雷公藤hmgr基因克隆、序列分析及诱导表达

【目的】克隆雷公藤萜类生物合成途径限速酶HMGR的编码基因,并分析雷公藤叶悬浮细胞中该基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达水平,为雷公藤萜类生物碱的生物合成提供理论依据。【方法】根据GenBank中报道的限速酶HMGR的编码基因序列合成简并引物,采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE方法从雷公藤叶片中获得hmgr基因的cDNA全长序列;用生物信息学方法对限速酶HMGR进行蛋白结构及功能分析;用半定量RT-PCR方法比较hmgr基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达差异;用HPLC分析不同质量浓度壳寡糖诱导下雷公藤叶悬浮细胞中3种萜类次生代谢物(内酯醇、吉碱和次碱)的含量。【结果】获得了雷公藤中编码限速酶HMGR的基因全长cDNA序列,该序列开放阅读框长为1 860bp,编码579个氨基酸。生物信息学分析表明,雷公藤hmgr基因编码的蛋白分子质量为61.678ku,等电点为6.98,蛋白质稳定性参数为41.33,为不稳定蛋白质,氨基酸序列包含2个与NADPH结合的位点(DAMGMNM和VGTVGGGT)及2个与HMG-CoA结合的位点(EMPVGYVQIP和TTEG-CLVA)。半定量RT-PCR结果表明,经50mg/L壳寡糖诱导12h的雷公藤叶悬浮细胞中hmgr基因表达最强,且在该诱导条件下细胞中的内酯醇、吉碱和次碱的含量也有不同程度的提高。【结论】雷公藤HMGR蛋白可能为甲羟戊酸(MVA)途径中的限速酶,编码该蛋白的hmgr基因可促进雷公藤萜类物质的合成。     

31种药用植物HMGR蛋白的生物信息学分析

利用生物信息学方法对大戟(Euphorbia pekinensis)、曼地亚红豆杉(Taxus media)、球药隔重楼(Paris fargesii)等31种药用植物HMGR蛋白质的理化性质、亲/疏水性、跨膜结构、蛋白质二级结构、信号肽等进行预测和分析。结果表明,31种药用植物HMGR蛋白氨基酸残基数量大部分在500~600 aa之间;大多数定位于质膜上;分子质量在58~65 ku之间;主要富含Gly、Ala、Leu、Ser和Val等氨基酸。HMGR蛋白具有一定的亲水性,含有两个跨膜结构域,均不具有信号肽,二级结构的主要构件为α-螺旋和不规则卷曲。曼地亚红豆杉、罗汉果、假马齿苋、苍术、秦艽、土沉香、丹参、银杏、黄花蒿HMGR蛋白为稳定蛋白,而其余均为较不稳定蛋白。同源性分析表明,除了灵芝以外,其他植物均聚集在同一枝上,药用植物HMGR蛋白有较高的保守性。     

乌龙茶萜类物质及其代谢调控研究进展

香气是评价乌龙茶感官品质的重要指标之一,而萜类化合物在植物界通常表现为花果香气味。总结分析了倍半萜的反式-橙花叔醇及α-法呢烯、单萜的芳樟醇及其氧化物等萜类化合物是乌龙茶中检测到的主要香气组分,香味阈值低,同时对乌龙茶萜类物质合成的部位、影响因素、代谢途径、前体物质以及对影响乌龙茶挥发性萜类物质合成代谢途径中的限速反应及关键调控基因等方面进行综述,并对未来侧重于非生物胁迫作用下乌龙茶加工过程萜类物质的代谢通路以及关键基因功能鉴定等进行了展望,以期更加系统和深入地揭示乌龙茶加工过程中香气形成的作用机制。     

