软腐灵的模拟生产发酵工艺研究与田间应用

具有拮抗大白菜软腐病功能的菌株90-2-1-2(Pseudomonas.sp.)的培养及最大菌落数产生的发酵模拟生产工艺条件经正交试验得到最适的培养基碳、氮源组成(%)为葡萄糖1.5,大豆饼粉2.0,淀粉1.0,酵母粉1.5;最适生长温度为30℃;pH7.0,接种量4%,在250mL三角瓶装70mL培养基,200r/min摇床上培养35h,菌落数为1.25CFU×109;发酵罐发酵(1t罐)22h,终点总菌落数为1.48×1010CFU/mL.由上述工艺制得的该生防制剂软腐灵,经田间试验结果表明对软腐病菌有强烈的抑制作用,大白菜用软腐灵处理二次的防病增产效果优于只用一次的处理,对大白菜软腐病有70%～80%的防治效果,并有20%左右的增产作用.     

抗番茄灰霉病菌农用抗生素D2-4发酵条件的研究

对拮抗番茄灰霉病菌的D2 -4菌株培养基成分和发酵条件进行了研究。经研究发现在28℃ ,180r·min -1条件下 ,最佳发酵时间为96h左右 ,培养20～24h的种子液以7 %的接种量转接有利于提高抑菌活性 ,装液量为60mL/250mL三角瓶 ,均匀设计试验得出,最佳培养基配方为:黄豆饼粉1.10 %、葡萄糖2.71 %、蔗糖1.00 %、NaCl0.10 %、酵母膏0.10 %、pH值6.61。     

响应面法优化枯草芽孢杆菌NS178产芽孢发酵工艺

应用单因素设计法对影响内生枯草芽孢杆菌NS178发酵液菌落数的因子进行筛选,得到3个主要影响因子,分别为葡萄糖、(NH4)2SO4、K2HPO4。采用Box-Behnken Design法对发酵培养基进行优化,通过响应面法分析获得最佳配方为葡萄糖2.29%、(NH4)2SO40.3%、K2HPO40.23%。对温度、初始p H值、装液量3组培养条件进行优化,最佳条件为33°C、p H 7.6、50 m L。在最佳配方和培养条件下,NS178发酵液菌落数为34.50×108cfu/m L;培养72 h时芽孢率达到75.8%;优化后比优化前发酵液抑菌圈直径增加67%。     

复合芽胞杆菌共培养条件的响应面优化研究

在前期筛选出了具有耐盐、促生能力的短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)SC-12和具有高效广谱抗病能力的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BZ6-1,而且两株菌不存在拮抗作用。为了获得活菌数高、经济效益好的复合芽胞杆菌菌剂,以上述两株菌为研究对象,以活菌数为指标,采用单因素法、最陡爬坡法和Box-Behnken响应面法设计并优化共培养条件,并在100 L发酵罐中进行了验证试验。获得的最佳共培养条件如下:SC-12与BZ6-1的菌落数比例为2∶1(v/v);培养温度为30℃;培养时间为16 h;接种量为3%(v/v);转速为132 r/min;pH值为7.6。以优化后的培养条件进行两个菌株的共培养,得到的菌落数为11.00×108cfu/mL,比原始发酵得到的菌落数增加了39.20%;在100 L发酵罐中发酵的菌落数达到10.30×108cfu/mL,比原始发酵的菌落数增加了43.00%。     

乳酸菌复合系SFC-2增菌培养基的优化

通过对乳酸菌复合系SFC-2培养基的组分进行响应面优化,从而得出SFC-2优化培养基配方为白砂糖10g／L、蛋白胨31．36g／L、牛肉膏15．57g／L、酵母膏10g／L、乙酸钠7．3g／L、柠檬酸三铵4g／L、KzHP044g／L、MgS04·7H200．58g／L、MnSO4·H200．25g／L。SFC-2在此培养基中经30℃,16h培养,其活菌数可达到4．0×10^8cfu／mL,较MRS-S中（8．2×10^7cfu／mL）提高近5倍。     

