威宁中华蟾蜍的分子鉴定

为明确威宁中华蟾蜍的分子分类学地位,对采自贵州省威宁县的蟾蜍标本（标本号：LPSWN01A）进行线粒体12S rRNA 基因扩增和双重单系法分析。结果表明：该标本的序列大小为906 bp （GenBank 登录号：KJ803016）,基于数据集 A 构建的系统发育树中,威宁中华蟾蜍与7条中华蟾蜍同源序列聚为一个单系（中华蟾蜍支系）,威宁中华蟾蜍以较低的最大似然率独立为一个支系;基于数据集 B 构建的系统发育树中,威宁中华蟾蜍与2个中华蟾蜍华西亚种种群聚为一支,因此推断威宁产蟾蜍属于中华蟾蜍华西亚种（Bufo gararizans andrewsi ）。另外,威宁中华蟾蜍与云南怒江种群的遗传距离最近,为0．0093,说明威宁中华蟾蜍属于中华蟾蜍华西亚种,与之前的传统分类文献记载一致。     

太湖流域河川沙塘鳢线粒体12S和16S rRNA基因序列分析

作为东南亚所特有的小型经济鱼类之一的太湖流域河川沙塘(Odontobutis potamophila)长期被归为河川沙塘鳢.为明确太湖流域河川沙塘鳢在沙塘鳢属中的分类地位,克隆测定了其线粒体12S和16S rRNA基因部分序列.在同源的658 bp长的12S rRNA基因序列中,有变异位点187个,简约信息位点133个;在同源的528 bp 的16SrRNA基因同源序列中,有变异位点98个,简约信息位点45个.通过与其他沙塘鳢属鱼类的12S rRNA基因 列比较发现,太湖流域河川沙塘鳢与福建河川沙塘鳢的种内遗传距离为0.114,大于种内的遗传距离(0.00 ～0.024),且在16S rRNA基因序列分析中发现,太湖流域河川沙塘鳢与中国河川沙塘鳢的种内遗传距离为0.123,大于种内的遗传距离(0.00～0.016).12S和16S rRNA系统发育分析也表明,太湖流域河川沙塘鳢有别于其他类别的沙塘鳢,且与已知的河川沙塘鳢存在分子遗传进化差异.     

DNA条形码技术在黑龙江地区姬小蜂科物种鉴定中的应用与分析

姬小蜂科寄生蜂在农业害虫防治应用中起着非常重要的作用,但因体型小种类多,鉴定较难,导致开发利用的局限性。随着分子生物学的快速发展,通过形态学与分子生物学相结合的方法来研究小蜂总科已经成为发展趋势。利用黑龙江省的6个吸虫塔收集到了238个姬小蜂科样本。在DNA提取之前通过形态学鉴定为14属52种。对其中60个COI和68个28S基因进行了扩增和测序,并将基因登录号提交GenBank;COI基因的登录号为MG836426～MG836501,28S基因的登录号为MH169011～MH169101。经进一步计算COI和28S基因的种内和种间遗传距离发现,COI基因的种间遗传距离差异显著,最小种间遗传距离(6.00%)远大于最大种内遗传距离(3.02%)。但是,28S基因的差异较大,许多属的种内遗传距离超过种间遗传距离,重叠现象严重。用MEGA-7.0软件进一步分析了COI基因的序列相似性和系统发育关系,结果表明：COI基因序列的聚类结果与形态学分类基本一致,而28S基因序列的聚类结果与形态学结果有较大差异。可见COI基因在姬小蜂科的分类鉴定和系统发育分析上比28S基因有很大优势,更适合姬小蜂科...     

贵州都匀仙女虾的分子鉴定

2021年9月在贵州省都匀市甲登村一池塘内发现一种仙女虾，采用PCR扩增技术和DNA测序技术对该仙女虾进行鉴定。结果显示，都匀仙女虾COI、16S rRNA基因序列与鹄沼枝额虫(Branchinella kugenumaensis)相似度分别为98.71%、98.96%。结合GenBank中无背甲目部分科物种的同源序列，开展遗传距离和系统发育关系分析，基于COI、16S rRNA基因遗传距离显示，都匀仙女虾与鹄沼枝额虫的遗传距离分别为0.017、0.000。系统发育树显示，都匀仙女虾与鹄沼枝额虫聚在一起形成单支系，COI-based树和16S rRNA-based树的支持率分别为100%和99%。鉴定结果表明，贵州省都匀市甲登村的仙女虾是钗额虫科(Thamnocephalidae)枝额虫属(Branchinella)的鹄沼枝额虫。     