生姜辛香物质合成途径关键基因ZoHMGR的克隆及表达

为探明3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)在生姜(Zingiber officinale Roscoe)倍半萜合成途径的调节作用,根据在竹根姜转录组数据库中HMGR不同转录本序列,经比对分析后利用RT-PCR技术克隆HMGR基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;再利用荧光定量PCR技术检测目的基因在竹根姜不同组织和叶组织在不同诱导条件下的表达特性,同时分析其生成的倍半萜物质。结果表明:克隆的竹根姜ZoHMGR基因编码562个氨基酸,其与姜科植物阳春砂的亲缘关系最近。ZoHMGR基因主要在根茎中表达,其次是叶,而茎和根中的表达量最低,符合生姜不同组织中倍半萜物质的含量特征;该基因同时受物理伤害和茉莉酸甲酯处理的诱导,分别在6h和12h达最高表达水平,同时有倍半萜类物质生成。     

药用植物萜类生物合成β-AS基因研究进展

药用植物中萜类次生代谢产物种类丰富,数量大,现代药理活性突出。β-AS作为萜类成分合成过程中的关键酶,对药用植物萜类活性成分生物合成过程起着至关重要的作用。本文系统阐述β-AS的生物学意义、催化机制、β-AS克隆情况、基因结构以及在重要药用植物中的研究进展。     

洛伐他丁和膦胺霉素对烟草HMGR和DXR活性的影响

HMGR和DXR分别是萜类生物合成途径——MVA和MEP途径的2个关键酶。本研究对烟草施用HMGR和DXR的专一抑制剂洛伐他汀(MEV)和膦胺霉素(FSM),测定烟草Nt HMGR、Nt DXR、FPPS和GGPPS基因转录水平、HMGR和DXR酶活性变化。结果表明,抑制剂处理后烟草内源基因Nt HMGR和Nt DXR表达量在24h受到明显抑制;HMGR和DXR活性均在一定时间内受到抑制。MEV和FSM能有效抑制烟草中HMGR和DXR的活性。     

青天葵HMGR 基因片段的鉴定 和生物信息学分析

采用生物信息学对青天葵转录组测序获取的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因片段Nf HMGR及其编码蛋白进行功能鉴定和表达分析。结果表明,Nf HMGR基因片段序列长度为1 563 bp,与其他植物HMGR基因的同源性最高可达88%;编码含有521个氨基酸、分子量约为55.34 ku的亲水性不稳定蛋白。Nf HMGR蛋白具有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶Ⅰ类酶功能域,归属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶超级家族,包含3处跨膜结构域,不含任何信号肽、转运肽,二级结构表现为混合型结构蛋白质。在青天葵不同组织中,Nf HMGR基因在球茎中的表达量高于在叶片中的表达量。     

抗肿瘤药用植物及其内生菌活性代谢产物的研究

综述近年来药用植物及其内生菌抗肿瘤活性代谢产物的研究成果。药用植物内生菌的次生代谢产物中,具有抗肿瘤作用的成分主要包含萜类化合物、生物碱类化合物、苯丙素类化合物、黄酮类化合物等多种活性物质,该研究结果为利用药用植物内生菌开发抗癌药物提供一条新的途径。     

基于KEGG千针万线草光合代谢通路分析

千针万线草是一种药用植物，光合作用是植物最基本的代谢途径。本研究通过千针万线草种子转录组测序及功能注释，分析KEGG数据库注释功能并挖掘光合代谢通路基因。结果表明：比对到KEGG中的6 262条Unigenes被归类为6个类别，其中注释到代谢相关通路的Unigene数量最多，有3 051条，占比48.72%；同时，在代谢通路中千针万线草光合代谢通路涉及光合作用、光合作用-天线蛋白和碳同化3个代谢途径，其中光合作用途径涉及光系统Ⅰ反应中心亚基1个、5种光系统Ⅱ蛋白、1种细胞色素b6复合物、2种细胞色素b6-f亚基、1种铁氧化还原蛋白、1种铁氧还蛋白-NADP⁺还原酶、5种F-型H⁺-ATP酶亚基，光合作用-天线蛋白途径包括2种光系统Ⅱ结合蛋白，碳同化途径包括卡尔文循环、C4、景天酸代谢3个途径，分别涉及12种、12种、5种酶。本研究为开展光合作用分子机制研究奠定了基础。     