利用响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌ZJ20发酵参数

【目的】优化贝莱斯芽孢杆菌的培养条件,以提高其菌落数和抗菌活性,为该菌株工业化生产提供理论依据。【方法】以贝莱斯芽孢杆菌ZJ20为供试菌株,采用单因素试验,研究培养基、pH、温度、转速对ZJ20菌落数和抗菌活性的影响;在此基础上,以菌落数为考察指标,采用响应面法对pH、温度、转速3个因素进行进一步的优化,得到了贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的最佳培养条件;最后在温室采用盆栽试验,研究最佳培养条件得到的贝莱斯芽孢杆菌ZJ20对杂交竹梢枯病的防治效果。【结果】单因素试验结果显示,供试培养基中,NB培养基(牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH 7.0～7.2)上贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均最高,分别为4.11×108 CFU/mL和6.10mm,且显著高于其余培养基,说明NB培养基更有利于贝莱斯芽孢杆菌的生长。当pH为4～10时,随着pH的增加,贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均先增后降,其中当pH为7～8时ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均显著高于其他处理;在此基础上的复筛结果显示,7.0～7.4为贝莱斯芽孢杆菌的最优pH。当转速为140～200r/min时,随着转速的增加,贝莱斯芽孢杆菌ZJ20的菌落数和抑菌圈直径均先增后降,其中当转速为160～180r/min时,菌落数和抑菌圈直径均较高。温度为22～30℃时,随着温度的升高,菌落数和抑菌圈直径均先增加后下降,其中当温度为22～28℃时菌落数和抑菌圈直径均较高。响应面试验结果显示,3个因素中,转速对菌落生长和繁殖的影响最大,其次是温度,影响最小的是pH,贝莱斯芽孢杆菌ZJ20最优培养条件为:pH 7.27,转速160r/min,温度28℃,在此条件下测定的菌落数为769×107 CFU/mL。盆栽试验结果显示,优化培养条件下得到的ZJ20悬液防治效果明显提高,均超过50%。【结论】得到了贝莱斯芽孢杆菌的最佳培养条件,这不仅使其菌落数增加,而且极大地增强了该菌的抗病活性。     

良种菠萝G—74及MD—2的离体繁殖

1、材料菠萝MD—2、G—74的幼嫩茎段2、培养条件活性炭培养基中均加白砂糖4％、琼脂4％、pH5．8、培养温度25～30℃、照光10h／d、光照度1500lx。3、生长与分化MD—2、G—74两个品种可以用同样方法取得无菌材料，并可以在同样培养基中进行繁殖、生长。，取良种菠萝MD—2、G—74的幼嫩茎段，除去叶片，放人加有少量中性洗涤剂的自来水中，用细软毛刷轻刷茎段，然后用自来水冲洗2h以上，取出轻轻用滤纸吸于，然后在超净台上进行无菌操作：将材料放入经高温灭菌的烧杯中，加75％乙醇浸洗片刻，然后放入0．1％的升汞溶液中处理10min，再用…     

益生菌SFU—9发酵工艺的确定

益生菌具有促进动物生长，提高机体免疫能力等生理功能，常用作微生态饲料添加剂。菌体SFU－9是一株蜡状芽杆菌，该菌株在不利环境下能够以孢子形式存在，具有耐高温，耐酸碱和耐挤压等优点，较乳酸菌，酵母菌等益生菌更能保持活菌状态，适合饲料加工业的需要。该研究以菌株SFU－9进行实验，研究发酵温度，接种量，培养基初始pH值，溶解氧等因素对菌株生长的影响，确定出最佳培养条件为：培养基初始pH值为6．0－6．5，接种量5％（相对摇瓶装液量），培养温度30－32℃，装液量28-33mL/250mL。发醇液中的活菌数可达10^11cfu/mL。在此基础上，采用单因子和正交实验相结合的方法，确定出最佳发酵培养基组成为：玉米淀粉2．0％，啤酒酵母1．5％，NaH2PO40.2%,Na2HPO40.2%,玉米浆2．0％。是以最佳培养基配方给菌体提供营养，在最佳培养条件下培养，可以使发酵液中的活菌数高达10^12cfu/mL.     

益生菌SFU—9发酵工艺的确定

益生菌具有促进动物生长，提高机体免疫能力等生理功能，常用作微生态饲料添加剂。菌体SFU－9是一株蜡状芽杆菌，该菌株在不利环境下能够以孢子形式存在，具有耐高温，耐酸碱和耐挤压等优点，较乳酸菌，酵母菌等益生菌更能保持活菌状态，适合饲料加工业的需要。该研究以菌株SFU－9进行实验，研究发酵温度，接种量，培养基初始pH值，溶解氧等因素对菌株生长的影响，确定出最佳培养条件为：培养基初始pH值为6．0－6．5，接种量5％（相对摇瓶装液量），培养温度30－32℃，装液量28-33mL/250mL。发醇液中的活菌数可达10^11cfu/mL。在此基础上，采用单因子和正交实验相结合的方法，确定出最佳发酵培养基组成为：玉米淀粉2．0％，啤酒酵母1．5％，NaH2PO40.2%,Na2HPO40.2%,玉米浆2．0％。是以最佳培养基配方给菌体提供营养，在最佳培养条件下培养，可以使发酵液中的活菌数高达10^12cfu/mL.     