高体革鯻线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段的克隆与序列分析

[目的]为高体革鯻的遗传资源、物种间的亲缘关系和系统进化等研究提供一定的生物学依据。[方法]采用PCR扩增和序列测定等技术,对高体革鯻线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段进行初步研究。[结果]经PCR扩增和测序,分别得到16S rRNA和COI基因片段的碱基序列,其中16SrRNA基因片段的大小为791 bp,碱基A、T、G、C的含量分别为31.6%、21.4%、20.4%和26.7%;COI基因片段的大小为631 bp,碱基A、T、G、C含量分别为27.7%、23.6%、29.8%和18.9%。在这2个基因片段中,GC含量均低于AT含量,AT/GC分别为1.13和1.05。[结论]通过对高体革鯻16S rRNA和COI2个基因片段遗传特征的研究,发现其种内变异比较低,在3个样本中16S rRNA基因片段序列完全一样,COI基因片段也完全一样,说明高体革鯻的这2个基因都非常保守。     

贵州兴义华西雨蛙的分子鉴定

对采自贵州省兴义市的华西雨蛙(Hyla gongshanensis)标本进行了线粒体16S r RNA基因扩增,并用双重单系法分析构建了华西雨蛙各种群的系统发育树。结果表明,该标本属华西雨蛙,群内部分化为兴义支系、云南曲靖支系和越南沙巴支系,而3个支系间相互聚类关系有待进一步深入研究。     

基于COI条形码的根口水母科Rhizostomatidae水母分子系统进化研究

为探讨DNA条形码基因COI序列在根口水母科Rhizostomatidae水母物种鉴定中的有效性,分析了根口水母科3属6种水母及口冠水母科1属1种共计265条线粒体COI基因同源序列,利用MEGA 3.0计算根口水母科种内与种间的遗传距离,并基于邻接法(Neibour-Joining,NJ)、最大似然法(Maximum Likelihood,ML)和贝叶斯法(Bayesian,BI)构建了其分子系统进化树。结果表明:4个属7种水母种类COI基因同源序列长度为482 bp,种间遗传距离为0.065~0.235,平均遗传距离为0.198,种内遗传距离为0~0.032,平均为0.006,其中种间平均遗传距离(0.198)显著大于种内平均遗传距离(0.006),种间遗传距离是种内遗传距离的33倍;根口水母科水母种间遗传距离均大于Hebert推荐区分物种的最小种间遗传距离(0.02);采用NJ法、ML法和BI法构建的分子系统树拓扑结构基本一致,同一物种不同个体间均能聚成独立的单系群,表明COI基因可作为根口水母科水母种类准确鉴定的有效条形码基因;系统进化树显示,海蜇属为单系群,系统进化分析结果与形态分类学的观点并不十分一致。研究表明,COI基因序列在根口水母科不同阶元间变异较大,适合于根口水母科水母种类鉴定及群体水平的分子标记。     

梭鱼和鲻鱼线粒体16S rRNA和COⅠ基因片段的比较分析

运用PCR技术,扩增了梭鱼和鲻鱼线粒体16S rRNA和COⅠ基因片段,并比较分析了其种间的序列差异。获得16S rRNA基因的540～560 bp碱基序列,出现26个碱基的插入与缺失位点;获得COⅠ基因的602～604 bp碱基序列,出现2个插入缺失位点;16S rRNA和COⅠ基因的序列中G平均含量最低,且（A＋T）含量高于（G＋C）含量,与其他鱼类中的16S rRNA和COⅠ基因片段研究结果相一致。在16S rRNA基因片段中,梭鱼出现1种单倍型,鲻鱼为2种单倍型;在COⅠ基因片段中,梭鱼样品中检测到3个单倍型,鲻鱼样品中检测到5个单倍型。以Takifugu poecilonotus为外群,构建的NJ系统发育树,基于16S rRNA和COⅠ基因序列获得的NJ系统树基本一致,鲻鱼和梭鱼种内个体分别聚为一支,显示16S rRNA和COⅠ基因适合于梭鱼和鲻鱼的物种鉴定。     