大豆HMGR基因家族的鉴定与表达分析

[目的]3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是大豆皂苷合成途径的关键酶之一。从全基因组水平鉴定大豆HMGR基因家族并进行生物信息学和表达模式分析,为研究和利用大豆HMGR基因家族生物学功能奠定基础。[方法]根据Pfam数据库中HMGR基因的保守结构域(编号PF00368),利用HMMER3.0、PFAM和SMART软件鉴定大豆基因组中的HMGR基因。采用ProtParam等软件对其基因和蛋白序列进行生物信息学分析。利用qRT-PCR方法分析GmHMGR基因在苗期根、茎、叶等不同组织中和籽粒不同发育时期的表达情况。[结果]大豆基因组中鉴定得到8个GmHMGR基因,分布于8条染色体上,编码80～608个氨基酸,相对分子质量介于8.23～64.96kD,理论等电点变化为4.89～8.24,二级结构中α螺旋和无规则卷曲所占比重较大,具有保守的基因结构和蛋白功能域。qRT-PCR分析表明,相比于其它GmHMGR基因,GmHMGR6在苗期根、茎、叶中高度表达,籽粒发育过程中GmHMGR3基因在开花后40d表达水平最高,开花后70d大豆的成熟籽粒中GmHMGR6的表达丰度最高。[结论]大豆基因组中含有8个HMGR基因,具有保守的功能结构域和基因结构。GmHMGR基因家族在苗期根、茎、叶及不同发育时期籽粒中具有多样化的组织表达模式和时空表达特征。     

杜仲2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶基因全长cDNA克隆与序列分析

2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶(MDS)基因曾被认为是调控植物2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径的一个关键节点。为解析杜仲MDS基因序列信息和预测基因功能,以叶片cDNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术分离出杜仲MDS基因的cDNA克隆,并通过一系列生物信息学方法进行序列分析。结果表明:EuMDS基因cDNA全长976 bp,5′端非编码区长119 bp,3′端非编码区长146bp,编码236个氨基酸。推导EuMDS氨基酸序列中包含转运肽序列(A1~A56)以及多个植物MDS蛋白保守的功能位点(A84,A87,A89,A121,A213,A217,A221,A223,A228)。推导EuMDS蛋白二级结构中α-螺旋占40.3%,β-折叠占13.6%,螺环结构占46.2%。推导EuMDS蛋白三级结构由3个亚单位组成,并相互围绕形成1个分子内腔。系统进化分析表明EuMDS蛋白与啤酒花MDS蛋白亲缘关系最为接近。预测所克隆的EuMDS基因在杜仲萜类生物合成中发挥重要功能。     

UV-B辐射胁迫对药用植物次生代谢产物的影响研究进展

UV-B辐射胁迫对地球生物的生命活动产生极大影响,其中药用植物次生代谢产物积累是对UV-B辐射胁迫的一种响应,其相关研究对提高药用植物次生代谢产物的产量、品质和合成效率,推动药用植物次生代谢产物的开发和利用,推进增加其药效技术的调控和创新具有参考意义。综述了UV-B辐射胁迫对药用植物次生代谢产物(萜类化合物、酚类化合物和含氮化合物)产量、质量及合成效率的影响,并深入地探讨了UV-B辐射胁迫对部分药用植物次生代谢产物的合成酶、合成途径及主要分子机制的影响。此外,还对UV-B辐射与其他因子复合作用作了概述。     

