元信号系统感知外界环境刺激并作出应答。其中细胞分裂素响应调控因子（response regulator,RR）是该双元信号系统中的重要构成。采用生物信息学的方法,对丹参（Salvia miltiorrhiza）细胞分裂素调控因子进行序列特征和组织表达特性分析。结果发现,丹参基因组中共有15个丹参细胞分裂素调控因子SmRR,序列比对与系统发生分析表明,SmRR1 ~ SmRR7与拟南芥A类RR亲缘关系比较接近,划分为A类RR,SmRR8 ~ SmRR15与拟南芥B类RR亲缘关系近,归为B类;在A类SmRR中,REC接受域含有保守的DDK残基,因此这些基因被推测有完整的功能,B类SmRR具有高度保守Myb_SHAQKYF结构域。两类SmRR的内含子、外显子组成也具有相对的保守性,顺式调控元件的分析发现,SmRR存在很多胁迫和生长调节物质的响应元件。表达量热图显示A类和B类SmRR基因分别在叶和根中表达量较高。     

香蕉果实果胶裂解酶基因cDNA克隆及序列分析

利用已报道果胶裂解酶基因的保守序列设计简并引物,进行RT-PCR,得到1个大约1300bp的香蕉果胶裂解酶基因cDNA片段,命名为MA-pl。DNA序列分析表明:MA-pl片段全长1277bp,包含1个882bp的开放读码框(ORF),编码294个氨基酸;其具有所有果胶裂解酶共有的保守区域:钙协调部位(Asp72,Asp74,Asp96,andAsp100)、酶活性位点(Arg152,Pro154,Arg157)及3个重要的结构域(motifI:WVDH,motifII:DGLVDAVMGSTAITVSNNYF,motifIII:LYQRMPRCRHGYFHVVWNDY);MA-pl氨基酸序列与草莓-1、葡萄、草莓-2、拟南芥、苹果、香蕉(banana-1)的相似性分别为85.8%、74.2%、79.7%、78.6%、72.4%和71.4%。