豫北泥鳅线粒体DNA 16S rRNA和12S rRNA基因序列的遗传多样性分析

为了评价豫北地区泥鳅种质资源的多样性,以采自新乡地区泥鳅种群中的11个个体为材料,利用PCR技术扩增其线粒体16S rRNA和12S rRNA基因的部分序列,利用 Clustalw 2．0和DNAsp 4．10软件分析了不同个体间的差异和遗传多样性。结果表明：16S rRNA和12S rRNA基因种内个体间的差异分别为0．25％和0．97％,二者的分化程度较低;16S rRNA的进化速度约为12S rRNA基因的4倍。16S rRNA和12S rRNA种群群体的单倍型间平均遗传距离分别为0.0027、0.0016,单倍型多样度指数分别为0.873、0.327,核苷酸多样性指数分别为0.00265和0.00081,平均核苷酸差异数分别为1.636和0.327。可见,豫北泥鳅种群具有较低的遗传多样性。     

南方鲇16SrRNA基因片段序列差异及遗传多样性分析

从5个种群南方鲇(Silurus merdionalis)线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)扩增出约600 bp的16SrRNA基因片段,经Clustal X同源排序后得540 bp序列.用PopGen 32软件计算遗传距离和遗传一致度,且对5个种群16SrRNA基因片段序列遗传关系进行聚类分析.结果表明:18个个体间的遗传距离变化为0～0.000 9,遗传一致度变化为0.999 1～1;在长江上游支流中,南方鲇不同种群间在该基因片段上基本没有差异,只有乌江种群与其他种群有2个碱基差异;长江中游支流的洞庭湖种群与长江上游支流的各种群间在该基因片段存在一定差异;5个种群16SrRNA基因片段序列遗传关系聚为3支,其中,雅砻江、岷江、宜宾3个种群聚为1支,乌江种群聚为1支,洞庭湖种群聚为1支.     

猪附红细胞体特异性基因的克隆和序列分析

为分析吉林省流行的猪附红细胞体基因序列,根据发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计引物,扩增出长度约为541 bp的基因片段,并成功地将该基因克隆到pGEM-T Easy载体.将经Not Ⅰ酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,与发表的附红细胞体基因序列进行比较,试验所获得的核苷酸序列与猪附红细胞体16S rRNA基因序列非常相近,同源性为97.8%～100%,从而证明吉林省所流行的猪附红细胞体属于16S rRNA基因群.     

基于16S rRNA和COⅠ基因序列的笛鲷属鱼类系统进化关系探讨

为探讨笛鲷属(Lutjanus)鱼类的系统进化关系,对分布中国南海的12种笛鲷属鱼类16S rRNA和COⅠ基因的部分序列进行PCR扩增和测序,结合从GenBank中下载的胸斑笛鲷(Lutjanus carponotatus)、四线笛鲷(Lutjanus kasmira)、驼背笛鲷(Lutjanus gibbus)和单斑笛鲷(Lutjanus monostigma)序列进行分析,利用MEGA软件计算各物种间遗传距离并构建分子系统进化树.结果显示:16S rRNA基因同源序列为560 bp,COⅠ基因为639 bp. 16S rRNA基因序列变异较为保守,种间平均遗传距离为0.039,COⅠ种间平均遗传距离为0.146. 16种笛鲷在系统进化树上主要聚为4个分支,各分支中的笛鲷种类与其形态特征有一定的相关性,分支Ⅰ中勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)、金焰笛鲷(Lutjanus fulviflamma)和单斑笛鲷体背后上方具有椭圆形黑斑;分支Ⅱ中金带笛鲷(Lutjanus fulvus)与四线笛鲷体表具有若干纵向条纹,蓝点笛鲷(Lutjanus rivalatus)与星点笛鲷(Lutjanus stellatus)身体体背后上方均具有白色斑点;分支Ⅳ中千年笛鲷(Lutjanus sebae)、红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)、马拉巴笛鲷(Lutjanus malabaricus)与驼背笛鲷体型较大,成鱼体色为鲜红色.此外,在体型方面,分支Ⅰ中笛鲷种类体型较小,身体修长,分支Ⅳ体型较高,分支Ⅱ和Ⅲ体型介于两者之间,与前人研究认为体型、体色、条带可作为笛鲷种类划分的基本分类特征的观点一致.     