转录组测序法研究草珊瑚叶和根的基因差异表达

【目的】从基因表达的水平,初步分析草珊瑚叶和根之间次生代谢差异的分子机制,为二者之间临床疗效差异形成的分子机制分析提供信息。【方法】以福建省福州市的草珊瑚作为样品,采用Illumina HiSeq TM高通量测序技术测定草珊瑚叶和根的转录组,然后经过滤和Trinity组装,得到的unigenes再通过blast与Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、Kegg和GO进行比对注释,并对叶和根的基因差异表达进行分析,尤其是对KEGG代谢通路富集的差异基因进行分析。【结果】转录组测序结果共获得0.4亿多个clean reads,经Trinity组装后共得到508 271个unigenes,其平均长度为740 bp,最大长度为17.3 kb。基于blast分析,共有148 561个unigenes在七大功能注释数据库中得到成功注释,占总基因数的58.80%。在分析基因表达水平差异时,发现草珊瑚叶和根的共同基因有93 127个,叶和根的差异基因分别为36 327个和52 268个;同时还发现在29 732种不同表达的unigenes中,有12 511个上调基因和17 221个下调基因;代谢相关KEGG具有显著差异的通路有淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷类生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、光合生物的固碳作用、吞噬体、谷胱甘肽代谢、光合作用、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、倍半萜类和三萜类生物合成、卟啉和叶绿素代谢、氮素代谢、昼夜节律-植物、光合作用-天线蛋白、芪类、二芳基庚酸和姜酚生物合成、不饱和脂肪酸生物合成、柠檬烯和蒎烯降解、类胡萝卜素生物合成、二萜类生物合成、类黄酮生物合成、脂肪酸延伸等。其中与药效密切相关的次生代谢通路苯丙烷类、倍半萜类和三萜类、二萜类、类黄酮类生物合成等途径分别有193个、82个、40个、35个差异表达基因,而上调倍半萜合酶、ent-kaur-16-烯合酶、黄酮醇合酶/黄烷酮3-羟化酶等基因和下调8-羟基香叶醇脱氢酶、vinorine合酶、角鲨烯合酶等关键酶基因差异显著。【结论】草珊瑚叶和根中苯丙烷类、倍半萜类和三萜类、二萜类、类黄酮次生代谢途径的相关基因差异最为显著,其中差异显著的关键酶基因可为分析其叶和根之间次生代谢差异的分子机制提供重要信息。     

NtCPS2基因对顺-冷杉醇与赤霉素合成代谢途径的影响

为探讨顺-冷杉醇合成基因NtCPS2对萜类代谢途径的影响,利用基因编辑技术CRISPR/Cas 9编辑烟草顺-冷杉醇合成基因NtCPS2,并筛选出纯合突变植株,命名为‘8306’编辑系;比较‘8306’编辑系(T_2-26、T_2-45、T_2-48)与野生型(WT)在顺-冷杉醇、赤霉素含量及合成关键基因的生物信息学方面的差异。结果表明:‘8306’编辑系(T_2-26、T_2-45、T_2-48)顺-冷杉醇含量平均减少86.20%,赤霉素含量平均增加27.05%;顺-冷杉醇合成途径中的关键基因表达量显著减小,赤霉素合成途径中正调控关键基因GA20ox表达量显著增加,负调控关键基因GA2ox表达量显著减小,并且GGPP(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸)合成的关键基因DXR表达量增加。NtCPS2基因不仅影响赖百当类二萜代谢途径,有效降低顺-冷杉醇的含量,并且影响赤霉素萜类代谢,增加赤霉素的含量。     

胆固醇7α-羟化酶基因研究进展

胆固醇7-羟化酶（cholesterol 7-hydroxylase,CYP7A1）是胆汁酸经典合成途径中的限速酶,对维持机体胆固醇代谢平衡起关键作用。目前已知CYP7A1基因的表达受包括该基因自身的多态性在内的多种因子调控。CYP7A1代谢途径作为脂类代谢通路的重要一部分,其活性发生改变后可能会引起与脂类代谢紊乱有关的胆结石、胆囊癌和心血管疾病等。就有关CYP7A1基因的最新研究进展进行了较系统的综述。图1参53     

长春花萜类吲哚生物碱的分子生物学与代谢工程研究

长春花不仅是重要抗癌药物,也是长春碱与长春新碱的唯一来源,并且还包含有其他多种药用成分。近年来,长春花次生代谢得到了广泛的研究,但仍有许多不明之处。该研究对长春花的研究进展进行了综述,详细阐述了长春花萜类吲哚生物碱合成的2大途径(莽草酸途径和萜类途径),介绍了该途径中已克隆的部分基因及相关酶,总结了近年来长春花TIAs研究中的代谢工程策略,以期为长春花萜类吲哚生物碱的后续研究提供参考依据。     

