玉米GY220×1145组合粗缩病抗性的QTL定位分析

玉米粗缩病是近年严重影响中国玉米生产的病害,研究其QTL定位有助于利用分子标记辅助选择提高玉米粗缩病抗性育种效率。该研究调查了GY220×1145杂交衍生的重组自交系(RIL)群体109个家系(F10∶11)在2个环境下粗缩病的抗感表型值,结合该组合由272个DNA分子标记构建的遗传连锁图谱,分别采用基于多元回归模型的Win QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法(CIM)和基于混合线性模型的QTL Network 2.0软件中CIM方法,检测了玉米粗缩病的抗性位点。结果表明:(1)运用Win QTL Cartographer 2.5软件中CIM法,检测到5个抗玉米粗缩病的QTL,解释表型变异的6.9%～17.6%,其中有3个QTL在2个环境下都检测到。5个QTL的加性效应变异幅度为-8.57～11.94。(2)用QTL Network 2.0软件中CIM法,检测到1个控制玉米粗缩病的位点MRDD2-22,解释表型变异的9.0%,加性效应为6.93。在第5连锁群与13连锁群之间存在1对非主效QTL间的互作,解释表型变异的7.4%,互作效应为-7.70。运用多元回归模型和混合线性模型都检测到的位点是MRDD2-22,位于第4染色体长臂g7M7806～n142标记区间,抗性等位基因来自自交系1145,平均加性效应为9.3。MRDD2-22位点可用于分子标记辅助选择进行玉米自交系粗缩病抗性的改良。     

水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立一种快速、灵敏的逆转录环介导等温扩增方法（RT-LAMP）检测寄主植物和传毒介体体内的水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）。【方法】合成4条针对RBSDV S10核苷酸序列6个位点的特异性引物。分别对引物浓度、MgSO4浓度、反应温度和时间进行优化。将感病水稻总RNA梯度稀释后进行灵敏性检验并与RT-PCR比较分析。选择RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）验证该方法的特异性。用本RT-LAMP方法检测田间病株。【结果】RT-LAMP检测方法可排除SRBSDV的干扰而特异地检测植物和飞虱体内的RBSDV,与RT-PCR灵敏性基本一致。检测结果易于判定。【结论】RT-LAMP检测方法适合寄主植物和介体体内RBSDV的快速检测。     

玉米粗缩病研究进展

玉米粗缩病是一种由带毒灰飞虱传播的病毒性病害,可对玉米生产造成严重影响。本文综述了玉米粗缩病的病原、病害症状、发病规律与防治手段,并对玉米粗缩病抗性育种研究进行了概述,着重介绍了玉米粗缩病抗性育种在常规育种、分子标记辅助育种及转基因育种中取得的进展。     

抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。     

安徽省水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的 分子检测和序列分析

近年来,水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)在安徽各稻区危害日益严重,生产上仅凭症状难以区分2种病毒。本研究建立的RT-PCR方法可以实现一次性检测和鉴定RBSDV和SRBSDV 2种病毒,根据RBSDV和SRBSDV S9保守序列设计3个引物,不仅可以从单独感染RBSDV或SRBSDV的水稻样本中分别扩增出1条大小不同的特异性条带,而且还可以从感染RBSDV和SRBSDV的混合水稻样本中一次性扩增出2条大小不同的特异性条带。从安徽省庐江县、郎溪县、怀宁县和宣州市4个地区水稻田采集表现明显矮缩病症状的水稻样本,RT-PCR检测结果表明,庐江和郎溪水稻样本受到RBSDV侵染,怀宁和宣州水稻样本受到SRBSDV侵染。选取庐江县、郎溪县、怀宁县和宣州市各1个水稻样本,利用RT-PCR扩增出特异性条带,再分别克隆和测序。序列分析表明,庐江、郎溪2个样本的核苷酸序列与RBSDV-Shandong和RBSDV-Zhjr S9部分片段序列相似性高达99.3%～99.8%,且与RBSDV的亲缘关系最近,说明庐江和郎溪样本感染的病毒是RBSDV的2个分离物;怀宁、宣州2个样本的核苷酸序列与SRBSDV-Shangdong和RBSDV-2 S9部分片段序列相似性高达99.5%,且与SRBSDV亲缘关系最近,说明怀宁和宣州样本感染的病毒是SRBSDV的2个分离物。     