12S rRNA、Cyt b基因标记在几类野生动物检材鉴定中的差异

【目的】通过比较线粒体DNA上的12S rRNA和Cyt b基因分子标记在几类野生动物物种鉴定中的效果差异,以确定基因标记技术在野生动物物种鉴定中的有效性。【方法】提取各类野生动物样本DNA,PCR扩增线粒体DNA上的12S rRNA基因片段和Cyt b基因片段,对PCR产物进行电泳检测及测序分析,测序结果在Gen Bank上进行BLAST搜索,同源性分析。并将实验序列和NCBI上下载的与该序列存在同源性的序列用软件MEGA 7.0进行比对并构建进化树。【结果】从各类样本中成功地提取到了基因组总DNA,并成功扩增出了用于动物种属鉴定的12S rRNA基因片段、Cyt b基因片段。测序分析结果表明用12S rRNA基因片段和Cyt b基因片段均可准确鉴定黑熊、藏羚羊、鬣羚、穿山甲样本的动物种属,但12S rRNA基因片段无法准确鉴定北山羊样本,BLAST搜索结果为其近缘物种山羊,而Cyt b基因片段却可准确鉴定北山羊。各样本基于12S rRNA、Cyt b基因序列构建进化树的结果与BLAST搜索结果相符。【结论】单一位点基因标记能够准确鉴别亲缘关系较远的物种。但对某些近缘物种,单一位点基因标记的鉴别能力较差,故野生动物物种鉴定宜选用2个以上的基因标记位点。     

中国网柄细胞状黏菌分子系统学研究

基于ITS和18S rRNA基因片段对我国网柄细胞状黏菌进行分类学研究。以11种网柄细胞状黏菌为研究对象,对网柄菌进行多基因片段的扩增与分析,并构建系统发育树。共得到基因序列42条,其中ITS基因序列26条,18S rRNA基因序列16条,系统发育树表明,在物种鉴定上,分子系统学方法具有较高的准确性,但是亲缘关系分支与形态分类学并不完全一致。     

玉兰黄化病病原的分子检测与鉴定

对表现叶片黄化的玉兰植株,利用植原体16S rRNA基因通用引物进行巢式PCR检测,得到1.4 kb的特异片段,将此片段克隆后进行序列测定、分析及构建系统关系树.结果表明,该片段与16SrI组中的各植原体同源率均达到99%以上,而与其他组的植原体16S rDNA序列的同源率均低于97%,认为该植原体株系为翠菊黄化植原体组中的成员之一.     

云南小驳骨丛枝植原体的分子鉴定及相关基因序列分析

【目的】确定采自元谋地区自然表现丛枝病的小驳骨(Gendarussa vulgaris Nees)植株是否感染植原体。【方法】通过利用植原体16S组和亚组通用或半通用特异性引物分别对植原体16S rRNA、rp和secY基因序列进行PCR扩增、克隆及测序分析;此外还对secY蛋白的蛋白特性及其结构进行了分析和预测。【结果】本研究获得了基因片段长度分别为1 248 bp的16S rRNA基因(nested PCR)、1 171 bp的rp基因和1 425 bp的secY基因。基于rp和secY基因核苷酸序列的同源性比对及构建的进化树推断的植原体遗传分化关系几乎与16S rRNA基因的推断相一致,均与植原体16S rⅡ-A亚组各株系的遗传进化关系最为接近,但rp和secY基因序列比16S rRNA基因序列能够呈现出更大的遗传变异程度;此外,对secY蛋白进行了生物信息学分析和初步探讨,发现它具有10个明显且分布相对均匀的跨膜螺旋区域,无信号肽。【结论】小驳骨丛枝病(Gendarussa vulgaris witches’-broom phytoplasma,GvWB-YNym)是由植原体侵染而发生,该植原体株系被划分到16S rⅡ-A亚组,相关的候选种为Candidatus Phytoplasma aurantifolia;secY蛋白生物信息参数的分析表明:secY蛋白在感病小驳骨植株中以疏水性稳定跨膜蛋白的形式存在,含10个明显的疏水跨膜区域,该蛋白不存在信号肽。     