基于iTRAQ技术的采后乙烯利和1-甲基环丙烯处理对茭白线粒体蛋白质表达谱的影响

利用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)标记结合二维液相色谱-串联质谱(2D-LC-MS/MS)技术,探索乙烯利(ETH)和1-甲基环丙烯(1-MCP)处理对茭白采后贮藏期间线粒体蛋白质表达谱的影响。共鉴定到1 908个特征肽段≥2的可信蛋白质,与贮藏0 d相比,对照、ETH和1-MCP处理的茭白贮藏3 d和6 d共有315个蛋白质具有2. 0倍以上显著差异(P0. 05)。基因本体(GO)分子功能分析和KEGG通路分析结果显示,茭白采后贮藏3d,代谢途径、次生代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物质生物合成、碳代谢、光合作用中的碳固定、2-酮酸代谢、精氨酸生物合成、α-亚麻酸代谢、二羧酸代谢相关蛋白质显著富集;贮藏6 d,光合作用中的碳固定、α-亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径减弱,丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解和磷酸戊糖途径相关蛋白质显著富集。ETH处理后贮藏3 d,氧化磷酸化以及甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢相关蛋白质显著富集;贮藏6 d,丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、磷酸戊糖途径以及苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成代谢途径相关蛋白质显著富集。1-MCP处理后贮藏3 d,三羧酸循环、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解途径相关蛋白质显著富集;贮藏6 d,磷酸戊糖途径、C5支链二元酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢途径相关蛋白质显著富集。以上结果表明,代谢途径、次生代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物质生物合成、碳代谢、光合作用中的碳固定、2-酮酸代谢、精氨酸生物合成、α-亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径等可能与茭白采后衰老有关,三羧酸循环、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、C5支链酸代谢及相关氨基酸代谢途径可能在茭白采后衰老中发挥重要作用。     

药用植物蛋白质组学的研究进展

药用植物蛋白质组学是药用植物功能基因挖掘、功能化合物代谢通路及功能机制等研究的有效工具。为药用植物功能基因组的深入研究提供参考,从药用植物活性物质代谢通路及治疗作用机制研究2方面对药用植物蛋白质组学的研究进展进行综述,并对其未来发展趋势进行展望。     

夜香树DXS2基因的克隆与表达分析

[目的]克隆夜香树(Cestrum nocturnumL.)萜类香气物质代谢途径关键限速酶DXS2(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 2)基因全长cDNA,并对该基因进行生物信息学分析,检测该基因在开花不同时间及叶片中表达量的动态变化。[方法]采用RTPCR与RACE相结合的技术,获得夜香树DXS2的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析,qRT-PCR分析其在盛花期不同时间花和叶中的表达量。[结果]获得CnDXS2基因全长序列2 370 bp,其中ORF 2 145 bp,编码714个氨基酸,含DXP-synthase-N、TPP-PYRDXS-TK-like和Transketolase-C等保守结构域,与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis L.)DXS2蛋白同源性达93%,推测属于Ⅱ类DXS蛋白;qRT-PCR分析表明,CnDXS2在叶中表达量总体高于花,花中22∶00表达量最高,14∶00表达量最低,具有节律性。[结论]萜类MEP代谢途径基因CnDXS2的克隆与表达分析为从分子方面揭示CnDXS2基因在萜类香气代谢途径中的功能提供了依据,有助于夜香树花香萜类代谢途径基因功能和花香基因工程的研究。     

菊叶香藜精油合成关键HMGR基因的生物信息学分析

采用生物信息学的方法分析菊叶香藜3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(Ds HMGR)基因所编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位、保守结构域、二级结构、三级结构,并进行多条氨基酸序列比对和系统进化树构建。结果表明,Ds HMGR基因包含一段1 725 bp的开放阅读框,编码574个氨基酸,非极性氨基酸为主要氨基酸,等电点为7.46,为不稳定蛋白质,编码蛋白质中不含有信号肽,在N端具有2个疏水区域,含有2个跨膜结构域,Ds HMGR蛋白定位到内质网上,在C端和连接区具有较高保守性,在N端保守性较低,含有HMGR蛋白特有的4个保守活性位点,二级结构主要为α-螺旋,三级结构预测显示Ds HMGR蛋白具有N、L和S 3个催化活性中心结构域。HMGR蛋白进化分析中,菊叶香藜与藜科植物聚为一支,遗传距离较近。