人基质蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域原核表达优化

用构建的人基质蛋白酶-2（MMP-2）类血红素结构域原核表达载体PET25b—PEX转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性菌落LB液体培养基培养，异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达产生的表达蛋白，大小约29kD，与预期大小相符。设置不同的IPTG诱导终浓度，诱导时间，诱导时菌液OD值和LB液体培养基的pH值，SDS-PAGE电泳和软件分析发现，当IPTG浓度为0．7mmol／L，诱导4h，诱导时菌液OD值为0．7时，实验能获得最高的PEX蛋白表达；5L大规模培养时，LB培养基pH值为7．5时，可获得较高的重组PEX蛋白表达。     

番茄灰霉病菌拮抗菌D2-4发酵条件的研究

对拮抗番茄灰霉病菌的 D2 - 4菌株培养基成分和发酵条件进行研究。结果表明 ,在 2 8℃ ,180 r· min- 1 振荡培养条件下 ,最佳发酵时间为 96 h左右 ,培养 2 0～ 2 4 h的种子液以 7%的接种量转接有利于提高抑菌活性 ,装液量为6 0 m L· 2 5 0 m L- 1 三角瓶 ,均匀设计试验得出 ,最佳培养基配方为 (10 0 m L发酵培养基中含 ) :黄豆饼粉 1.10 g、葡萄糖 2 .71g、蔗糖 1.0 0 g、Na Cl0 .10 g、酵母膏 0 .10 g、p H6 .6 1。     

解磷菌PSBHY-3的发酵培养工艺参数优化

【目的】优化解磷菌PSBHY-3的培养参数,为水产养殖专用解磷菌的工业化发酵生产提供技术支持。【方法】通过单因素试验筛选适合解磷菌菌株PSBHY-3生长的发酵培养基碳氮源及其含量;采用Plackett-Burman试验筛选获得对菌量影响最显著的3个因子;通过最陡爬坡试验和Box-Behnken试验确定显著因子的最佳水平,建立主要培养参数的回归方程,得出优化后显著因子的最佳值及预测菌量;通过摇瓶试验验证,检验模型方程的准确性。【结果】菌株PSBHY-3的最佳碳源、氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨—酵母膏（1∶1）。以温度（A）、蛋白胨—酵母膏（B）和转速（C）为因素变量,菌株PSBHY-3的菌量为响应值,拟合得到二次多元回归方程Y=17.10-0.88A+0.55B+1.27C+0.24AB+0.34AC-0.24BC-3.57A2-2.78B2-6.13C2。优化得到的解磷菌菌株PSBHY-3最佳发酵培养参数为:可溶性淀粉10.0 g/L,蛋白胨10.18 g/L,酵母膏10.18 g/L,氯化钠3.0 g/L,硫酸镁1.0 g/L,pH 7,培养温度35.54℃,转速164 r/min,接种量1%,装液量60%（V/V）。在最佳发酵培养条件下,菌量实际值为1.81×109 CFU/mL,与理论菌量（1.72×109 CFU/mL）间无显著差异（P> 0.05）,但显著高于优化前采用营养肉汤培养的菌量（1.90×108 CFU/mL）（P< 0.05）。【结论】通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验等优化了菌株PSBHY-3的发酵参数,显著提高了目的菌量,回归方程预测准确,优化后的发酵参数可用于水产养殖专用解磷菌的工业化发酵生产。     