感染水稻黑条矮缩病毒的玉米组织细胞的变化

在防虫网室内,人工接种水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarffijivirus,RBSDV)于3叶1心期至5叶1心郑单958玉米苗上。接种10 d后,每天调查症状,抽雄期测量植株上部幼嫩茎节长度;对接种病株和未接种健株的叶片进行横切;对茎节组织进行横切和纵切,荧光染色后,显微镜下观察横切片的细胞数量、形态变化,测量茎节纵切片的细胞长度。结果显示:与未接种的健康对照相比,受侵染的玉米叶片和茎节组织的韧皮部细胞畸形、数量剧增,且排列紊乱。感病植株的节间长度缩短,细胞伸长受阻。本研究通过组织细胞形态观察,明确了RBSDV侵染玉米后,所致内部组织细胞形态的变化和外部植株矮化、叶背蜡泪状突起等典型症状的相关性。     

四种水稻蛋白与水稻黑条矮缩病毒编码非结构蛋白P7-2的互作分析

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是斐济病毒属的成员之一,可侵染玉米和水稻等作物,给亚洲地区的田间生产带来严重的损失。RBSDV有10条双链RNA(double strand RNA, dsRNA)基因组,编码12个蛋白。其中6个蛋白是病毒粒子的结构成分(P1,P2,P3,P4,P8,P10),6个非结构蛋白分别为P5,P6,P7\|1,P7\|2,P9\|1,P9\|2。在非结构蛋白中,P5,P6和P9\|1已被证实参与形成毒质结构,P7\|1被认为可在细胞质中形成类似管状的结构作为病毒胞间扩散的通道,P7\|2和P9\|2的功能目前尚不明确。文章采用Pull\|Down和液相色谱—质谱联用(LC\|MS/MS)等技术来鉴定水稻蛋白(日本晴)与P7\|2蛋白间可能存在的互作关系。通过Pull\|Down实验分析,发现有4种水稻蛋白可与P7\|2相结合,其中2个蛋白为转录相关蛋白,1个为氨基转移酶,还有1个为假定的分子伴侣60前体。实时荧光定量PCR分析显示,感病寄主中的转录相关蛋白和假定的分子伴侣60前体的表达量上调,而氨基转移酶的表达量降低。     

丝黑穗病菌侵染对转Bt基因玉米抗病性相关指标的影响

为明确外源Bt基因的导入对玉米抗病性的影响,本研究以转Bt基因玉米株系和其受体亲本郑58为材料,比较了接种丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana(Kühn)Clint.)后转Bt基因玉米防御酶系统、激素水平及次生代谢的变化情况,探讨了转Bt基因玉米对病害抗性的相关生理机制。研究结果表明:接种丝黑穗病菌后,转Bt基因玉米在吐丝期的发病率达到24%,单穗总粒重较对照下降18%,百粒重下降12%,而郑58发病率为15%,产量与对照无显著差异。转Bt基因玉米的超氧化物歧化酶(SOD),过氧化物酶(POD),过氧化氢酶(CAT)等防御酶活性比郑58玉米在抵御病害侵染时表现的较弱,丙二醛(MDA)含量显著增加,膜脂过氧化程度较为严重,这可能是造成转Bt基因玉米产量下降明显的原因之一。生育前期生长素(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)含量明显下降,而脱落酸(ABA)含量明显升高使得转Bt基因玉米生长受限,同样造成产量的显著下降。此外,在各个生育时期体内的单宁和总酚的含量都低于其受体郑58玉米,生化防御机制受限也可能造成抗病性的降低,进而产量下降。     

通过调整玉米播期控制粗缩病的发生

玉米粗缩病的发生与病毒侵染时玉米植株的生育期关系密切。研究表明 ,普通玉米品种 6叶龄以下为敏感生育期 ,6叶龄以上为非敏感生育期。目前生产上种植的杂交玉米适播期较长 ,如能根据传毒昆媒灰飞虱的消长、传毒规律 ,合理确定玉米播种期 ,使玉米敏感生育期最大限度地避开灰飞虱传毒盛期 ,即可避免或大幅度减轻玉米粗缩病的危害。江苏盐城地区春玉米在 4月上中旬、夏玉米在 6月中旬播种 ,玉米粗缩病发生程度轻。因此 ,上述时间是防治玉米粗缩病的安全播种期     

甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】甘薯病毒病（sweet potato virus disease, SPVD）是甘薯上的毁灭性病害之一,严重时可造成90%以上的产量损失。论文旨在对甘薯SPVD染病植株中甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV）2种病毒的复合侵染情况进行研究,建立SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD的早期预警和流行学研究提供技术手段。【方法】选取重庆地区具有不同SPVD典型症状的甘薯品种（系）叶片作为试验材料,对其进行症状和SPFMV、SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附（NCM-ELISA）检测;对供试材料叶片中的SPFMV外壳蛋白CP和SPCSV热激蛋白HSP70核苷酸序列进行克隆和序列分析,根据保守核苷酸序列设计荧光定量RT-PCR检测引物。以甘薯泛素（ubiquitin,UBI）和组蛋白（histone,H2B）编码基因为内参对供试样品进行荧光定量RT-PCR检测,与感染SPVD典型症状和NCM-ELISA检测结果进行比较,并对取自不同甘薯品种(系)、相同品种(系)不同单株以及相同植株不同部位叶片检测结果进行比较,筛选可快速、精确、定量检测SPVD的荧光定量RT-PCR检测方法。【结果】症状学诊断表明不同甘薯品种（系）的感病叶片可能表现出不同的典型症状特点,同一品种（系）的不同感病植株感病症状相似但也存在差异。序列分析结果表明供试材料中SPFMV至少存在2个株系类型(RC和EA),SPCSV至少存在1个株系类型（WA）。在15份供试材料中,10份材料由NCM-ELISA和荧光定量RT-PCR均检测到SPFMV和SPCSV的共同感染,且荧光定量RT-PCR检测结果与发病症状和NCM-ELISA检测结果相吻合,其检测结果可准确反映甘薯SPVD染病植株中2种病毒复合侵染情况。荧光定量RT-PCR检测结果还表明,不同品种(系)或相同品种(系)不同单株病叶中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平存在差异;相同植株顶端幼嫩叶片和中部成熟叶片中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平也存在差异。染病材料中SPFMV中CP转录水平均相对较高,是SPCSV的HSP70转录水平的3-556倍。4份材料经NCM-ELISA检测只有SPFMV而没有SPCSV感染,而荧光定量RT-PCR还可检测到其中2份材料中SPCSV HSP70转录水平,说明这2份材料中也存在SPFMV和SPCSV的共同感染,表明荧光定量RT-PCR比NCM-ELISA检测结果更灵敏、准确。【结论】 筛选出可利用SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平进行检测的荧光定量RT-PCR检测引物,建立了SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD针对性地监测预警提供了极为有效的方法。在建立甘薯SPVD防御体系时,需综合考虑2种甘薯病毒的共侵染特性和甘薯品种差异,采取针对性的监测和预警机制。     

氮素对灌浆期夏玉米叶片蛋白质表达的调控

【目的】在大田生产条件下研究氮素对灌浆期玉米叶片蛋白质表达的调控。【方法】在大田生产条件下,以紧凑耐密型玉米杂交种登海618为试验材料,研究施氮对玉米穗位叶花后净光合速率、硝酸还原酶（NR）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量和可溶性蛋白含量的影响。采用TCA-丙酮沉淀法提取灌浆期（花后20 d）两个施氮处理下玉米穗位叶总蛋白质,并用双向凝胶电泳技术（2-DE）分离获得蛋白质图谱。采用ImageMaster-2D Elite 7.0图像分析软件对蛋白质图谱进行比较,确定玉米叶片应答灌浆期施氮处理的差异蛋白点。通过MALDI-TOF/TOF MS质谱分析及NCBInr数据库搜索,对差异表达蛋白质进行鉴定并分析其涉及的生物学功能。【结果】开花后,随生育进程的推进,玉米穗位叶净光合速率、叶绿素含量、NR、SOD和POD活性及可溶性蛋白含量均呈下降趋势,而MDA含量则呈上升趋势。相对于不施氮处理,施氮处理下叶片叶绿素含量、NR、SOD和POD活性及可溶性蛋白含量均显著提高,而MDA含量则显著下降。对灌浆期玉米叶片进行双向电泳及图谱分析,分别在施氮和不施氮条件下检测出1 086和1 170个蛋白点。通过图像分析软件进行成对匹配分析,共得到29个显著差异蛋白点。经质谱鉴定分析,29个显著差异蛋白点中有25个被成功鉴定,鉴定成功的蛋白中除未知蛋白（蛋白点55）和30s核糖体蛋白（蛋白点1089）外,其余蛋白表达量均在施氮条件下上调。通过搜索NCBInr数据库,差异表达的蛋白主要分为8类,包括13个能量相关蛋白,2个防御相关蛋白,2个蛋白合成相关蛋白,2个蛋白目的和储存相关蛋白,1个细胞生长相关蛋白,1个次级代谢相关蛋白,1个转运相关蛋白和3个未知蛋白。【结论】施氮对灌浆期玉米叶片光合能力、碳代谢能力、防御能力、蛋白合成能力、蛋白目的和储存能力、以及次级代谢能力等均有显著提升作用。     