生防菌株HJX1的鉴定和抑菌谱的测定

依据传统形态学、16S rRNA基因序列及脂肪酸图谱鉴定,将一株对香蕉镰刀枯萎病菌有很好抑制效果的菌株HJX1鉴定为枯草芽孢杆菌。采用细菌的通用引物P0和P6扩增16S rRNA基因片段,得到1521bp的DNA片段,其序列与枯草芽孢杆菌的序列的同源性高达99%;细胞组分脂肪酸的含量同枯草芽孢杆菌最近,其相似度为0.724。与病原真菌对峙培养的结果表明,该菌株能对供试的10个植物病原真菌均有很好的抑制作用。     

高体革鯻线粒体DNA16S rRNA和COI基因片段的克隆和序列分析（摘要）

[目的]为高体革鯻的遗传资源、物种间的亲缘关系和系统进化等研究提供一定的生物学依据。[方法]采用PCR扩增和序列测定等技术,对高体革鯻线粒体DNA16S rRNA和COI基因片段进行初步研究。[结果]经PCR扩增和测序,分别得到16SrRNA和COI基因片段的碱基序列,其中16SrRNA基因片段的大小为791bp,碱基A、T、G、C的含量分别为31.6%、21.4%、20.4%和26.7%;COI基因片段的大小为631bp,碱基A、T、G、C含量分别为27.7%、23.6%、29.8%和18.9%。在这2个基因片段中,GC含量均低于AT含量,AT/GC分别为1.13和1.05。[结论]通过对高体革鯻16SrRNA和COI2个基因片段遗传特征的研究,发现其种内变异比较低,在3个样本中16SrRNA基因片段序列完全一样,COI基因片段也完全一样,说明高体革鯻的这2个基因都非常保守。     

败酱及其近缘种的分子鉴定及亲缘关系研究

为了构建败酱Patrinia scabiosifolia与近缘种之间系统发育关系,准确鉴别败酱及其近缘种,对其核基因ITS片段和叶绿体基因psbA-trnH序列扩增和测序,计算物种种内、种间Kimura 2-parameter,(K2P)遗传距离,并采用最近距离、相似性搜索和构建Neighbor-joining,(NJ)系统聚类树3种方法进行鉴定分析。结果表明,ITS和psbAtrnH分子系统树支持败酱不同居群样本聚为一单系分支,支持率分别为65%和68%;其中,败酱与攀倒甑(P. villosa)构成一单系分支,ITS和psbA-trnH数据的支持率分别为51%和99%。败酱及其近缘种种间ITS和psbA-trnH序列的遗传距离为0. 008 31～0. 072 92和0. 005 86～0. 039 18,均远大于败酱种内遗传距离0～0. 003 31和0。由此可知,中药材败酱与攀倒甑亲缘关系最近,ITS和psbA-trnH序列可以准确鉴别败酱及其近缘种。     

5个品种(系)罗非鱼线粒体12S rRNA基因序列及其RFLP分析

采用PCR产物直接测序法分别测定了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)埃及品系、美国品系和吉富品系以及奥利亚罗非鱼(O.aureus)、尼奥罗非鱼(尼罗罗非鱼♂×奥利亚罗非鱼♀)的线粒体12S rRNA基因部分序列,并结合从Genbank中下载的尼罗罗非鱼同源序列进行了序列比对分析。结果表明,3个尼罗罗非鱼品系与从Genbank中下载的尼罗罗非鱼的同源序列仅有1处碱基不同,奥利亚罗非鱼和以奥利亚罗非鱼为母本的尼奥罗非鱼之间也仅有1处碱基不同,但是3个尼罗罗非鱼品系以及从Genbank中下载的尼罗罗非鱼同源序列与奥利亚、尼奥罗非鱼相比对,则有14个位点不同,这个结果符合mtDNA母性遗传的特点,也说明12S rRNA在这5个罗非鱼品种(系)间是相当保守的,尼罗和奥利亚罗非鱼之间尚有一定的遗传多样性,但尼罗罗非鱼3品系的12S rRNA基因序列则几乎完全相同,可见mtDNA 12S rRNA基因不太适用于罗非鱼种内的遗传多样性分析。对得到的PCR产物进行限制性内切酶分析发现,mtDNA 12S rRNA上的BglⅡ酶切位点可作为鉴定尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼及其正反交后代的有效分子标记。