拮抗甜瓜枯萎病链霉菌D2菌株发酵条件的优化

[目的]优化甜瓜枯萎病拮抗链霉菌D2菌株的发酵条件,为该菌发酵方法的建立及工业化生产提供科学依据.[方法]以D2菌株有效活菌数为考察指标,玉米粉含量、豆饼粉含量、pH、摇床转速、接种量和温度为影响因素,利用响应面法对D2菌株的发酵条件进行优化.[结果]豆饼粉含量、玉米粉含量和温度对D2菌株有效活菌数有显著影响(P<0.05).D2菌株有效活菌数回归模型为:Y=8.28757+0.12344X1+0.21477X2+0.06184X3-0.05929X12-0.09817X22-0.14942X32(式中,Y为有效活菌数对数,X1、X2和X3分别为玉米粉含量、豆饼粉含量和温度的编码值),理论有效活菌数为2.99×108 CFU/mL.D2菌株最优发酵条件为:玉米粉含量39.08 g/L、豆饼粉含量39.19 g/L、培养温度37.4℃,在此条件下D2菌株有效活菌数为3.01×108 CFU/mL,与理论值接近,但极显著高于未经优化采用培养基Ⅱ得到的有效活菌数(1.0×106 CFU/mL)(P<0.01).[结论]采用响应面法优化得到的D2菌株发酵条件可有效提高该菌株有效活菌数,且回归模型推算出的理论活菌数与优化条件发酵的有效活菌数接近,可用于指导D2菌株的实际规模化生产.     

降解胆固醇的芽孢杆菌T12—1的培养条件研究

以胆固醇为惟一碳源和能源 ,从食肉动物雪豹肠道分离出一株胆固醇降解酶活力较高的 T12 - 1菌株 ,初步鉴定为好气性芽孢杆菌。经实验确定 ,其胆固醇降解酶产生的最适宜条件为培养温度 32℃ ,培养基p H6 .5～ 7。用 2 50 m L三角瓶装 6 0 m L培养基 ,振荡培养 10 h,培养基中酵母膏含量为 5g.L-1、胆固醇含量为 1g.L-1、吐温 80含量 1m L.L-1,其胆固醇降解酶活力可达 3.6 1× 10 -3 μU.m L-1。     

新疆伊宁市部分售奶站生鲜乳中微生物污染的调查分析

[目的]研究伊宁市生鲜乳中主要微生物的含量,为散装生鲜乳销售环节的卫生质量安全检测研究提供参考。[方法]针对新疆伊宁市8个不同片区售奶站进行采样,研究不同季节生鲜乳中菌落总数、大肠菌群数、芽孢总数和耐热芽孢总数的含量变化。[结果]2014年6月~2015年5月期间,伊宁市8个售奶站的生鲜乳在感官方面色泽、滋味、气味均正常,且不存在凝块、沉淀、肉眼可见异物现象;主要微生物含量指标菌落总数、大肠菌群数、芽孢总数和耐热芽孢总数分别为:3.08×105~8.48×105CFU/m L、1.5×105~8.1×105MPN/L、21~75 CFU/m L和3~8 CFU/m L,均符合国家标准。但散奶户所销售的生鲜乳中检查出微生物的含量要明显高于售奶站的鲜乳。[结论]新疆伊宁市部分奶站所售生鲜乳中主要微生物含量各项指标整体均符合国家标准,反映出伊宁市生鲜乳卫生管控整体水平较高。     

不同培养基对两种乳酸菌复合系生长的影响

采用两组乳酸菌复合系,以MRS改良培养基为对照,初步研究以玉米面、玉米蛋白及马铃薯淀粉作为培养基成分时,乳酸菌复合系的生长情况,并筛选两组复合菌系生长最适的培养基．结果表明：复合系LBC-8在玉米面、玉米蛋白与葡萄糖7：3配比培养基中生长最适;复合系LBC-8和SFC-2的pH值下降程度,OD600nm的增加幅度,玉米面与葡萄糖培养基中较马铃薯淀粉与酵母粉培养基中明显;两组复合系分别在马铃薯淀粉与酵母粉3：7和5：5配比中生长菌落数最多,分别为5．0×10^7CFU／mL、3．4×10^7CFU／mL．     