玉米叶片蛋白对AM菌根接种和（或）砷胁迫的应答

【目的】研究接种菌根与砷胁迫条件下玉米叶片组织相关蛋白质的变化。【方法】以玉米植株叶片为材料,采用双向凝胶电泳技术（2-DE）研究玉米叶片蛋白表达谱对丛枝菌根（AM菌根）接种和（或）砷胁迫的应答。【结果】经软件分析并搜索NCBInr数据库,结果显示,砷胁迫植株叶片中有7个蛋白点被成功鉴定,其中有3个未知蛋白,其余4个分别为2-phosphoglycerate kinase、oxidoreductase、MAP3K delta-1 protein kinase和Os06g0262800。接种且加砷处理植株叶片中有11个蛋白点被成功鉴定,有4个未知蛋白,其余蛋白分别为oxygen-evolving enhancer protein 3-1、putative M protein、SNF1-related protein kinase 2.2、ATP synthase CF1 beta subunit、ATP synthase CF1 alpha subunit、pathogenesis-related protein 10、 MAP kinase kinase和MEI1 protein。【结论】菌根接种促进加砷处理玉米植株生长,并显著降低玉米植株地下部砷浓度。玉米植株叶片蛋白表达量及种类的变化,表明砷胁迫条件下菌根接种有可能激发与植物生长、养分吸收以及抗性有关的蛋白产生应答,有助于提高玉米对砷毒的抗性。     

玉米粗缩病发生特点与综合防治措施

介绍了玉米粗缩病,通过对南通地区玉米粗缩病的发病规律及田间灰飞虱的调查,总结了病害的发生特点。提出了加强田间管理,合理安排作物茬口,配合选用抗、耐病品种,选择避病的安全播种期,化学防治控制传毒昆虫的病害综合防治技术。     

感染玉米粗缩病毒后玉米植株的超微结构病变研究

 对接种后感染玉米粗缩病毒 (MRDV)的玉米植株的叶片及侧根超微结构进行了电镜观察。研究结果表明 ,受侵染的玉米叶肉细胞中叶绿体的数量有所减少 ,细胞质丰富 ,细胞器发生了不同程度的病变。液泡膜发生明显内陷 ,随着病情的严重液泡膜内陷加剧 ,呈极度松弛状态 ,局部破裂 ;叶绿体被膜破裂 ,轻者成为一松弛的单膜结构 ,严重者被膜完全消失 ,叶绿体中的片层膜系统消失 ,取而代之的是大量淀粉粒。线粒体及细胞核形态异常 ,随着病害的加重 ,线粒体逐渐肿大 ,基粒缩小 ,膜破裂 ,类囊物流入细胞中 ,细胞膜破裂。在玉米植株的根部细胞中观察到了大量的病毒粒体 ,这些粒体大多集中在细胞壁处形成病毒质体。感病细胞的叶绿体、线粒体、核、质膜及胞间联丝中均未见病毒状颗粒     

玉米矮杆突变体的筛选与候选基因鉴定

挖掘矮杆基因对玉米耐密植品种选育具有重要意义。利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变郑58自交系获得一系列矮杆突变体,株高降低范围为10%～45%,穗位高降低范围为10%～65%,部分突变体的节间数目也发生了变化。对矮杆突变体细胞大小进行观察发现,突变体的细胞长度均缩短,缩短的范围为25%～75%,突变体株高的降低除了与细胞缩短有关外,还与细胞数目增加有关,为了进一步确定候选基因,对其中的5个突变体构建了F2分离群体,采取BSR高通量测序结合生物信息学分析,获得了多个玉米矮杆突变体的候选基因,为矮杆突变体基因的分离鉴定和开发应用提供了分析方法和新的材料。     

抗、感玉米粗缩病材料对灰飞虱的趋性及生存力影响的研究

通过网棚内人工接种1叶1心至11叶1心期的3份抗玉米粗缩病自交系材料(DB544、沈137、90110)和3份感粗缩病玉米自交系材料(掖107、掖478、5003),调查其发病率,明确了抗病材料7叶前的抗病性与7叶后一致,感病材料7叶后的抗病性比7叶前要强;由此认为,玉米苗期为研究抗、感玉米粗缩病材料对灰飞虱的趋性及生存力影响的适宜时期。进而研究了相同环境条件下,网箱或网罩内灰飞虱在抗、感玉米材料上的落虫数和灰飞虱在上述6份材料上饲养死亡50%的时间。结果显示:灰飞虱对抗、感玉米粗缩病材料的趋性以及灰飞虱在抗病材料和感病材料上的生存力差异均不显著,认为玉米对粗缩病的抗性不是通过抗传毒介体灰飞虱而实现的。     

玉米GY220×1145组合RIL群体粗缩病抗性性状的遗传分析

调查玉米GY220×1145组合的RIL群体109个家系(F10;11)及其亲本在2个环境下粗缩病抗性的表型值,运用RIL群体的主基因多基因模型进行遗传分析,探讨玉米粗缩病抗性遗传规律。结果表明:①2008年GY220/1145组合的RILs粗缩病抗性性状的最佳遗传模型为E-1-5模型,即2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因混合遗传;2009年最佳遗传模型为G-0模型,即3对加性-上位性主基因+加性-上位性多基因模型混合遗传。②各主基因效应值不同。③上位性总效应小于主基因总效应。④有单个上位性效应大于单个主基因效应的情形出现。⑤主基因遗传为主,多基因遗传为辅。     

玉米推广品种与品种资源抗病毒病苗期鉴定初报

通过苗期人工接毒 ,对当前推广的 3 8个杂交种、1 8个自交系玉米品种进行了抗玉米矮花叶病毒鉴定 ,调查了 4 3 8个品种资源材料田间自然感染玉米矮花叶病毒和玉米粗缩病毒的情况。鉴定出高抗玉米矮花叶病毒的玉米杂交种 1 4个、自交系 6个 ,分别占供试材料的 3 6 84 %和 3 1 58% ,品种资源中存有大量的抗性材料 ,抗玉米矮花叶病和玉米粗缩病的材料均在 70 %以上     

Ultrastructural Alteration of Maize Plants Infected with the Maize Rough Dwarf Virus

The ultrastruetural alteration of maize plants infected with the maize rough dwarf virus (MRDV) was studied with transmission electron microscopy. The results revealed that aggregates of virus particles, with a diameter of 60nm, were found in the root cell, and always distributed near the vacuole membrane. However, no such particles were checked in leaf cells. Moreover, no virus was observed in choroplasts,mitochondria nuclei, plasmodesmata or intercellular canal of all kinds of infected cells of maize, either.Structures of various organelles changed in the infected leaf and root cells of maize. An inward collapse and localized splitting of the tonoplast were observed, the chloropoast structure was destroyed by MRDV, and the number of destroyed or dysplasia chloroplast in leaf cells with serious symptoms was more than that in leaves without symptoms. The matrix of mitochondria in cells infected by MRDV decreased and some of them expanded and destructed. Nuclei was abnormal and the nuclear membrane was broken, In addition, the infected cells were characterized by a voluminous cytoplasm containing hypertrophied endoplasmic reticulum, with rich ribosome content and lots of starch grain.     

水稻黑条矮缩病毒在不同抗性玉米自交系叶片内的积累研究

应用玉米粗缩病病情严重度分级标准,对已知抗性水平的抗病、中抗和感病自交系材料逐株进行病情严重度分级调查。采集不同级别病株的玉米新叶,用间接酶联免疫吸附法(Indirect enzyme-linked immunosorbentassay,ID-ELISA)检测病株叶片中水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus,RBSDV)。采用SPSS软件对O.D405光密度值进行差异显著性分析。结果显示:同一抗性水平、不同级别的玉米自交系病株叶片内的RBSDV浓度差异显著(F=237.499,P<0.01),且随病株病级加大,病毒浓度升高;而相同病级的抗病、感病和中抗玉米自交系叶片内的RBSDV浓度无显著差异(F=0.775,P=0.598);抗病自交系病株叶片中的病毒总浓度显著低于感病自交系材料。试验结果表明:玉米粗缩病病株叶片内的病毒浓度与生物学症状呈正相关,病情越重,病毒浓度越高。RBSDV一旦侵入寄主,在抗病、感病和中抗的自交系植株体内均可增殖,并运转到新生叶片。此结论为从分子水平上进一步揭示玉米抗粗缩病的机理奠定了基础。