猪链球菌4型转录调控因子GalR的生物学特性

【目的】 研究分析猪链球菌4型（Streptococcus suis serotype 4,SS4）强毒株SH1510 转录调控因子GalR基因的缺失对细菌生物学特性的影响,为进一步研究GalR对半乳糖代谢途径的调控及其致病机理提供理论依据。【方法】 利用同源重组双交换的方法构建了SS4强毒株SH1510 转录调控因子GalR基因缺失株SH1510ΔGalR,通过GalR基因内部扩增引物I1/I2进行缺失株初步筛选,进一步通过PCR和Western blotting鉴定缺失株SH1510ΔGalR。对亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR进行革兰氏染色以比较形态差异;配置基础培养基,分别加入葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖后培养细菌,绘制细菌生长曲线,比较细菌对不同糖的利用率;将亲本株和缺失株的菌液浓度分别调整为2.5×10 ⁹、5×10 ⁸、1×10 ⁸、2×10 ⁷ CFU/mL,对BALB/c小鼠进行腹腔注射以观察小鼠致死率并使用Reed-Muench法计算菌株LD₅₀。将浓度为2×10 ⁷CFU/mL的亲本株和缺失株1﹕1等体积混合后腹腔注射BALB/c小鼠,24 h后取脑、脾、血在氯霉素抗性和无抗性THB平板上进行细菌计数,比较细菌在小鼠体内的定植能力;并以健康猪的全血模仿体内环境,将亲本株和缺失株分别加入含有SS4抗血清的健康猪全血中,37℃孵育2 h进行平板计数,比较细菌在全血中的存活能力。【结果】 使用内部检测引物I1/I2做PCR,缺失株SH1510ΔGalR检测为阴性,进一步使用引物C1/C2、O1/C2、O2/C1、O1/O2鉴定缺失株SH1510ΔGalR,分别扩增出1 056、2 121、2 094、3 147 bp的片段,结果和预期相符。Western blotting 鉴定结果表明亲本株SH1510可与粗制GalR多抗兔血清发生特异性结合,在37 kD处出现单一条带,但缺失株SH1510ΔGalR没有条带出现。PCR和Western blotting鉴定结果均表明缺失株SH1510ΔGalR已构建成功。亲本株和缺失株经革兰氏染色,光学显微镜下观察可见亲本株和缺失株均呈链状排列,长度相似,形态无显著差异。在葡萄糖和蔗糖作为唯一糖原的生长条件下,亲本株和缺失株的生长情况相仿,而当糖原为D-半乳糖时,缺失株的生长速率和OD₆₀₀值明显低于亲本株。另外,从最高OD₆₀₀值可以看出,猪链球菌SH1510对糖的利用率为葡萄糖>蔗糖>D-半乳糖。 小鼠致病性试验中,亲本株和缺失株的LD₅₀分别为1×10 ⁸CFU和1.62×10 ⁸CFU,缺失株对小鼠的致病性下降了1.62倍。体内竞争感染试验结果显示,缺失株在小鼠的脑、脾、血液中的细菌分离数均远低于亲本株,差异极显著（P＜0.01）。全血存活试验表示,亲本株的存活率为35.2%,缺失株的存活率为27.3%,缺失株SH1510ΔGalR比亲本株SH1510在全血中的存活率显著下降（P＜0.05）。【结论】 GalR 基因可促进猪链球菌4型对半乳糖的利用,同时对SH1510的毒力有直接或间接的调控作用。     

侧孢芽孢杆菌C5发酵条件及培养基的优化

为了更加有效地利用侧孢芽孢杆菌C5,研究了该菌株的生长特性,并对其发酵条件及培养基进行了优化。结果表明,侧孢芽孢杆菌C5的生长规律为:0~4h延滞期,4~16h指数期,16h后进入稳定期;最佳发酵条件为:初始pH值7.0、培养温度30℃、接种量3%~5%、转速180r/min;最适培养基为:葡萄糖20.0g/L、酵母膏10.0g/L、MnSO_4 0.2g/L、CaCl_2 0.3g/L、KH_2PO_4 0.1g/L、MgSO_4 0.05g/L。在上述条件下,侧孢芽孢杆菌C5的发酵芽孢数可达1.08×109CFU/mL。     

枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)发酵产酶培养基的响应面法优化

采用响应面法对枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)产葡聚糖内切酶(CMCase)的液体发酵培养基进行优化。用单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源、氮源和无机盐;通过中心组合试验和响应面法优化以上因素,得到的优化发酵培养基为:麦秸23.18 g.L-1、麦麸30.00 g.L-1、酵母膏13.62 g.L-1、KH2PO44.60 g.L-1、NaCl 4.60 g.L-1、MgSO4.7 H2O 0.46 g.L-1。在此条件下,该菌发酵液中CMCase活力达2.80 U.mL-1,较优化前提高了2.18倍。     

饲用地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株发酵培养基及发酵条件优化

[目的]地衣芽孢杆菌规模化发展.[方法]采用碳、氮源及微量元素的筛选实验和正交实验.[结果]确定地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株发酵培养基的最佳组分为(g/L):蔗糖60、蛋白胨30、NaCl 30 、K2HPO4 2、MgSO4 1、FeSO4 0.02、MnSO4 0.01.对发酵条件进行了研究,发酵的最适初始pH值为5.5,最适培养温度为35℃,最适装液量为10 mL(250 mL三角瓶).[结论]通过优化培养基组分和培养条件后,菌株TS-Ⅱ活菌数达到了6.58×10~(10) CFU/mL,为以后的工业化生产奠定基础.